集成工作流中低拷贝数核酸的增强的检测的制作方法

集成工作流中低拷贝数核酸的增强的检测
发明领域
1.本发明涉及在自动化或半自动化平台上的集成工作流中检测低拷贝数核酸的方法和策略。本发明的方法打开了扩展已经开发的自动化工作流的范围的可能性，以使它们甚至能够处理非常稀释的样品，例如体液，包括液体活检。
2.发明背景
3.在监测患者的生理和/或病理状态中，液体活检研究引起了很多关注。这主要是因为它提供了非侵入性采样，从而潜在地允许早期诊断和频繁监测。一个很好的例子是在癌症的早期阶段检测体液中的循环肿瘤标志物(ctdna)。但是，由于它们的负载对每个样品量而言非常低，因此其有效检测非常具有挑战性，并且不仅需要高度灵敏和稳健的诊断测定，而且还需要具有处理大样品量的能力。
4.当前存在使用诊断流体盒来提供稳健的遗传标志物测试的几种出色的高度灵敏的平台。这种系统的优点之一是其紧凑的手持式设计，其极大地促进了易用性和存储方面的考虑。鉴于尺寸最小化是即时医疗(poc)设备的普遍趋势，并且其中许多设备使用基于二氧化硅的boom提取技术，该技术需要大量试剂，包括例如促溶缓冲液，这些设备面临的普遍问题是用于接受必要的样品量以适合检测低拷贝数核酸的有限的空间。
5.因此，即使更灵敏的化学和检测技术的不断发展，但仍极具挑战性的是基于当前现有的集成工作流和使用手持设备开发稳健的液体活检测定而无需改变平台设计和/或无需破坏现有测定的易用性和紧凑性。这是因为在标准的自动化和半自动化的流体工作流中低拷贝数核酸的检测似乎需要比通常的样品更高的输入量，并且要保持最小的给定设备提取效率和样品分配考虑所固有的材料损失。
6.为了解决这些问题，我们已经开发了一种集成方法：
7.(i)在存在二氧化硅固体支持物(甚至填充到提取室的体积中的一种)的情况下，在转移二氧化硅提取的核酸到集成工作流的下游(，这不可避免地产生死体积并因此也会丢失或稀释珍贵的低拷贝数核酸)之前，优选通过压力将核酸预扩增方案特别定位在dna提取位置中；优选在之前
8.(ii)使用至少基于离子交换并且优选还基于亲和力的固相预捕获技术，优选是基于羟基磷灰石(hap)的核酸预捕获技术。
9.此外，关于(i)，由于大多数集成诊断装置要求将纯化的核酸样品分布在多个反应室上，因此应注意，当处理非常低负载的例如ctdna时，所述分布甚至进一步降低了检测选择的低拷贝核酸靶标的可能性，并因此降低了测定的灵敏度。预扩增(定义为在将提取的核酸分配到另外的一个或多个扩增室(在其中通常进行检测)之前扩增提取的核酸)提供了靶向的dna的指数级增长。对于低拷贝数靶标，这是非常期望的，因为它允许通过消除稀释因子并使样品远离泊松分布统计信息来提高下游分析的灵敏度。它还提供了样品的简化，其中靶标相对于未扩增的基因组材料被扩增。通过降低非特异性扩增的可能性及其副作用，这可以显著降低下游测定的选择性压力。
10.由于本领域已认识到上述优点，因此在下游分析(例如ngs和qpcr)之前进行低拷
贝数核酸的靶向预扩增在台式分析方案中通常是已知的，并且在核酸提取和纯化后进行。从后者得出的结论是，在现有技术中，在提取和纯化过程与(预)扩增过程之间存在严格的时空区分。这同样适用于基于工作流盒的自动化系统。例如，biofire的filmarray系统(biom
é
rieux)被设计为提供台式纯化和提取的dna的预扩增，然后将预扩增的遗传材料分配到许多不同的pcr室中。据我们所知，现有的自动化或半自动化(即部分台式)工作流通过接受台式预扩增的材料或通过从系统设计的开始就已经配备了额外的预扩增室(就像上面提到的实例一样)克服了稀释问题。然而，大多数自动化或半自动化的流体poc设备不包括这样的专用上游预扩增空间，并且将经常需要被重新设计或重建以获取上游预扩增功能。但是，现有系统的重新设计可能需要花费几年的测试和大量的投资，而实际上许多分子诊断公司都不会承诺这样做。这是因为在使用半自动或全自动分子诊断系统时，预扩增方案的实现远非简单易行。当在一次性盒中进行分子分析时，为上游预扩增反应寻找另外的腔室的位置或集成另外的腔室的机会有限。然而，许多这样的盒已经含有填充有充满二氧化硅固体支持物并且经常还具有一些温度控制功能的提取室。然而，已知在这种二氧化硅填充物的存在下进行核酸热循环是低效率的，遭受抑制并产生广泛的非特异性产物。我们通过提供在提取室中二氧化硅捕获的dna的体积局部化(特别是通过使用压力)的pcr扩增方案方法(其允许检测集成盒中的低拷贝数靶标而无需修改盒的设计)克服了这些问题。
11.我们观察到，对于大体积和/或稀释的液体样品，如尿液，通过在二氧化硅上进行预扩增的步骤前进行预捕获到羟基磷灰石(hap)固体支持物的步骤进一步增强了的效果。尽管hap似乎是最合适的预捕获技术，但从理论上讲，其他离子交换以及优选基于亲和力的预捕获策略也可能适用于本文呈现的集成工作流中的集成。geae sephacel是一种潜在的有前途的候选物。只要满足以下考虑，也可以设想其他技术。首先，应尽可能限制缓冲液(例如平衡缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液等)的量及其所需的体积，因为在集成系统(尤其是使用盒的集成系统)中扩大样品量时，缓冲液存储空间是一个主要挑战。第三，预捕获技术的dna提取效率应接近100％，特别是如果短ctdna是优选靶标时。最后，洗脱体积应尽可能小，因为这将需要较少的促溶结合缓冲液用于进一步的boom提取。最后，洗脱产物应与boom提取技术兼容，因此不影响二氧化硅
