在酵母中表达的COVID-19的口服疫苗的制作方法

在酵母中表达的covid-19的口服疫苗
技术领域
1.本发明涉及基于酵母表面展示表达的口服疫苗组合物，用于产生预防和治疗动物和人类感染(包括但不限于预防人类感染引起covid-19的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒-2(sars cov-2))的口服疫苗。本发明主要包括n末端酵母表面表达系统和在人类中的口服疫苗接种。


背景技术：

2.sars cov-2是一种新兴的对人类有传染性的病原体。它是已鉴定的第七种冠状病毒，并且可引起严重呼吸系统感染。目前，还没有可用的针对sars cov-2的有效疫苗或适当的治疗方法。更重要的是，常规免疫途径，诸如注射，对于大规模接种而言是不便的，因为此病毒正在加速其向世界各地的传播，并且对发展中地区和国家而言常规免疫途径可用性有限。
3.目前，疫苗接种是唯一可以有效阻止sars-cov-2在世界范围内传播的方法。尚未证明用于sars-cov-2疫苗的常规平台有效。在本发明中，我们描述了一种基于酵母表面展示系统的新型强效sars-cov-2疫苗。


技术实现要素：

4.本发明提供了允许sars-cov-2抗原在酵母细胞表面上表达的核酸，然后可以将其掺入到疫苗制剂中并用于刺激针对这些抗原的免疫反应。
5.因此，一方面，本发明涉及一种用于在酵母细胞表面上异源表达sars-cov-2抗原的核酸构建体，所述核酸构建体包含在酵母细胞中有活性的、可操作地连接到至少一种异源多核苷酸(其同时编码至少一种sars-cov-2抗原和酵母表面展示多肽或其片段)的启动子元件。酵母表面展示多肽是作为酵母表面展示系统的一部分的蛋白质，诸如a-凝集素(aga1/aga2)系统或α-凝集素系统。在某些实施方案中，由异源多核苷酸编码的片段是酵母表面展示多肽的完整亚基，诸如aga2亚基。
6.在一些实施方案中，sars-cov-2抗原来自sars-cov-2刺突蛋白(“s蛋白”)，并且可以与seq id no:4所示的氨基酸序列具有，例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性。
7.在一些实施方案中，sars-cov-2抗原特异性地来自sars-cov-2s蛋白的s1亚基(“s1亚基”或“s1蛋白”)，并且可以与seq id no:5所示的氨基酸序列具有，例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％同一性。
8.在一些实施方案中，sars-cov-2抗原来自s1亚基的受体结合结构域(“rbd”)，并且可以与seq id no:6所示的氨基酸序列具有，例如，至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性或100％
同一性。
9.例如，在一些实施方案中，异源多核苷酸掺入与seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。
10.在一些实施方案中，酵母表面展示多肽为a-凝集素多肽或其片段。例如，在一些实施方案中，酵母表面展示多肽或其片段为aga2肽，诸如具有seq id no:7所示的氨基酸序列的肽。
11.上述异源多核苷酸中的任何一种还可编码，例如，与sars-cov-2抗原同框的信号肽(诸如aga2信号肽)和/或用于接头肽的编码序列，诸如具有氨基酸序列(ggggs)
n
，其中，n在1与10之间，包括端值(例如ggggsggggsggggs，如果n为3)的接头肽。
12.在一些实施方案中，异源多核苷酸还编码一种或多种标签，诸如6xhis标签或表位标签，诸如v5表位标签(例如具有seq id no:9所示的氨基酸序列的标签)。
13.在某些实施方案中，异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在一个末端具有酵母表面展示多肽；另一个末端可具有，例如，标签、信号肽或sars-cov-2抗原。例如，在一些实施方案中，多肽在另一个末端具有信号肽，并且信号肽的切割产生了在所述末端具有sars-cov-2抗原的成熟多肽。在一些实施方案中，酵母表面展示多肽在由异源多核苷酸编码的多肽的c末端；在其他实施方案中，酵母表面展示多肽在n末端。
14.例如，在一些实施方案中，异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向包含：aga2信号肽；至少一种sars-cov-2抗原；接头肽序列；以及aga2肽。aga2信号肽的切割产生了在n末端具有sars-cov-2抗原的成熟多肽。在某些实施方案中，接头肽序列具有氨基酸序列(ggggs)
n
，其中n在1与10之间，包括端值(例如，3)。在一些实施方案中，在c末端的aga2肽具有seq id no:7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体掺入大部分质粒pyd5(wang等,2005,“a new yeast display vector permitting free scfv amino termini can augment ligand binding affinities”,protein engineering,design&selection,第18卷(7)第337-343页)。
15.在其他实施方案中，异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向包含：如aga2信号肽、aga2肽、接头肽和至少一种sars-cov-2抗原。aga2信号肽的切割产生了在n末端具有aga2肽的成熟多肽。在一些实施方案中，多肽包括位于至少一种sars-cov-2抗原的c末端的至少一种标签(诸如v5表位标签或6xhis标签)。在一些实施方案中，接头肽具有氨基酸序列(ggggs)
n
