一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法与流程

一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小rna的方法
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小rna的方法。


背景技术：

2.癌症是导致人类死亡的最大病因之一，全世界每年新增超过1000万例癌症病例。目前医学上对恶性肿瘤的诊断在很大程度上仍依赖于组织切片的形态特征，这种具有侵入性的诊断方法难以在早期得到准确的结果。这促使肿瘤诊断从解剖病理学向分子病理学转变，即利用某种肿瘤标志物来进行诊断。
3.微小rna(mirna)是一类小的、内源性的非编码单链rna分子，长度大约为18～25个碱基对，其序列具有高度的保守性。mirna最早于1993年在秀丽隐杆线虫中发现(lin
‑
4)，随后在植物、动物和一些病毒中相继发现新的mirna。迄今为止已经在自然界发现超过3万种mirna，其中从人类基因中发现的超过2500种。mirna存在于各种类型的人体细胞、体液环境中，能够靶向作用于约60％的哺乳动物基因，通过与信使rna(mrna)的互补配对来调控基因在转录后的表达，维持细胞和组织的生理稳态。相应的，不同mirna的异常表达与多种恶性肿瘤的生长情况高度相关，而外周血中的循环mirna能在极端温度、ph甚至rna酶存在的情况下长期保持稳定，这使得mirna可以作为理想的非侵入性肿瘤诊断标志物，成为近年来研究的热点。
4.尽管mirna作为生物标志物具有非常多的优点，但链长短、总rna样品中丰度低，家族成员之间的序列同源性使mirna的定性定量分析变得较为困难。用于mirna分析的传统方法主要是northern印迹法、实时定量聚合酶链式反应(qrt
‑
pcr)和微阵列分析法。这些经典的传统方法虽然能够解决问题，但都存在着一些缺陷：northern印迹法所需样品的总rna量大(5～25mg)，步骤繁多，分析过程冗长，使用的化学试剂有放射性或致癌的风险；qrt
‑
pcr是一种非等温扩增方法，耗时耗力，分析成本昂贵，有非特异性扩增的干扰存在；微阵列分析法对高序列同源性样品的选择性较差，容易产生交叉杂交，且高通量分析的代价是成本的大幅提高。
5.为了克服传统方法的这些不足，国内外的研究者开发了诸如杂交链式反应(hcr)、滚环扩增(rca)等信号放大策略。这些新的扩增方法需要设计复杂的检测探针来实现等温扩增，减少了核酸酶的使用，整个过程相较于传统的pcr而言更为精简。但这些信号放大策略面临的问题是一些非特异性产物的存在，这会导致检测到的背景信号较大。
6.因此设计合适的探针序列，寻找简单易行的信号放大策略并结合高灵敏度的信号检测方法对高同源性的mirna特异性地检测将是一项富有意义及挑战性的工作，对该领域的深入研究能对恶性肿瘤早期非侵入性诊断的发展做出贡献。


技术实现要素：

7.鉴于此，本发明的目的是提供一种基于催化发夹组装扩增反应(cha)和电感耦合等离子体质谱(icp
‑
ms)检测mirna的方法，实现对mirna分子高灵敏度、高特异性的检测。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.本发明公开了一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小rna的方法，包括以下步骤：
10.1)制备用稀土金属标记的dna探针hrp，使铥元素标记到hrp上；
11.2)混合dna探针hcp和清洗过的磁珠，使dna探针hcp修饰到磁珠上；
12.3)将铥元素标记的hrp、修饰有hcp的磁珠和待测微小rna混合，使hrp与hcp完成杂交，铥元素标记的hrp被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增；
13.4)清洗步骤2)所得磁珠后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使hrp
‑
hcp双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于硝酸溶液中。
14.5)使用电感耦合等离子体质谱测定硝酸溶液中铥元素的信号强度。
15.作为进一步地改进，本发明的步骤1)的具体步骤如下：
16.1)将一端修饰有巯基的发夹形dna探针hrp与三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐在缓冲液a中混合，35～40℃振荡条件下反应0.5～1h，还原巯基耦联产生的二硫键；