‑
dna的结合机制。
12.由于对能够处理大样品体积(即，≥10ml)并且需要很少或不需要额外的结合剂的核酸分离机制的高度需求，因此我们已经创建了满足上文指定的标准的快速的基于羟基磷灰石的核酸特异性预捕获方案。因此，本文提出的基于hap的策略与集成工作流兼容，并且可以被轻松地引入到手持式poc设备的样品接收部分。特别地，该方案不仅提供从10ml或更多的生物流体(如血浆)中有效分离dna，从而导致n倍的体积减少，而且同时导致通过去除大量蛋白质的样品预清除和简化。
13.基于hap的核酸提取是一种使用离子交换和亲和原理的固相提取(spe)方法。从方法上讲，它类似于阴离子交换色谱。之前在科学文献中已经描述了多种基于hap的dna提取设计，它们针对的是各种样品类型。其中一些包括：
14.·
s.yu等人/j.chromatogr.a 1183(2008)29
–
3；
15.·
j.mater.chem.b,2014,2,6953
–
6966；
16.·
colman,m.j.byers,s.b.primrose,and a.lyons:rapid purification of plasmid dnas by hydroxyapatite chromatography；
17.·
p.gagnon,p.ng,j.zhen,c.aberin,j.he,h.mekosh,l.cummings,s.zaidi,r.richieri,a ceramic hydroxyapatite based purification platform；
18.·
purdy kj,embley tm,takii s,nedwell db.rapid extraction of dna and rrna from sediments by a novel hydroxyapatite spin
‑
column method.applied and environmental microbiology.1996；62(10):3905
‑
3907。
19.这些spe和对于我们的基于hap的方法的其他已知的spe在高盐或高磷酸盐环境中洗脱dna，导致与进一步的下游分子分析不兼容的产品。
20.从生物样品的基于羟基磷灰石的核酸分离目前大多数是通过液相色谱柱基质或使用旋转柱来完成。大多数方法通过在中性ph(通常约为ph 7.0)下提供阈值浓度的磷酸钾或钠或其他盐使得核酸能够与hap结合。通过进一步增加磷酸盐离子的浓度(高至500nm)，从hap基质洗脱dna。尽管500nm的磷酸盐提供了最佳的洗脱条件，但如此高的浓度由于其抑制作用而与进一步的下游分析不兼容。经常出现的情况是，通过降低洗脱过程中的磷酸盐浓度，在洗脱效率和后续dna分析的性能之间做出折衷。
21.可能由于洗脱产物中的此高盐含量，基于hap的富集法未用于集成工作流中。据我们所知，到目前为止，至少尚未开发出基于pcr分析的集成工作流或盒，这可能是因为已知磷酸盐对pcr具有抑制作用。然而，在本发明的设置中，我们证实，hap富集核酸的基于二氧化硅的提取，然后在二氧化硅固体支持物上进行压力控制的预扩增方案，在全自动poc设备中的低拷贝数核酸靶标检测方面产生了稳健的改善。下文呈现了该结果的证实和本发明的其他优点。
22.发明概述
23.在所附的独立权利要求中定义了本发明。优选的实施方案在从属权利要求中定义。特别地，本发明涉及一种在自动化系统中检测低拷贝数核酸的方法，所述系统包括至少部分填充有二氧化硅固体支持物的提取室以及扩增室，所述方法包括：
24.‑
向自动化系统的提取室提供包含低拷贝数核酸的样品，所述提取室包括用于dna吸附的二氧化硅表面并且与加热器相邻；
25.‑
将核酸吸附至二氧化硅表面；
26.‑
在二氧化硅表面的存在下进行核酸的预扩增；
27.‑
从二氧化硅表面洗脱预扩增的核酸；
28.‑
将预扩增的核酸运输至自动化系统的扩增室，所述扩增室与提取室流体连接；
29.‑
在所述扩增室中扩增预扩增的核酸；
30.其中自动化系统被配置为
31.将预扩增反应仅定位在二氧化硅表面的占据提取室的与加热器相邻的区域的部分，并且
32.在提取室内的二氧化硅表面的剩余部分保持基本上没有预扩增反应。
33.在优选实施方案中，通过压力控制来完成定位。特别地，预扩增在压力控制下进行，所述压力控制被配置为将预扩增反应定位于位于提取室的与加热器相邻的区域中的二氧化硅部分，使得提取室的另一区域不与所述加热器相邻并填充二氧化硅的不同部分，其保持没有预扩增反应。最通常地，提取室的内部空间将至少部分地填充(可能完全填充)氧化硅基质，该二氧化硅基质为核酸提取提供了二氧化硅表面。可能将所述二氧化硅基质作