，其中n在1与10之间，包括端值(例如，3)。在一些实施方案中，aga2肽具有seq id no:7所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体掺入大部分质粒pyd1(wang等,2005)。
16.例如，在一些实施方案中，核酸构建体包含：(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到启动子元件，并且其中所述一种或多种异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向包含：(1)具有seq id no:10的氨基酸序列的aga2信号肽；(2)sars-cov-2抗原；以及(3)具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向由以下组成：(1)具有seq id no:10的氨基酸序列的aga2信号
肽；(2)sars-cov-2抗原；以及(3)具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽。在一些实施方案中，sars-cov-2抗原包含选自由seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6组成的组的序列。
17.在一些实施方案中，核酸构建体包含：(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到启动子元件，并且其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含seq id no:13所示的序列的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸编码由seq id no:13所示的序列组成的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸包含与seq id no:20具有至少99％同一性的序列。
18.在一些实施方案中，核酸包含：(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到启动子元件，并且其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含seq id no:14所示的序列的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸编码由seq id no:14所示的序列组成的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸包含与seq id no:21具有至少99％同一性的序列。
19.在一些实施方案中，核酸构建体包含：(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到启动子元件，并且其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含seq id no:15所示的序列的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸编码由seq id no:15所示的序列组成的多肽。在一些实施方案中，一种或多种异源多核苷酸包含与seq id no:22具有至少99％同一性的序列。
20.另一方面，本发明涉及一种由本文公开的核酸构建体表达的多肽，或这种多肽的成熟型式(例如，在去除任何信号肽之后)。在一些实施方案中，所述多肽在n
→
c方向包含：aga2信号肽、sars-cov-2抗原、v5表位、(g4s)
n
接头和aga2亚基，其中n在1与10之间。在一些实施方案中，所述多肽在n
→
c方向包含：sars-cov-2抗原、v5表位、(g4s)
n
接头和aga2亚基，其中n在1与10之间。在一些实施方案中，n为3。
21.另一方面，本发明涉及一种重组酵母，其包含上述核酸构建体中的任何一种或上述多肽中的任何一种。在一些实施方案中，重组酵母还包括编码第二酵母表面展示多肽的核酸，所述核酸任选地可操作地连接到诱导型启动子。在一些实施方案中，第二酵母表面展示多肽是a-凝集素多肽或其片段，诸如aga1肽。在一些实施方案中，酵母为酿酒酵母(s.cerevisiae)，诸如菌株eby100。在优选的实施方案中，重组酵母在其细胞表面上展示由异源多核苷酸编码的一种或多种sars-cov-2抗原。sars-cov-2抗原可以来自，例如，sars-cov-2 s蛋白、sars-cov-2 s1亚基和/或sars-cov-2 rbd。
22.另一方面，本发明提供了包含有效量的这些重组酵母中的任何一种或其提取物的疫苗组合物。在一些实施方案中，疫苗组合物包含佐剂；在其他实施方案中，疫苗组合物不包含佐剂。
23.另一方面，本发明还提供了这些疫苗组合物的口服剂量制剂。在一些实施方案中，口服剂量制剂包括口服固体剂型赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、包衣剂、润滑剂、基质形成剂和/或崩解剂。在其他实施方案中，口服剂量制剂为液体制剂或凝胶制剂，其可以任选地为单相形式，诸如水性溶液或非水性溶液；或双相形式，诸如混悬剂、乳剂或混合物。
24.另一方面，本发明提供了通过施用有效量的疫苗组合物或口服剂量制剂中的一种，在受试者中诱导对sars-cov-2的抗原特异性免疫反应的方法。受试者可能对于sars-cov-2未检测出阳性，并且可能检测出阴性。在优选的实施方案中，受试者为人类，尽管其他易感染病毒的动物也可以接受疫苗组合物或口服剂量制剂。施用优选地为口服施用。
25.因此，描述了用于在人类中预防sars cov-2感染的口服疫苗。例如，可以对n末端展示质粒pyd5进行修饰，以在酿酒酵母菌株eby100表面上展示sars cov-2 s、s1或rbd蛋白，并且它们的表达可以通过蛋白质印迹、免疫荧光和/或流式细胞术测定来检测。在一些实施方案中，将重组酵母与用于口服递送的颗粒混合，然后评估免疫反应。