17.2)将双功能络合剂1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺加入步骤1)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应2h以上，马来酰亚胺与巯基反应，使1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺修饰到hrp上；
18.3)使用nap
‑
5体积排阻柱对步骤2)反应所得溶液进行纯化，除去过量的三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐、1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺修饰的hrp水溶液，通过冷冻干燥得到其干粉；
19.4)将步骤3)得到的干粉与氯化铥在缓冲液b中混合，35～40℃振荡条件下反应1h以上，使三价铥离子络合到1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺的氮杂环中；
20.5)将乙二胺四乙酸加入步骤4)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应15～30min，使过量的铥离子被络合掉；
21.6)使用nap
‑
5体积排阻柱对步骤5)反应所得溶液进行纯化，除去过量乙二胺四乙酸
‑
铥的络合物和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到铥元素标记的hrp水溶液。
22.作为进一步地改进，本发明所述的缓冲液a为0.5mol
·
l
‑1ph 6.8的乙酸铵，缓冲液b为0.5mol
·
l
‑1ph 5.8的乙酸铵，两种缓冲液的ph均由冰乙酸调节得到。
23.作为进一步地改进，本发明所述的步骤1)中，dna探针与三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐的摩尔比为1:10～1:15；步骤2)中，1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺的物质的量是dna探针的60～80倍。
24.作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)中，氯化铥的物质的量是dna探针的15～20倍；步骤5)中，乙二胺四乙酸的物质的量是dna探针的15～20倍。
25.作为进一步地改进，本发明权利要求1步骤2)的具体步骤为：使用缓冲液c清洗链
霉亲和素磁珠2～3次后，根据链霉亲和素
‑
生物素的特异识别反应，在缓冲液c中混合一端修饰有生物素的发夹形dna探针hcp和清洗过的磁珠，20～25℃振荡条件下反应0.5～1h，再用缓冲液c清洗磁珠3～4次，使dna探针hcp修饰到磁珠上；dna探针与链霉亲和素磁珠的比例大于2nmol：1mg。
26.作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)的具体步骤为将铥元素标记的hrp、修饰有hcp的磁珠和待测微小rna在0.8～1倍浓度的缓冲液d中混合，微小rna先与hrp杂交，打开hrp的发夹结构，在尖端诱导效应下使hrp与hcp完成杂交，同时游离出微小rna，引发新的hrp
‑
hcp杂交反应，最终使铥元素标记的hrp被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增；体系反应条件为35～40℃下振荡，反应时间为1～1.5h。
27.作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)的具体步骤为：使用缓冲液d清洗步骤2)所得磁珠3～4次后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使hrp
‑
hcp双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于1％～2％的硝酸溶液中；加热的温度为90～95℃，时间为5～10min，最终用1％～2％的硝酸溶液定容至1ml。
28.作为进一步地改进，本发明所述的缓冲液c包含5mmol
·
l
‑1ph 7.5tris
‑
盐酸、0.5mmol
·
l
‑1乙二胺四乙酸、1mol
·
l
‑1氯化钠，缓冲液d包含1
×
pbs，包含137mmol
·
l
‑1氯化钠、1.8mmol
·
l
‑1磷酸二氢钾、8.1mmol
·
l
‑1磷酸氢二钠、2.7mmol
·
l
‑1氯化钾。
29.作为进一步地改进，本发明使用电感耦合等离子体质谱测定1ml硝酸溶液中铥元素的信号强度；电感耦合等离子体质谱的技术参数设置如下：射频功率1300w，等离子体气流速17.0l
·
min
‑1，雾化气流速1.0l
·
min
‑1，辅助气流速1.2l
·
min
‑1，采用标准模式进行检测。