为膜或作为任何几何形状的块提供，可能对应于提取室的内部空间的形状。二氧化硅膜是本领域众所周知的。块可以由具有不同集成水平的硅质纤维或珠粒制成。块可完全或部分填充提取室的内部容积。在后一种情况下，二氧化硅基质可以以任何预成型的几何形状的块的形式提供，该块装配在提取室的内部空间中，从而保留在其中。这样的块的实例可以是例如由堆叠的二氧化硅片制成的层状结构。二氧化硅提取表面的不同设计是已知的，并且通常包括树脂、珠粒、平行的结构如片层。它们的温度传导特性可以取决于颗粒之间的密度、孔隙率和/或空间以及它们的形状和结构而变化。多孔二氧化硅通常是非常差的温度导体，并且应在每个系统中仔细微调预扩增的热循环条件，以避免产生非特异性产物。扩增室的壁的材料和厚度也将产生影响。通常，考虑到上述注意事项，预扩增反应在预扩增室内的二氧化硅固体支持物中的距离加热器的位置不应延伸超过7、6或5mm，优选不超过4mm，并且最优选应限制为距离加热器不延伸超过3mm。
34.在另一个优选的实施方案中，预扩增包括在最高温度值和最低温度值之间的对称热循环，其提供了对于循环在厚的二氧化硅块中用于循环核酸扩增的温度特别有利的温度特征谱。
35.在先前实施方案的特别优选的实施方案中，将最高温度和最低温度各自保持至少30秒，优选保持至少45秒，最优选保持至少1分钟。
36.在另一个优选的实施方案中，在二氧化硅封闭组分(优选为牛血清白蛋白(bsa))的存在下进行预扩增。在一个特定的实施方案中，在预扩增缓冲液中提供封闭组分(优选为bsa)。在预扩增缓冲液的优选实施方案中，扩增缓冲液中bsa的浓度为0.1至5ug/ul，优选为0.2至4ug/ul，更优选为0.5至3ug/ul，最优选为1至2ug/ul。
37.在最优选的实施方案中，提供了本发明的方法，其中通过使生物样品与羟基磷灰石(hap)固体支持物接触而获得包含低拷贝数核酸的样品。
38.在另一方面，由于我们已经观察到单独的hap预处理还为在自动化工作流中检测低拷贝数核酸提供了实质性优势，并且通常有利的是在集成工作流中处理生物样品之前简化生物样品，本发明还提供了一种在自动化系统中检测低拷贝数核酸的基于hap的通用方法，该方法包括：
39.‑
使生物样品与羟基磷灰石(hap)固体支持物接触以获得包含低拷贝数核酸的样品；
40.‑
将包含低拷贝数核酸的样品提供给自动化系统的提取室，所述提取室包括用于dna吸附的二氧化硅表面；
41.‑
将核酸吸附至二氧化硅表面；和
42.‑
在自动化系统中扩增核酸。
43.在以上实施方案中，包含低拷贝数核酸的样品是洗脱捕获到hap固相支持物的核酸的结果。该洗脱优选在优选包含khpo4的磷酸盐缓冲液中进行，这将在下文中继续详细介绍。然而，为了获得最佳结果，在上述实施方案的最优选的实施方案中，在扩增步骤之前进行吸附至二氧化硅表面的核酸的预扩增，并且任选地将预扩增的核酸洗脱并运输至具有与提取室流体连接的扩增室的自动化系统的扩增室。
44.在上述任一项的优选实施方案中，生物样品与hap固体支持物的接触在增强核酸与hap结合的一价或二价阳离子的存在下进行。在优选的实施方案中，在na

、li

或mg
2
阳离
子的存在下进行生物样品与hap固体支持物的接触。在优选的实施方案中，阳离子的浓度为0.1m至2m。在最优选的实施方案中，在高于0.5m，优选高于0.75m，最优选高于1m并且还优选低于3m，更优选低于2.5m，最优选不超过2m的浓度的na

或li

阳离子的存在下进行接触。在一个替代实施方案中，在不超过1m，优选低于0.75m，最优选低于1m，并且还优选高于30nm，更优选等于或高于45nm，最优选等于或高于50nm的浓度的mg
2
阳离子的存在下进行接触。在一个具体的实施方案中，在约1m的浓度的na

阳离子的存在下和/或在约100mm的浓度的mg
2
阳离子的存在下进行生物样品与hap固相支持物的接触。
45.在本发明的方法的另一个实施方案中，包含低拷贝数核酸的样品是用磷酸盐缓冲液洗脱捕获到hap固体支持物的核酸的结果。在磷酸盐缓冲液的优选实施方案中，缓冲液的ph为6.2至7.4，优选为6.4至7.2，更优选为6.6至7，最优选为约6.8。在另一个优选的实施方案中，磷酸盐缓冲液包含khpo4。在一个优选的实施方案中，磷酸盐缓冲液中khpo4的浓度为110mm至500mm，其中130mm至170mm的范围允许短dna(即具有100至500bp的长度范围并且大部分为<200bp)的优先结合。在一个优选的实施方案中，洗脱是在0.2至0.5m(优选约0.5m，该浓度被认为是从hap上洗脱所有dna链的浓度)的hap浓度下进行的。
46.在优选的实施方案中，本发明的方法在体液的生物样品上进行。在优选的实施方案中，体液选自血浆、血清、血液、尿液、csf、胆汁、唾液等，并且优选为哺乳动物的，更优选为人体液。但是，应当注意，本发明的方法可以应用于所有可能的液体样品，包括在例如培养基或pbs等中的组织裂解物或细胞悬浮液。