26.另一方面，本发明提供了许多有用的过程，包括：(i)重组酵母的构建；(ii)重组酵母与饲养颗粒的混合；以及(iii)评估颗粒饲养的受试者的体液和细胞免疫反应。
附图说明
27.图1是示出由本文公开的核酸构建体表达的多肽的元件的示意图。所描绘的构建体是基于pyd5载体的。示出了aga2信号肽(seq id no:10)、v5表位(seq id no:9)、(g4s)3接头(seq id no:12)和aga2成熟肽(seq id no:7)的氨基酸序列。
28.图2描绘了酵母表面展示系统，其包括由本文公开的核酸构建体表达的成熟多肽。成熟多肽包含a-凝集素的aga2亚基，所述亚基通过二硫桥与在酵母细胞(诸如eby100细胞)表面上表达的aga1 a-凝集素亚基相互作用。
具体实施方式
29.口服施用是递送sars cov-2疫苗并提高接种率的方便且有效的方法。口服疫苗将更容易被接受，因为它们的口服而不是注射施用途径降低了交叉污染的风险，它们避免了针头损伤，并且它们提高了公众特别是儿童的接受度。的确，在工厂中生产疫苗可以将成本降低至每剂量少于一美分，而且像干燥和研磨这样的简单快餐式加工可产生无需冷藏不易腐烂的制品。
30.虽然先天性免疫也是人类免疫系统的重要组成部分，但适应性免疫是疫苗诱导的免疫反应发挥功效的关键。疫苗接种诱导的病原体特异性记忆b和t淋巴细胞，以及产生的诸如抗体和细胞因子等的功能性分子，在针对人类中入侵的细菌、真菌和病毒病原体方面起着重要作用。
31.虽然sars-cov-2与宿主细胞之间的相互作用的潜在机制还需要进一步研究，但s蛋白(134.36kda)(具体地是s蛋白的s1亚基(76.5kda)，并且甚至更具体地是s1亚基的受体结合结构域(rbd)(35.1kda))似乎是sars-cov-2的主要表面抗原蛋白，并作为附着蛋白参与感染过程。因此，sars-cov-2的s蛋白(具体地是s1亚基，并且甚至更具体地是s1亚基的rbd)可包含优选的抗原，用于在本文所述的酵母表面表达系统中表达。
32.核酸构建体
33.sars-cov-2抗原
34.如本文所用，"sars-cov-2抗原"是指sars-cov-2蛋白或其片段，所述蛋白或其片段在引入具有适应性免疫系统的受试者(例如，受试者诸如哺乳动物，例如人类)中时能够引发免疫反应，例如抗体反应。sars-cov-2抗原的长度可以变化，范围从短肽(例如，长度为8-20个氨基酸)到更长的肽，再到完整的蛋白质。
35.sars-cov-2的s(刺突)蛋白介导病毒进入细胞。s蛋白被切割成s1亚基和s2亚基。s1亚基包含受体结合结构域(rbd)，其特异性识别血管紧张素转化酶2(ace2)，即细胞上的sars-cov-2受体。
36.在一些实施方案中，sars-cov-2抗原来自sars-cov-2s蛋白(例如，包含在其中)。在一些此类实施方案中，sars-cov-2抗原来自s蛋白的s1亚基。在一些实施方案中，或来自s1亚基的受体结合结构域(rbd)。
37.酵母表面展示多肽
38.如本文所用，“酵母表面展示多肽”是形成酵母表面展示系统的一部分的多肽。酵母表面展示系统通常包含至少一种充当酵母细胞壁上的锚点的蛋白质或蛋白质亚基。在一些实施方案中，锚点直接或间接与sars-cov-2抗原融合。在一些实施方案中，锚点与酵母表面展示系统的另一种蛋白质或蛋白质亚基相互作用，并且另一种蛋白质或蛋白质亚基直接或间接与sars-cov-2抗原融合。这种互作用可以是，例如，共价相互作用(例如，通过一个或多个二硫桥)或非共价相互作用(例如，结合)。
39.因此，在许多实施方案中，异源多核苷酸编码多肽，其中sars-cov-2抗原直接或通过间接(例如，用一种或多种间插元件，诸如接头和/或标签)与酵母表面展示多肽融合。
40.酵母表面展示系统的非限制性实例包括作为糖基磷脂酰肌醇(gpi)锚定的蛋白质的成员和具有内部重复(pir)的蛋白质家族的成员的蛋白质。因此，例如，合适的酵母表面展示系统包括但不限于，凝集素系统(例如，a-凝集素(aga1p/aga2p))、dan4p系统、sed1p系统、絮凝素系统(例如，包含flo1p)、细胞壁蛋白系统(例如，包含cw1p、cwp2p或tip1p)和基于pir的系统(例如，包含pir1p、pir2p、pir3p、pir4p或pir5p)。
41.在一些实施方案中，酵母表面展示多肽是a-凝集素系统的一部分，例如，酵母表面展示多肽可以是aga2亚基。图2示出了展示sars-cov-2抗原的示例性酵母表面展示系统的示意图。
42.也可使用酵母表面多肽的片段，例如功能性片段。就酵母展示系统而言，“功能性”意指片段或(1)能够锚定到酵母细胞壁中，或(2)能够与能够锚定到酵母细胞壁中的多肽或多肽片段相互作用。在一些实施方案中，片段包含蛋白质的功能性亚基。
43.多肽
44.还公开了由本文公开的核酸构建体(例如，在引入酵母细胞后)表达的多肽或其成熟型式。例如，多肽可以以包含一种或多种组分(例如，信号肽)的未成熟形式表达，所述一种或多种组分的去除(例如，通过切割)得到多肽的成熟形式。提供的多肽通常至少包含sars-cov-2抗原和酵母表面展示多肽。也可以包含一种或多种附加元件(例如，标签、接头等)。在一些此类实施方案中，一种或多种附加元件间插在sars-cov-2抗原与表面展示多肽之间。在一些实施方案中，在成熟(诸如信号肽切割)后，sars-cov-2抗原位于多肽的一个末端(例如，n末端或c末端)。
45.图1示出了成熟之前的示例性多肽(例如，包括信号肽)的示意图。
46.重组酵母
47.将核酸构建体引入宿主酵母菌株中，从而产生重组酵母菌株的方法是本领域已知的。