30.如无特殊说明，本发明中水以及配制缓冲液所使用的水均为焦碳酸二乙酯处理水，可有效抑制rna酶活性。
31.本发明的有益效果为：
32.1、本发明提供了一种稀土金属标记dna探针的方法，该合成方法步骤简单，条件温和，纯化方便，全部完成所需要的时间较短；
33.2、电感耦合等离子体质谱在进行金属元素分析时具有很高的灵敏度和很好的检出限，本发明以稀土金属元素作为dna探针的标记物，使用电感耦合等离子体质谱作为检测器来完成信号的采集，能够对溶液中低至100fmol量的微小rna实现检出；通常环境中几乎不存在稀土金属元素，这样可以避免由污染带来的干扰信号；
34.3、本发明使用链霉亲和素磁珠作为固定相来捕获dna探针，分离操作简单，效率较高；
35.4、本发明使用的催化发夹组装扩增是一种等温、无酶的扩增方法，简化了扩增反应体系，缩短了扩增反应时间(小于2h)，不容易受到来自外界环境干扰(如温度、核酸污染等)的影响。
附图说明
36.图1为本发明检测mirna分子的原理示意图；
37.图2为稀土金属标记dna探针过程中涉及到的反应方程；
38.图3为本方法检测mirna
‑
141的标准工作曲线；
39.图4为方法特异性考察结果图。
40.图4中，i代表当前样品的信号强度值，i
t
代表mirna
‑
141的信号强度值，i0代表空白对照的信号强度值。
具体实施方式
41.本发明公开了一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小rna的方法，图1为本发明检测mirna分子的原理示意图，包括以下步骤：
42.1)制备用稀土金属标记的dna探针hrp，使铥元素标记到hrp上；
43.2)混合dna探针hcp和清洗过的磁珠，使dna探针hcp修饰到磁珠上；
44.3)将铥元素标记的hrp、修饰有hcp的磁珠和待测微小rna混合，使hrp与hcp完成杂交，铥元素标记的hrp被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增；
45.4)清洗所述步骤2)所得磁珠后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使hrp
‑
hcp双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于硝酸溶液中。
46.5)使用电感耦合等离子体质谱测定硝酸溶液中铥元素的信号强度。
47.图2为稀土金属标记dna探针过程中涉及到的反应方程；制备用稀土金属标记的dna探针hrp，使铥元素标记到hrp上的具体步骤为：
48.1)将一端修饰有巯基的发夹形dna探针hrp与三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐在缓冲液a中混合，35～40℃振荡条件下反应0.5～1h，还原巯基耦联产生的二硫键；缓冲液a为0.5mol
·
l
‑1ph 6.8的乙酸铵；
49.2)将双功能络合剂1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺加入步骤1)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应2h以上，马来酰亚胺与巯基反应，使1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺修饰到hrp上；dna探针与三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐的摩尔比为1:10～1:15；1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺的物质的量是dna探针的60～80倍；
50.3)使用nap
‑
5体积排阻柱对步骤2)反应所得溶液进行纯化，除去过量的三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐、1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺修饰的hrp水溶液，通过冷冻干燥得到其干粉；
51.4)将步骤3)得到的干粉与氯化铥在缓冲液b中混合，35～40℃振荡条件下反应1h以上，使三价铥离子络合到1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺的氮杂环中，缓冲液b为0.5mol
·
l
‑1ph 5.8的乙酸铵，两种缓冲液的ph均由冰乙酸调节得到；氯化铥的物质的量是dna探针的15～20倍；
52.5)将乙二胺四乙酸加入步骤4)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应15～30min，使过量的铥离子被络合掉；乙二胺四乙酸的物质的量是dna探针的15～20倍；