47.在最后的方面，本发明还涉及适于执行本发明的任何方法的自动化系统、工作流和/或盒。
48.附图的简要说明
49.为了更全面地理解本发明的性质，结合附图参考以下详细描述，其中：
50.图1：示出了在热循环过程中在基于二氧化硅的提取室中跨过提取膜的温度梯度模拟；
51.图2：显示了在二氧化硅固体支持物上特定体积的pcr缓冲液的基于压力的配量的实例；
52.图3：显示了预扩增和qpcr检测工作流的示意图。
53.图4：显示了预扩增效率随时间的变化。每个图代表一次实验中一组重复样品中qpcr cr值的变化；
54.图5：显示了当由于基于压力的方法提高了配量精度时，在二氧化硅固体支持物上自动预扩增的增强的稳健性；
55.图6：显示了针对阳离子类型及其浓度的细胞游离dna(cell
‑
free dna，cfdna)与hap基质的结合条件，dna量表示为hap提取的血浆样品的上清液中未结合的cfdna级分的od260测量值。dna的低检测代表更有效的结合；
56.图7：显示了在不同浓度的na

或mg
2
下cfdna与hap基质的结合效率；读出表示为对管家hprt1基因获得的qpcr ct值；
57.图8：聚焦于在低于图7所示的mg
2
浓度下cfdna与hap基质的结合效率；读出表示为对管家hprt1基因获得的qpcr ct值；
58.图9：显示了在不同浓度的k

或nh
4
下cfdna与hap基质的结合效率；读出表示为对
管家hprt1基因获得的qpcr ct值；
59.图10：显示了在不同浓度的khpo4磷酸盐缓冲液中，dna片段大小与从hap基质的洗脱效率之间的相关性；
60.图11：显示了对来自10ml血浆并使用具有基于二氧化硅的提取室的idylla盒处理的cfdna与常规的非hap富集的1ml血浆样品并排进行的基于离心的hap提取方案的效率。通过qpcr分析洗脱的产物；
61.图12：显示了完整连续工作流(包括来自10ml血浆的cfdna的基于hap的预捕获，然后在自动化系统(biocartis idylla)中进行基于二氧化硅的提取和二氧化硅捕获的dna的预扩增)的潜力。
62.发明详述
63.当使用半自动或全自动分子诊断系统进行工作时，由于该系统需要配备合适的反应室，因此可能难以实施预扩增方案。作为本发明的一部分，我们已经通过创建允许在核酸提取/纯化室内直接以其二氧化硅捕获的形式直接稳健扩增核酸的方法来规避了这种需求。为了清楚起见，在二氧化硅固体支持物上的所述扩增在本文中将进一步被称为“预扩增”，这是因为以下事实：大多数现有系统在执行测定的最终阶段使用dna扩增来检测核酸靶标。
64.本方法依赖于预扩增反应混合物的基于压力的体积控制，该控制将其置于加热器附近，使得热循环特征谱变得足够特异以平衡二氧化硅的差导热性，并且结果是稳健的pcr。取决于提取室的性质和尺寸，通过在二氧化硅表面进行对称的热循环并通过调节pcr缓冲液的含量，可以进一步提高本发明方法的预扩增效率和特异性。本文提出的方法具有被集成到包括用于核酸处理的基于二氧化硅的提取室的任何完全自动化的系统中的潜力。
65.本文提出的解决方案的优点包括通过在具有固定配置的一次性盒(其中无法预见到预扩增的明显位置)中实现预扩增方案消除已建立的自动化和半自动化工作流中影响低拷贝数靶核酸的检测的随机效应。本发明的方法提供了不需要专用设备或基础设施的完全集成的方法，由于其集成的性质，该方法还减少了扩增子污染的机会。与包含专用预扩增室的现有系统相比，我们方法的另一个优势在于，预扩增是在提取室中直接在固体提取支持物上进行的，从而进一步最小化了下游转移过程中和/或由于死体积的物料损失的可能性。
66.可以使用属于biocartis nv的idylla
tm
盒来证明本发明的方法的原理验证性方法，但是，如对任何技术人员将明显的，它可以应用于任何包含使用二氧化硅的核酸提取的商业集成系统。在本实例中，在biocartis nv专有的braf突变检测盒(其提取室装有多个二氧化硅片，并在入口和出口处用注射器封闭)中以全自动方式分析了人类血浆。在样品提取过程中，dna选择性结合二氧化硅膜，同时污染物被洗去。所用的结合缓冲液包含3.68m guscn和43％的butoh，而二氧化硅片的洗涤步骤使用90％的乙醇进行。洗涤后，将膜用热空气干燥。随后，使用注射器以自动方式将特定体积的pcr缓冲液准确地配量到二氧化硅膜上。出于存储的原因，pcr缓冲液组分可以以点状和干燥或冻干的形式提供在盒中，但也可以以溶液形式提供。基于压力的方法允许将pcr缓冲液准确地配量到二氧化硅中，并使其穿过并处理所有二氧化硅捕获的dna，随后允许将反应体积限制在提取室的特定区域，在此处温度循环特征谱是最有前途的。
67.在原理证明的实例中，提取室对接在铝杯中。杯子的温度通过peltier元件调节。
我们发现，杯的对称热循环是最适合应用于特定提取室设计以允许以稳健的方式对靶标dna进行预扩增的策略。图1示出了在示例性热循环期间跨提取膜的不同区域的温度梯度。最上方的连续灰色线表示提取杯的温度，该提取杯用作受peltier元件控制的热源。从该图中可以明显看出，仅提取室的有限区域允许适合于功能性dna热循环的温度变化特征谱。