48.包含如本文公开的核酸构建体或多肽的重组酵母可使用多种酵母菌株中的任何一种来产生，包括，例如酿酒酵母菌株和甲基嗜性菌株，诸如巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris)和多形汉逊酵母(hansenula polymorpha)菌株。在一些实施方案中，酵母菌株或天然表达或工程化以表达第二酵母表面展示多肽(即，除了酵母表面展示多肽之外)。第二酵母表面展示多肽可与由本文公开的核酸构建体表达的第一酵母表面展示多肽相互作用(例如，共价或非共价结合)。在一些实施方案中，第二酵母表面展示多肽例如通过可操作地连接到诱导型启动子(诸如gal启动子)被诱导表达。例如，酵母菌株可以是酿酒酵母eby100菌株，所述菌株具有由gal启动子调节的具有ura3可选择标记物的编码aga1(凝集素酵母表面展示系统的组分)的基因的基因组插入。
49.疫苗组合物
50.提供的疫苗组合物包含本文所述的重组酵母细胞和/或其提取物。制备酵母提取物的方法是本领域已知的，并且此类方法通常涉及引起细胞壁降解。例如，一些方法包括加热重组酵母细胞的混悬液，这可导致酵母酶降解细胞壁。
51.提供的疫苗组合物中包含的提取物通常包含多肽，所述多肽包含sars-cov-2抗原或其片段。由本文公开的核酸构建体表达的多肽在提取过程中可能会片段化或可能不会片段化，至少部分变性或以其他方式改变。然而，此类改变的多肽仍可以作为疫苗组合物的组分发挥作用，因为它们仍可以引发免疫反应。
52.在一些实施方案中，提供的疫苗组合物包含一种或多种佐剂，所述佐剂是加速、增强和/或延长由抗原触发的免疫反应的物质。本领域已知的多种佐剂适用于包括人类在内的哺乳动物。
53.在一些实施方案中，组合物缺乏佐剂。
54.口服剂量制剂
55.提供的口服剂量制剂包括固体制剂和非固体(例如，液体或凝胶)制剂两者。通常，除本文提供的疫苗组合物外，提供的制剂还包括一种或多种赋形剂。用于固体口服剂量制剂的合适的赋形剂是本领域已知的，并且包括，例如，粘合剂和填充剂、包衣剂、润滑剂、基质形成剂和崩解剂。
56.液体制剂或凝胶制剂可以呈水性形式或非水性形式，并且例如呈单相形式或双相形式(例如，混悬剂、乳剂和混合物)。
57.在一些实施方案中，口服剂量制剂包括一种或多种调味剂。
58.诱导对sars-cov-2的抗原特异性免疫反应的方法
59.提供的方法通常包括向受试者施用有效量的疫苗组合物或口服剂量制剂的步骤。“有效量”意指足以产生有益或期望结果(诸如抗原特异性免疫反应)的量。“有效量”取决于其应用的环境。有效量可以通过施用单剂量或多(例如，至少两个或至少三个)剂量来施用。
60.在一些实施方案中，施用步骤包括施用单剂量而不施用额外剂量。在一些实施方案中，施用步骤包括施用初始剂量，然后施用一个或多个加强剂量。
61.受试者可以是，例如，哺乳动物(诸如人类或非人类哺乳动物)。
62.在一些实施方案中，受试者在施用时不具有针对sars-cov-2的现有免疫力。
63.在一些实施方案中，受试者具有对sars-cov-2一定程度的现有免疫力。在一些实施方案中，现有免疫力被认为是不足的。
64.在一些实施方案中，受试者对sars-cov-2的免疫力状态是未知的。
65.在一些实施方案中，受试者对于sars-cov-2未检测出阳性(例如，受试者在旨在鉴定活性感染的rna检测中未检测出阳性)。在一些实施方案中，受试者对于针对sars-cov-2的抗体未检测出阳性(例如，受试者对于针对抗sars-cov-2的抗体未检测出阳性)。
66.在一些实施方案中，受试者先前已经对于sars-cov-2(例如sars-cov-2rna)或针对sars-cov-2的抗体检测出阳性。在这些情况下施用可以，例如，提供对sars-cov-2的免疫反应(如果先前未通过暴露于sars-cov-2而引发这种反应)或加强弱的(或减弱的)免疫反应。
67.范例
68.cov-2抗原表面展示的酵母疫苗的构建
69.将s蛋白基因(ncbi mn908947)使用特异性引物进行pcr扩增，并与内源性aga2p信号肽序列同框亚克隆到pyd5中。将所得的穿梭质粒pyd5-s转化到大肠杆菌(e.coli)dh5α中。然后从大肠杆菌中提取质粒pyd5-s，将其纯化并在线性化后电穿孔到感受态酿酒酵母eby100中。将重组酵母转化体接种在含有氨基酸(不含氨基酸的0.67％酵母氮基(ynb)、2％葡萄糖、0.01％亮氨酸、2％琼脂和1m山梨糖醇)的选择性最小葡萄糖板上。在选择性最小葡萄糖板上生长3天后，选择trp

转化体。
70.阳性菌落通过基因组pcr确认。将重组酿酒酵母eby100/pyd5-s在ynb-caa-glu(0.67％ynb、0.5酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖)中培养，并于20℃下在摇动中(250rpm)在ynb-caa-gal(0.67％ynb、0.5酪蛋白氨基酸、2％半乳糖、13.61g/l na2hpo4、7.48g/l nah2po4和5g/l酪蛋白氨基酸)中诱导，用于诱导s表面展示。携带pyd5质粒的酿酒酵母eby100用作这些测试的阴性对照。
71.在这部分中构建另外两种类型的疫苗：
72.酿酒酵母eby100/pyd5-s1表面展示的酵母疫苗
73.酿酒酵母eby100/pyd5-rbd表面展示的酵母疫苗。
74.sars cov-2抗原在酵母表面上的功能性展示的确定
75.设计这些实验来验证sars cov-2抗原在酵母表面上的功能性展示。
76.蛋白质印迹
77.在用2％半乳糖诱导后的不同时间点收集1 od
600
(1 od
600
≈107个细胞)当量的重组酵母。将样品用500μl pbs洗涤3次，重悬于50μl6
×
sds上样缓冲液(bio-rad,hercules,ca)中，并煮沸10分钟。通过在95℃下在补充有5％me的溴酚蓝样品缓冲液中将1 od
600
酿酒酵母eby100/pyd5-s沉淀物加热5分钟，来提取表面呈现的s蛋白。然后将样品在4％-15％sds-page凝胶(bio-rad)上分离，并转移至0.45um硝酸纤维素膜(bio-rad)。在用5％脱脂牛奶在室温下封闭2小时后，将膜与作为一抗(1:500稀释)的单克隆小鼠抗s抗体(sino biological,beijing,china)一起孵育。在4℃下孵育过夜并使用pbs缓冲液洗涤3次后，将膜与二抗、辣根过氧化物酶(hrp)缀合的兔抗小鼠igg(1:5,000稀释)(sigma-aldrich co.,