53.6)使用nap
‑
5体积排阻柱对步骤5)反应所得溶液进行纯化，除去过量乙二胺四乙酸
‑
铥的络合物和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到铥元素标记的hrp水溶液。
54.混合dna探针hcp和清洗过的磁珠，使dna探针hcp修饰到磁珠上；的具体步骤为：使用缓冲液c清洗链霉亲和素磁珠2～3次后，根据链霉亲和素
‑
生物素的特异识别反应，在缓冲液c中混合5’端修饰有生物素的发夹形dna探针hcp和清洗过的磁珠，20～25℃振荡条件
下反应0.5～1h，再用缓冲液c清洗磁珠3～4次，使dna探针hcp修饰到磁珠上；dna探针与链霉亲和素磁珠的比例大于2nmol：1mg；缓冲液c包含5mmol
·
l
‑1ph 7.5tris
‑
盐酸、0.5mmol
·
l
‑1乙二胺四乙酸、1mol
·
l
‑1氯化钠；
55.将铥元素标记的hrp、修饰有hcp的磁珠和待测微小rna混合，使hrp与hcp完成杂交，铥元素标记的hrp被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增的具体步骤为：将铥元素标记的hrp、修饰有hcp的磁珠和待测微小rna在0.8～1倍浓度的缓冲液d中混合，微小rna先与hrp杂交，打开hrp的发夹结构，在尖端诱导效应下使hrp与hcp完成杂交，同时游离出微小rna，引发新的hrp
‑
hcp杂交反应，最终使铥元素标记的hrp被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增；体系反应条件为35～40℃下振荡，反应时间为1～1.5h。缓冲液d包含1
×
pbs，包含137mmol
·
l
‑1氯化钠、1.8mmol
·
l
‑1磷酸二氢钾、8.1mmol
·
l
‑1磷酸氢二钠、2.7mmol
·
l
‑1氯化钾。
56.清洗所得磁珠后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使hrp
‑
hcp双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于硝酸溶液中的具体步骤为：使用缓冲液d清洗步骤2)所得磁珠3～4次后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使hrp
‑
hcp双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于1％～2％的硝酸溶液中；加热的温度为90～95℃，时间为5～10min，最终用1％～2％的硝酸溶液定容至1ml，并使用电感耦合等离子体质谱测定硝酸溶液中铥元素的信号强度。
57.本发明使用电感耦合等离子体质谱测定1ml硝酸溶液中铥元素的信号强度；电感耦合等离子体质谱的技术参数设置如下：射频功率1300w，等离子体气流速17.0l
·
min
‑1，雾化气流速1.0l
·
min
‑1，辅助气流速1.2l
·
min
‑1，采用标准模式进行检测。
58.下面通过具体实例对本发明的实施方式作进一步说明：
59.实施例1：对mirna
‑
141分子的定量检测
60.mirna
‑
141是多种癌症的标志物之一，根据其碱基序列，设计出相应的dna探针分子hrp、hcp，如表1所示。
61.表1 mir
‑
141、hrp、hcp分子的序列及修饰信息
[0062][0063]
①
将稀土金属元素铥标记到dna探针hrp上，利用电喷雾高分辨飞行时间质谱对产物进行定性分析验证。另取15μl产物，用1％～2％的硝酸溶液稀释至3ml，icp
‑
ms测定其中铥元素的信号强度，根据氯化铥标准溶液的外标曲线对产物进行定量。铥标记的hrp水溶液在4℃保存。
[0064]
②
将dna探针hcp固定到链霉亲和素磁珠的表面，具体操作如下：
[0065]
1)加入缓冲液c悬浮链霉亲和素磁珠并振荡清洗，磁铁固定磁珠后取出上清液，重复3～4次，最终悬浮于2倍浓度的缓冲液c中；
[0066]
2)将dna探针hcp的水溶液在90～95℃加热5min，之后以3～5℃/min的速率降温至
20～25℃，使hcp形成发夹形结构；
[0067]
3)按照大于2nmol dna：1mg磁珠的比例向所得磁珠悬浮液中加入经过加热退火处理的hcp水溶液，再补加水至缓冲液c的浓度恢复到1倍量，混匀后在20～25℃振荡条件下反应0.5～1h；
[0068]
4)磁铁固定磁珠后取出反应液，按照1)的操作分别用缓冲液c和缓冲液d各清洗磁珠两次，最终悬浮于缓冲液d中得到hcp修饰的磁珠，在4℃保存。
[0069]
③
完成催化发夹组装扩增反应，具体操作如下：
[0070]
1)将铥元素标记的hrp水溶液在90～95℃加热5min，之后以3～5℃/min的速率降温至20～25℃，使hrp形成发夹形结构；