68.通常，将最高温度和最低温度在其设定点保持至少1分钟，并进行有限量的循环(13)。温度循环特征谱如下：
69.热启动：109℃，300”70. 13个循环的：
71.变性：109℃，60”72.退火：47℃，60”73.可以通过在室温下用任何低离子强度的溶液例如水或pcr缓冲液等冲洗提取室来回收扩增的dna。
74.图2显示了将特定体积的pcr缓冲液准确配量至二氧化硅膜的实例。摄影显示了用不同体积的葡聚糖蓝溶液配量的盒的提取室。剂量是自动化和基于压力的。在这种特殊的盒模型中，从盒的后端歧管配量的90μl的体积处理所有捕获的dna，同时将反应体积限制在提取室的特定区域。自然，在不同的盒模型中，可能必须估计不同体积的配量以获得最佳结果，这将被本领域技术人员所理解并且在其能力范围内。
75.接下来，然后将经二氧化硅提取和预扩增的dna以250μl的总体积朝向盒的混合室洗脱。然后在靶向braf基因的下游qpcr测定中处理这一混合物的1/10。图3显示了包括根据本发明的预扩增步骤的靶braf v600突变测定的示意性概图。箭头表示用于预扩增和qpcr步骤的引物。如上所述，将外部扩增子在盒提取室中预扩增13个循环。内部qpcr扩增子使用以下试剂和条件进行扩增和检测：
76.热启动：95℃，5”77. 50个循环的：
78.变性：95℃，5”79.退火：65.5℃，2”80.64℃，19”81.pcr缓冲液组成：
82.50mm kcl 10mm tris ph 8.6
83.3mm mgcl284.0.2mm dntp混合物
85.0.2u/μl faststart
86.500nm引物
87.250nm探针
88.对于更多详细细节(包括引物序列)可以在bisschop等人melanoma research 2018；28(2):96
‑
104中找到。
89.图4示出了预扩增效率随时间的变化。每个图代表单个实验中的一组重复样品。显示了下游qpcr分析的ct值。这些结果是基于pcr缓冲液在二氧化硅膜上的不准确配量而获得的。这导致可变的预扩增器效率。
90.与上述相反，图5显示了当由于基于压力的方法提高了配量精度时，包括预扩增的工作流的改进的稳健性。可视化下游qpcr的荧光读出。在下游测定中仅处理了预扩增产物的1/10。星号标记的曲线表示其中在工作流中实施了预扩增的样品。正方形标记的信号曲线表示没有预扩增的类似工作流。13个循环的预扩增产生非常令人满意的10的ct偏移，这通常足以允许检测原本会丢失的低拷贝数靶标。
91.许多集成平台利用基于二氧化硅的提取方法。但是，如前所述，由于boom提取方法需要大量缓冲液，并且由于poc设备需要紧凑的(最好是手持)尺寸，因此大多数自动化系统仅接受有限的样品量。因此，非常需要能够处理大样品量并且需要很少或不需要额外结合剂的核酸分离机制。为了补充上述预扩增方法，我们还设计了一种快速的基于羟基磷灰石的dna预捕获方案，其提供从大量血浆(>10ml)有效分离dna。取决于给定系统的需求和类型，我们的方法可以作为半自动化工作流的一部分，作为补充的基于台式离心的程序，或作为直接在盒内部或通过将特定容量容纳模块耦合至盒的全自动工作流的一部分。
92.通过我们开发的hap方法进一步以及一般性地增强了本发明的基于预扩增的方法中的低拷贝数靶标检测。本发明的基于hap的dna分离方法不需要添加缓冲液或任何其它不是任何形式的固体盐和hap的试剂。可以使用大多数商业批次的hap，因此该方法是通用的。由于其简单性，该方法具有在多种不同的生物流体上进行的潜力。该生物流体可以甚至包含完整的细胞，并且取决于与hap孵育过程中使用的阳离子类型和浓度，该方法提供了仅富集细胞游离dna(cfdna)级分而不结合细胞的潜能，因此可以富集其中所含的核酸。针对与下游二氧化硅提取物的最大兼容性优化了核酸洗脱方法。在高(0.2到0.5m)磷酸钾盐浓度下进行原理验证的dna洗脱，从而确保与hap固相支持物的钙基结合的所有dna的最高洗脱效率。这些高磷酸盐浓度对下游pcr的负面影响通过执行后续的基于二氧化硅的清理来抵消。由于采用了这种组合方法，因此无需做出妥协，并且hap提取和在二氧化硅上的预扩增都可以作为一个连续集成工作流的一部分进行。
93.基于hap的预处理方法包括两个步骤，即核酸结合和洗脱，并且在数分钟或更短的时间内完成操作，而无需使用过量的hap。可以将典型的hap商业悬浮液添加至不超过体积的1/20。可以优化条件以对dna和核小体具有高特异性。由于添加了特定浓度的mg
2
和na

抗衡离子，血浆蛋白几乎没有任何结合。如血浆洗脱液的od光谱所证明的，与纯dna的od光谱相似，最大值在260nm附近，而在280nm附近(这表明蛋白质的色氨酸吸收)几乎没有吸收。使用特定浓度的mg
2