st.louis,mo)在室温下反应1小时。使用west pico化学发光底物(thermo fisher scientific inc.,rockford,il)产生信号，并且使用chemidoc xrs系统(bio-rad)检测信号。
78.类似的方法可用于以下酵母疫苗酿酒酵母eby100/pyd5-s1和-rbd。
79.一种或多种酵母表面展示的cov-2抗原的糖基化分析
80.png酶f购自new england labs(beverly,ma)。将重组酿酒酵母eby100/pyd5-s、酿酒酵母eby100/pyd5-s1或酿酒酵母eby100/pyd5-rbd在30℃下在ynb-caa-glu中培养过夜，然后在20℃下在ynb-caa-gal中诱导72小时。收集1 od
600
当量的细胞，将其离心，并在pbs缓冲液中洗涤一次。将细胞沉淀物100℃下在png酶f试剂包含的变性缓冲液中变性10分钟。将1μl png酶f的一部分(5,000u)添加到变性的蛋白质溶液中，然后根据制造商的说明在37℃下孵育1小时。然后将处理过的样品进行蛋白质印迹分析。
81.免疫荧光显微镜
82.为了检测酵母表面上的s展示，在用半乳糖(2％)诱导后的72小时的时间段内，以24小时的间隔收集重组酿酒酵母eby100/pyd5-s。收集1od
600
当量的重组酵母，并用5％脱脂牛奶在pbs中封闭1小时，并在4℃下与单克隆小鼠抗s抗体(1:500稀释)一起孵育1小时。用pbs洗涤后，将样品与兔抗小鼠igg fitc缀合物(sigma)(1:5,000稀释)在室温下一起孵育1小时。样品在使用前保存在黑暗中。在倒置相差荧光显微镜下检查fitc标记的酵母。
83.为了检测酵母表面上的s1展示，在用半乳糖(2％)诱导后的72小时的时间段内，以24小时的间隔收集重组酿酒酵母eby100/pyd5-s1细胞。收集1od
600
当量的重组酵母，并用5％脱脂牛奶在pbs中封闭1小时，并在4℃下与单克隆小鼠抗s1抗体(1:500稀释)一起孵育1小时。用pbs洗涤后，将样品与兔抗小鼠igg fitc缀合物(sigma)(1:5,000稀释)在室温下一起孵育1小时。样品在使用前保存在黑暗中。在倒置相差荧光显微镜下检查fitc标记的酵母。
84.为了检测酵母表面上的rbd展示，在用半乳糖(2％)诱导后的72小时的时间段内，以24小时的间隔收集重组酿酒酵母eby100/pyd5-rbd。收集1 od
600
当量的重组酵母，并用5％脱脂牛奶在pbs中封闭1小时，并在4℃下与单克隆小鼠抗rbd抗体(1:500稀释)一起孵育1小时。用pbs洗涤后，将样品与兔抗小鼠igg fitc缀合物(sigma)(1:5,000稀释)在室温下一起孵育1小时。样品在使用前保存在黑暗中。在倒置相差荧光显微镜下检查fitc标记的酵母。
85.流式细胞术测定
86.如上所述，在用半乳糖(2％)诱导后的72小时的时间段内，以24小时的间隔收集1od
600
当量的重组酵母细胞。将细胞样品用含有1％牛血清白蛋白(bsa)的无菌pbs洗涤3次，并在4℃下与单克隆小鼠抗s抗体(1:500稀释)一起孵育1小时，然后在4℃下与fitc缀合的山羊抗小鼠igg(1:5,000)反应30分钟。将细胞样品重悬于500μl无菌pbs中，并使用bd facs aira ii(bd bioscience,san jose,ca)进行流式细胞术分析。酿酒酵母eby100/pyd5用作测定的阴性对照。这些数据用于确定收集在其表面呈现出最高水平的一种或多种sars-cov-2抗原的酵母疫苗的理想时间点。
87.使用类似的方法来确定以下酵母疫苗酿酒酵母eby100/pyd5-s1和-rbd的功能性展示。
88.口服免疫的优化
89.将重2g的商业小鼠颗粒饲料用3ml 1
×
108pfu/ml的重组酵母包衣。将饲料混合并在冰上孵育30分钟，然后室温(rt)孵育30分钟以使其吸收。将颗粒用鱼油包衣以防止分散。
90.将25只balb/c小鼠分为5组，每组5只。第1-3组的小鼠分别口服施用重组酵母-s、酵母-s1或酵母-rbd包衣的饲料，持续7天，而第4-5组的小鼠分别口服施用pbs或包含空质粒的酵母包衣的饲料。
91.免疫反应的评估
92.最终疫苗接种后两周，收集小鼠血清，并通过elisa检测针对s、s1和rbd的抗体。口服疫苗接种实验重复3次。
93.基于这些实验的结果，可以评估酵母疫苗可提供的免疫保护的强度和程度。此外，可以确定哪些疫苗在动物模型中提供了更好的免疫保护，免受病毒攻击。
94.序列
95.seq id no:1(s基因序列)
96.[0097][0098]
seq id no:2(s1核苷酸序列)
[0099]
[0100][0101]
seq id no:3(rbd核苷酸序列)
[0102][0103]
seq id no:4(s全长蛋白质序列)
[0104]
[0105][0106]
seq id no:5(s1全长蛋白质序列)
[0107][0108]
seq id no:6(rbd全长蛋白质序列)
[0109][0110]
seq id no:7(aga2成熟肽)
[0111][0112]
seq id no:8(aga1蛋白)
[0113][0114][0115]
seq id no:9(v5表位标签)
[0116][0117]
seq id no:10(aga2信号肽)
[0118][0119]
seq id no:11((g4s)3接头)
[0120][0121]
seq id no:12(图1中所示的基于pyd5的构建体的右侧翼)
[0122][0123]
seq id no:13(由图1所示的构建体编码的氨基酸序列，使用完整的s蛋白作为sars-cov-2抗原)
[0124][0125][0126]
seq id no:14(由图1所示的构建体编码的氨基酸序列，使用完整的s1亚基作为sars-cov-2抗原)
[0127][0128]
seq id no:15(由图1所示的构建体编码的氨基酸序列，使用完整的rbd亚基作为sars-cov-2抗原)
[0129][0130]