[0071]
2)以84μl缓冲液d为溶剂配制反应液，包含3μlhcp修饰的磁珠和3μl铥元素标记的hrp。加入10μlmirna
‑
141使体系总体积为100μl，此时体系中缓冲液d的浓度约为0.8
×
，mirna
‑
141在体系中的总量为0.1pmol、0.2pmol、0.5pmol、1pmol、2pmol(空白用水代替)；
[0072]
3)将整个体系在35～40℃条件下反应1～1.5h，保持不间断的振荡，使hrp与hcp两种dna探针在mirna
‑
141的辅助下完成杂交，铥元素标记的hrp不断地被固定到磁珠上。
[0073]
④
扩增反应完成后，磁铁固定磁珠并取出反应液，用缓冲液d清洗磁珠3～4次，重新加入100μl分子生物级无酶水悬浮磁珠，90～95℃加热5～10min使hrp
‑
hcp双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，用1％～2％的硝酸溶液稀释至1ml。
[0074]
⑤
利用icp
‑
ms依次测定各平行实验组所得硝酸溶液中铥元素的信号强度，与对应的mirna
‑
141终浓度值组成数据点，作出信号强度—浓度图即得到本方法的标准工作曲线。图3为本方法检测mirna
‑
141的标准工作曲线；本方法的标准曲线在0.1pmol～2pmol呈现良好的线性，线性相关系数r2为0.9784，由3倍空白信号的标准偏差/斜率求得检测限为103fmol。对于未知浓度的mirna
‑
141溶液样品，按照
③
、
④
所述的步骤处理后由icp
‑
ms测出铥元素的信号强度，根据本方法的标准工作曲线可以计算得到其浓度值，实现定量分析。
[0075]
实施例2：方法特异性验证
[0076]
mirna
‑
141属于mirna200家族，该家族中的mirna
‑
429、mirna
‑
200a、mirna
‑
200b、mirna
‑
200c与mirna
‑
141均只有几个碱基的差异。本发明选用这几个同族的mirna分子进行平行对照实验来验证所构建方法对mirna
‑
141检测的特异性。mirna200家族中各个成员的碱基序列如表2所示。按照实施例1中的方法对表2中5种mirna分子(加入量为2pmol)及空白进行检测，得到相应的铥元素质谱响应值。各数据去除空白响应部分后，以mirna
‑
141的响应值为参照归一化，所得结果如图4所示，图4为方法特异性考察结果图。除mirna
‑
141外的其余四种同族mirna的相对响应值均低于15％，表明了该方法优良的选择性。
[0077]
表2 mirna200家族各成员的序列信息
[0078][0079]
实施例3：模拟真实样品检测
[0080]
向10μl 10％胎牛血清中分别加入100fmol、500fmol、1000fmol的mirna
‑
141标准样品，使用实施例1描述的操作步骤对这三种模拟真实样品中的mirna含量进行检测。根据实施例1中绘制的标准工作曲线，将icp
‑
ms得到的质谱响应值转换为mirna
‑
141的含量，结果如表3所示。
[0081]
表3对胎牛血清样品中mirna
‑
141含量测定的结果
[0082][0083]
*三次平行试验的平均值
±
标准偏差
[0084]
以上结果表明，使用本方法对加标的胎牛血清样品进行检测，能得到良好的回收率，证明了本发明在真实生物样品检测中的应用能力，有望在临床上实现对恶性肿瘤进行早期的非侵入性诊断。
[0085]
综上所述，本发明通过目标mirna分子构建了一对用于催化发夹组装扩增的发夹形dna探针。在等温、无酶催化的温和条件下，利用样品中少量的目标mirna循环扩增出大量带有稀土金属标记的探针分子对并固定于链霉亲和素磁珠表面。经过简单的磁分离后带有标记的探针即被热洗脱，由icp
‑
ms测得放大的信号。无酶的扩增在减少了非特异性杂交的同时保证了扩增的效率，磁珠的使用大大提高了分离富集的简便性，使得整个分析过程易于操作，icp
‑
ms对金属元素的高灵敏响应也大大提高了该方法的检测灵敏度。值得关注的是，icp
‑
ms是一种高通量的元素分析手段，若根据不同mirna分子设计不同序列的发夹形dna探针对并引入不同的稀土元素标记，可以实现对多种mirna的同时定量检测。结合对实际样品的检测能力，该方法可以在临床上被拓展为一种高通量的mirna检测手段，对多种疾病实现更为全面准确的筛查诊断。
[0086]
尽管结合优选实施方案具体展示和介绍了本发明，但具体实现该技术方案方法和途径还有很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，但所属领域的技术人员应该明白，在不脱离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围内，在形式上和细节上可以对本发明做出各种变化，均为本发明的保护范围。