作为抗衡离子允许在不使用破坏性添加剂或加热的情况下最大化短dna(<200bp)和甚至核小体与hap的结合。洗脱产物由溶解在磷酸盐缓冲液中的相对清洁的核酸(例如cfdna)组成，其与大多数商业下游样品纯化方法兼容，并且由于其低得多的沉淀倾向比在流体或微流体平台上的含蛋白质和/或细胞碎片的裂解物更易于处理。
94.大多数市售的cfdna提取试剂盒(即qiagen的qiaamp)是基于二氧化硅的，并且需要耗时且昂贵的蛋白酶k消化步骤以从生物样品中去除大部分蛋白质。基于羟基磷灰石的预捕获的掺入通过在二氧化硅提取之前去除所述蛋白质并使蛋白酶k的消化变得多余来提供样品简化。预捕获技术还提供了样品量的n倍减少，这使得能够通过减少所需的促溶缓冲液体积而与手持式设备中的下游二氧化硅提取物兼容。
95.作为第一步，我们设计了基于离心的台式方案，其确保从10ml血浆样品的cfdna的快速和约100％有效的提取。首先，将20μl的典型商业hap悬浮液(即缓冲水悬浮液，总固体
含量为25.7％)添加到50ml falcon管中的10ml血浆中。由于hap基质的显著的反应表面和结合能力，因此hap悬浮液的批间和批内差异很小。样品量可以轻松放大或缩小。之后或立即地，在hap和样品混合物中包含适当的盐，这是相对于hap的结合蛋白的高亲和力增强hap结合核酸的亲和力所必需的。
96.为了确保dna与hap的有效结合，例如可以将1m nacl和100mm mgcl2以固体形式添加到血浆和hap混合物中。这些盐的高含量允许cfdna与hap有效结合。这在图6中进行了举例说明，该图显示了在hap提取的血浆样品的上清液中未结合的cfdna级分的od260测量值。对dna的低检测代表更有效的结合。从图6中还可以得出结论，二价离子(mg
2
)的贡献明显有利于结合效率。我们测试了其他一价或二价盐(图7
‑
9)或其组合，并得出结论，对于na

和/或mg
2
(图7和8)，可能对于li

(数据未显示)，获得最佳效果，而例如k

或nh
4
(图9)则不增强dna与hap的结合。将样品与hap和选择的盐适当混合后，将混合物在室温下孵育1分钟。通过以3000rpm离心样品30秒来终止反应。随后从结合了cfdna的hap沉淀物中去除上清液
97.然后将hap沉淀溶解在选定体积的含磷酸盐的缓冲液中。在我们的实例中，将hap沉淀溶解在ph值为6.8的1ml 0.5m khpo4中，然后在室温下孵育1分钟。此后，可以去除hap(例如，通过离心或过滤)，并且可以对包含cfdna的洗脱液进行进一步的分析，例如在如上文所述的自动化工作流中。
98.图10显示了从hap基质的dna洗脱与dna片段的链大小相关。较长的dna链具有较长的磷酸主链和对hap基质的强亲和力。为了确保此类链的有效洗脱，需要更高的磷酸盐浓度。磷酸盐离子将与dna竞争hap基质上的钙离子结合位点。在本发明的实验中，我们决定使用0.5m的磷酸盐浓度，其提供非常快速和有效的dna洗脱。此外，洗脱产物的密度与下游处理和沿着盒的流体路径的传输非常兼容。例如，样品密度对于与boom方案中使用的促溶缓冲液的混合效率非常重要，这是本领域技术人员可以容易地在本发明的范围内进行调整的特征。
99.图11示出了基于离心的hap提取方案的效率。预捕获来自10ml血浆样品的cfdna，并在ph值为6.8的1ml 0.5m khpo4中浓缩。然后将浓缩的样品在使用基于二氧化硅的提取的idylla
tm
盒中与常规的1ml血浆样品并排进行处理。如上所述，通过qpcr分析洗脱的产物。qpcr曲线提供了洗脱液中dna浓度的相对定量。根据定义，10倍的靶标增加应对应3.3的ct位移，这可以在比较10ml样品的信号和1ml样品的信号时从本发明的实验中观察到。这表明本文提出的hap提取方案的提取效率为约100％。
100.最后，将预扩增和hap提取相结合的完整连续工作流的结果示于图12中。获得的结果包括从10ml血浆的基于hap的cfdna预捕获，然后进行如上所述的捕获的dna的基于二氧化硅的提取和预扩增。该图清楚地表明下游分析中检测到的靶标拷贝数的稳健和显著的增加。可以轻松按比例放大或缩小样品量和预扩增循环的数量，但是这些原理验证结果清楚地表明，本发明的方法允许在自动化或半自动化工作流中最大化低负荷cfdna从液体活检的回收。
101.因此，本发明显示了在使用基于二氧化硅的核酸提取的自动化工作流中检测低拷贝数核酸(即使是来自非常稀释的或大量的液体样品中)的巨大潜力。本文提供的二氧化硅捕获的dna的压力控制的预扩增可用于多种应用中的上游样品富集，从本质上提高了下游分析的灵敏度。这可以是下一代测序(ngs)或实时pcr，其中通常需要在多个反应孔上的样
品分配。另一方面，基于羟基磷灰石的快速cfdna提取方案使得能够处理大量生物流体，而不损失提取效率。洗脱产物由溶解在0.5m khpo4缓冲液中的干净cfdna组成，并且与大多数商业下游样品纯化平台兼容。因此，本发明的实施方案具有被应用于并高度改善连续工作流以及许多现有的和将来的(半)自动化分子诊断平台的灵敏度的潜力。
102.定义