seq id no:16(aga2信号肽的核苷酸序列)
[0131][0132]
seq id no:17(v5表位的核苷酸序列)
[0133][0134]
seq id no:18(接头的核苷酸序列)
[0135][0136]
seq id no:19(aga2成熟肽的核苷酸序列)
[0137][0138]
seq id no:20(图1所示构建体的核苷酸序列，使用完整的s蛋白作为sars-cov-2抗原)
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143][0144]
seq id no:21(图1所示构建体的核苷酸序列，使用完整的s1亚基作为sars-cov-2抗原)
[0145]
[0146]
[0147][0148]
seq id no:22(图1所示构建体的核苷酸序列，使用完整的rbd作为sars-cov-2抗原)
[0149]
[0150][0151]
编号的实施方案
[0152]
1.一种用于在酵母细胞表面上异源表达sars cov-2抗原的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
[0153]
(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和
[0154]
(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，
[0155]
其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到所述启动子元件，并且
[0156]
其中所述一种或多种异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向包含：
[0157]
(1)具有seq id no:10的氨基酸序列的aga2信号肽；
[0158]
(2)sars-cov-2抗原；以及
[0159]
(3)具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽。
[0160]
2.如实施方案1所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向由以下组成：
[0161]
(1)具有seq id no:10的氨基酸序列的aga2信号肽；
[0162]
(2)sars-cov-2抗原；以及
[0163]
(3)具有seq id no:12的氨基酸序列的多肽。
[0164]
3.如实施方案1所述的核酸构建体，其中所述sars-cov-2抗原包含选自由seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6组成的组的序列。
[0165]
4.一种用于在酵母细胞表面上异源表达sars cov-2抗原的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
[0166]
(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和
[0167]
(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，
[0168]
其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到所述启动子元件，并且
[0169]
其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含seq id no:13所示的序列的多肽。
[0170]
5.如实施方案4所述的核酸序列，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码由seq id no:13所示的序列组成的多肽。
[0171]
6.如实施方案5所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸包含与seq id no:20具有至少99％同一性的序列。
[0172]
7.一种用于在酵母细胞表面上异源表达sars cov-2抗原的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
[0173]
(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和
[0174]
(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，
[0175]
其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到所述启动子元件，并且
[0176]
其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含seq id no:14所示的序列的多肽。
[0177]
8.如实施方案7所述的核酸序列，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码由seq id no:14所示的序列组成的多肽。
[0178]
9.如实施方案8所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸包含与seq id no:21具有至少99％同一性的序列。
[0179]
10.一种用于在酵母细胞表面上异源表达sars cov-2抗原的核酸构建体，所述核酸构建体包含：
[0180]
(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和
[0181]
(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，
[0182]
其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到所述启动子元件，并且