103.如本文所用，术语“生物样品”或简称为“样品”旨在包括含有核酸和/或细胞材料的各种生物来源，无论其是从生物体新鲜获得的(即新鲜组织样品)或通过本领域已知的任何方法保存的(例如冷冻或ffpe样品)。生物样品的例子包括：细胞例如哺乳动物细胞以及真核微生物的培养物、体液、体液沉淀物、灌洗标本、细针抽吸物、活检样品、组织样品、癌细胞、从患者获得的其他类型的细胞、来自组织的细胞或来自被测试和/或治疗疾病或感染的个体的体外培养细胞，或法医样品。体液样品的非限制性实例包括全血、骨髓、脑脊液(csf)、腹膜液、胸膜液、淋巴液、血清、血浆、尿液、乳糜、大便、射出的精液、痰、乳头抽吸液、唾液、拭子标本、洗涤或灌洗液和/或刷洗标本。
104.如本文所用，术语“核酸”及其等同的“多核苷酸”是指通过核苷酸单体之间的磷酸二酯键结合在一起的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物。(脱氧)核苷酸是(脱氧)核苷(其最通常包括腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷或尿苷)的磷酸化形式。这些核苷由戊糖(核糖或脱氧核糖)和含氮碱基(“核碱基”，或简称为“碱基”)(其为腺嘌呤、鸟嘌呤(其为嘌呤)，胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶(其为嘧啶))组成。这些碱基(或其核苷或后者的核苷酸)在核酸链中所遵循的序列称为“核酸序列”，并通常按所谓的5'端至3'端方向(指核酸链的化学取向)给出。“5'”源自参考第一个(脱氧)核糖环(从其开始读取核酸序列)的5'碳，“3'”源自最后一个(脱氧)核糖环(核酸序列的读取在其上结束)的3'碳。核酸序列可以例如是atatgcc，其在本文中被解释为是指5'
‑
atatgcc
‑
3'核酸序列。按照相同的约定，后者序列将与序列5'
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ggcatat
–
3'，或简称ggcatat互补。核酸包括但不限于dna和rna，包括基因组dna、线粒体或medna、cdna、mrna、rrna、trna、hnrna、microrna、lncrna、sirna及其各种修饰形式。核酸最通常可以从天然来源例如从不同类型的生物中获得的生物样品获得。另一方面，核酸也可以以任何已知的人类设计方法(例如pcr)合成、重组或以其他方式产生。
105.术语“定量pcr”或简称为“qpcr”在本文中给出了基于聚合酶链反应(pcr)的实验室技术的定义，其用于扩增并同时检测或定量靶向的dna分子。与其中反应的产物在其末端进行检测(即在热循环完成之后)的标准pcr的相反，qpcr的主要特征是随着反应“实时”进行，在热循环过程中检测dna产物；因此，qpcr的替代名称为“实时pcr”。当前存在许多不同类型的qpcr。例如，当以逆转录(rt)步骤开始时，qpcr可用于量化信使rna的数量，然后被称为逆转录酶qpcr或rt
‑
qpcr。如本文所用，术语“定量pcr”或简称“qpcr”将优先于术语“实时pcr”或“rt
‑
pcr”使用，以避免与反转录pcr(也经常缩写为rt
‑
pcr)混淆。大多数qpcr使用两种最常见的用于实时检测产物扩增的方法之一：(a)将非特异性荧光染料插入任何双链dna，或(2)由用允许仅在探针与其互补靶序列杂交后的检测的荧光报告分子标记的寡核苷酸组成的序列特异性dna探针。在热循环过程中产生的荧光信号由适当的光学检测系统检测，并从它们通过背景阈值的那一刻开始跟踪，直到反应达到平稳为止。可以使用相对或绝对定量策略来估计靶序列的拷贝数，通常通过分析获得的扩增曲线的形状(标准曲线策略)或通过确定信号何时升高到某个阈值(通常称为ct值，但有时也称为cp值或cq值)以上。在
相对定量中，使用ct或标准曲线分析在给定样品中估计的靶核酸水平被表示为相对于另一参考样品(例如未处理的对照样品)中对于相同靶标获得的值。相反，在绝对定量中，qpcr信号与使用标准曲线的输入拷贝数相关，或者也可以根据最新的数字pcr方法进行计算。目前，第一种策略仍然更加流行，并且基于通过将获得的值与先前制作的标准曲线进行比较来估计靶标dna量。这些和其他qpcr定量策略在本领域中是众所周知的，并且取决于给定的应用和qpcr系统，它们的计算可以更小或更大地不同。
106.如本文所用，术语“用于进行定量pcr的工具”应理解为用于进行qpcr的试剂和元件的最小必需布置。它们通常将包括允许在实时pcr热循环中检测从核酸源接收的核酸模板的任何试剂。这样的试剂包括但取决于qpcr的类型不限于pcr级聚合酶、至少一种引物组、可检测的染料或探针、dntp、pcr缓冲液等。此外，“用于进行定量pcr的工具”将通常还包括本领域已知的任何标准的组件最小组装，其通常包括但不限于以下：(1)其中可以发生实时的可检测的热循环的合适隔室(进一步称为“qpcr扩增室”)。这样的隔室可以例如由适于扩增核酸的腔室形成，即由合适的材料制成并提供足够的内部温度调节，并且还包括至少一个壁，其允许在这样的扩增过程中产生的信号的实时检测，例如对光透明的壁。进一步，(2)用于改变该腔室中的温度的工具，如从各种现有的热循环机器所众所周知的。然后，(3)用于检测在qpcr热循环过程中产生的信号的工具，例如与计算机耦合的光学检测器等。简而言之，这样的最小组装通常将包括一个或多个本领域中已知的能够启动和维持热循环qpcr隔室中的热循环持续确定的时间、调整和调节温度以确保其中的稳定的热循环条件等的任何系统。此外，它还将包括一个或多个任何适当的检测设备、用于数据处理的工具(例如计算机)和允许实时读取和监控qpcr反应的热循环的输出系统(通常是在适当的图形用户界面中显示反应进度的计算机屏幕)，以及适用于操作机器和/或显示以及可能地帮助解释所获得的结果的任何软件包。
107.如本文所用，术语“盒”应理解为腔室和/或通道的独立组件，其形成为可以作为一个配件在适用于接受或连接这样的盒的较大的仪器的内部或外部转移或移动的单个物体。盒及其仪器可视为形成自动化系统，进一步被称为自动化平台。容纳在盒中的一些部件可以牢固地连接，而其他部件可以灵活地连接并可相对于盒的其他部件移动。类似地，如本文中所使用的，术语“流体盒”应被理解为包括至少一个适合于处理、加工、排出或分析优选液体的流体的腔室或通道的盒。在wo2007004103中给出了这种盒的实例。有利地，流体盒可以是微流体盒。在流体盒的上下文中，术语“下游”和“上游”可以被定义为与流体在这样的盒中流动的方向有关。即，对于盒中的流体路径的一个部分，流体从该部分流向同一盒中的第二部分，则该部分被解释为位于第二部分的上游。类似地，流体较晚到达的部分位于相对于所述流体较早通过的部分的下游。
108.盒是执行形成样品处理工作流(其是导致出于特殊目的处理或修饰样品的多个步骤)的一部分的程序的“集成工作流”的组件的实例。在此上下文中，术语“集成工作流”应理解为以高度自动化的方式执行的一系列处理步骤，优选是完全自动化(即，由自动化系统(例如，机器人或类似机器或一系列或一条线的机器)执行)或半自动化(即主要以自动化方式执行，但需要用户的少量手动或台式操作)的集成工作流的一部分。
109.通常，如本文所用，术语“流体的”或有时“微流体的”是指处理在至少一个或两个维度(例如，通道的宽度和高度)上在几何上被限制至小的、通常为亚毫米规模的流体的行
为、控制和操纵的系统和布置。这种小体积的流体在需要小尺寸和低能耗的微尺度上移动、混合、分离或以其他方式处理。微流体系统包括结构诸如微气动系统(压力源、液体泵、微阀等)以及用于处理微升、纳升和皮升体积的微流体结构(微流体通道等)。示例性的流体系统描述在ep1896180、ep1904234和ep2419705中，因此可以应用于本文提出的本发明的某些实施方案中。
110.与上文一致，术语“腔室”应理解为在流体或微流体组件内的任何几何形状的任何功能上限定的隔室，其由至少一个壁限定并且包括执行归因于此隔室的功能所需的装置。沿着这些路线，“扩增室”应理解为(微)流体组件内的隔室，其适合于执行并有目的地提供在所述组件中以便执行核酸的扩增。扩增室的实例包括pcr室和qpcr室。类似地，术语“提取室”或“核酸提取室”、或“分离室”或“核酸分离室”、或“纯化室”或“核酸纯化室”应被理解为是指在流体或微流体组件中的包括从可能是生物样品的核酸源中提取、分离或纯化核酸，并以适合于下游分析(例如扩增和/或检测)的形式(例如水溶液)提供所述核酸的装置的隔室的同义词。适于处理dna的这样的腔室的特定类型在本文中应被称为“dna提取室”或“dna分离室”或“dna纯化室”，它们均应被视为同义词。出于本说明书的特定目的，除非另有说明，否则应将提及这样的“提取/分离/纯化室”的术语隐含理解为包含适用于根据boom提取方法的原理提取/分离/纯化核酸的二氧化硅基质。值得注意的是，术语“boom方法”在本领域中是众所周知且清楚的，是指使用二氧化硅的固相核酸提取策略，参考例如us5234809或ep0389063，以及r boom,c j sol,m m salimans,c l jansen,p m wertheim
‑
van dillen and j van der noordaa；"rapid and simple method for purification of nucleic acids."j.clin.microbiol.march 1990 vol.28no.3 495
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503。
111.最后，如本文所用，术语“预扩增(pre
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amplification)”，有时在附图中缩写为“预扩增(pre
‑
amp)”，应广义地理解为是指在功能上定义的扩增室中的集成工作流内执行的另一种核酸扩增方案之前的任何核酸扩增方案。在本说明书的特定上下文中，术语“预扩增”可以指在“提取/分离/纯化室”中进行的预扩增方案。