[0183]
其中所述一种或多种异源多核苷酸编码包含seq id no:15所示的序列的多肽。
[0184]
11.如实施方案10所述的核酸序列，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码由seq id no:15所示的序列组成的多肽。
[0185]
12.如实施方案11所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸包含与seq id no:22具有至少99％同一性的序列。
[0186]
13.一种用于在酵母细胞表面上异源表达sars cov-2抗原的核酸构建体，所述核
酸构建体包含：
[0187]
(a)在酵母细胞中有活性的启动子元件；和
[0188]
(b)一种或多种异源多核苷酸，所述一种或多种异源多核苷酸编码(i)一种或多种sars-cov-2抗原；以及(ii)酵母表面展示多肽或其片段，
[0189]
其中所述一种或多种异源多核苷酸可操作地连接到所述启动子元件。
[0190]
14.如实施方案13所述的核酸构建体，其中所述一种或多种sars-cov-2抗原来自sars-cov-2s蛋白。
[0191]
15.如实施方案14所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽。
[0192]
16.如实施方案15所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽。
[0193]
17.如实施方案16所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽。
[0194]
18.如实施方案17所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
[0195]
19.如实施方案18所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽。
[0196]
20.如实施方案19所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:4所示的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的多肽。
[0197]
21.如实施方案20所述的核酸构建体，其中所述多肽包含具有seq id no:4所示的氨基酸序列的全长sars-cov-2s蛋白。
[0198]
22.如实施方案14所述的核酸构建体，其中所述一种或多种sars-cov-2抗原来自sars-cov-2s1亚基。
[0199]
23.如实施方案22所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽。
[0200]
24.如实施方案23所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽。
[0201]
25.如实施方案24所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽。
[0202]
26.如实施方案25所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
[0203]
27.如实施方案26所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽。
[0204]
28.如实施方案27所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:5所示的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的多肽。
[0205]
29.如实施方案28所述的核酸构建体，其中所述多肽包含具有seq id no:5所示的氨基酸序列的全长sars-cov-2s1亚基。
[0206]
30.如实施方案22所述的核酸构建体，其中所述一种或多种sars-cov-2抗原来自sars-cov-2rbd。
[0207]
31.如实施方案30所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:6所示的氨基酸序列具有至少75％序列同一性的多肽。
[0208]
32.如实施方案31所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:6所示的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的多肽。
[0209]
33.如实施方案32所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:6所示的氨基酸序列具有至少85％序列同一性的多肽。
[0210]
34.如实施方案33所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:6所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的多肽。
[0211]
35.如实施方案34所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:6所示的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽。
[0212]
36.如实施方案35所述的核酸构建体，其中所述多核苷酸编码与seq id no:6所示的氨基酸序列具有至少98％序列同一性的多肽。
[0213]
37.如实施方案36所述的核酸构建体，其中所述多肽包含具有seq id no:6所示的氨基酸序列的全长sars-cov-2rbd。
[0214]
38.如实施方案13-37中任一项所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸的核苷酸序列与seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示的序列具有至少70％同一性。
[0215]
39.如实施方案38所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸的核苷酸序列与seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示序列具有至少80％同一性。
[0216]
40.如实施方案39所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸的核苷酸序列与seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示序列具有至少90％同一性。
[0217]
41.如实施方案40所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸的核苷酸序列与seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示序列具有至少95％同一性。
[0218]
42.如实施方案41所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸的核苷酸序列包含seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示的序列。
[0219]
43.如实施方案13-42中的任一项所述的核酸构建体，其中所述酵母表面展示多肽是a-凝集素多肽或其片段。
[0220]
44.如实施方案43所述的核酸构建体，其中所述a-凝集素多肽或其片段是aga2肽。
[0221]
45.如实施方案44所述的核酸构建体，其中所述aga2肽具有seq id no:7所示的氨基酸序列。
[0222]
46.如实施方案25-57中任一项所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸还编码与sars-cov-2抗原同框的信号肽。
[0223]
47.如实施方案46所述的核酸构建体，其中所述信号肽是aga2信号肽。
[0224]
48.如实施方案13-47中任一项所述的核酸构建体，其还包含接头肽的编码序列。
[0225]
49.如实施方案48所述的核酸构建体，其中所述接头肽序列包含(ggggs)
n
，其中n在1与10之间，包括端值。
[0226]
50.如实施方案49所述的核酸构建体，其中n为3。
[0227]
51.如实施方案13-50中任一项所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸还编码一种或多种标签。
[0228]
52.如实施方案51所述的核酸构建体，其中所述一种或多种标签包括表位标签。
[0229]
53.如实施方案52所述的核酸构建体，其中所述表位标签是v5表位标签。
[0230]
54.如实施方案53所述的核苷酸构建体，其中所述v5表位标签具有seq id no:9所示的氨基酸序列。
[0231]
55.如实施方案51-54中任一项所述的核酸构建体，其中所述一种或多种标签包括6xhis标签。
[0232]
56.如实施方案13-55中任一项所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码在第一末端具有所述酵母表面展示多肽的多肽。
[0233]
57.如实施方案56所述的核酸构建体，其中所述多肽在第二末端具有：(i)标签、(
ⅱ
)信号肽或(iii)所述sars-cov-2抗原。
[0234]
58.如实施方案57所述的核酸构建体，
[0235]
其中所述多肽在第二末端具有信号肽，并且
[0236]
其中所述信号肽的切割产生了在第二末端具有sars-cov-2抗原的成熟多肽。
[0237]
59.如实施方案56-58中任一项所述的核酸构建体，其中所述第一末端是c末端。
[0238]
60.如实施方案56-58中任一项的所述核酸构建体，其中所述第一末端是n末端。
[0239]
61.如实施方案43所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向包含：
[0240]
(a)aga2信号肽；
[0241]
(b)所述一种或多种sars-cov-2抗原；
[0242]
(c)接头肽序列；和
[0243]
(d)aga2肽；
[0244]
其中所述aga2信号肽的切割产生了在n末端具有sars-cov-2抗原的成熟多肽。
[0245]
62.如实施方案61所述的核酸构建体，其中所述接头肽序列包含(ggggs)
n
，其中n在1与10之间。
[0246]
63.如实施方案62所述的核酸构建体，其中n为3。
[0247]
64.如实施方案61-63中任一项所述的方法，其中所述aga2肽具有seq id no:7所示的氨基酸序列。
[0248]
65.如实施方案43所述的核酸构建体，其中所述一种或多种异源多核苷酸编码多肽，所述多肽在n
→
c方向包含：
[0249]
(a)aga2信号肽，
[0250]
(b)aga2肽，
[0251]
(c)接头肽，和
[0252]
(d)所述一种或多种sars-cov-2抗原，
[0253]
其中所述aga2信号肽的切割产生了在n末端具有aga2肽的成熟多肽。
[0254]
66.如实施方案65所述的核酸构建体，其中所述多肽还包含位于所述一种或多种sars-cov-2抗原的c末端的一种或多种标签。
[0255]
67.如实施方案66所述的核酸构建体，其中所述一种或多种标签包括v5表位标签。
[0256]
68.如实施方案66或67所述的核酸构建体，其中所述一种或多种标签包括6xhis表位标签。
[0257]
69.如实施方案65-68中任一项所述的核酸构建体，其中所述接头肽包含序列(ggggs)
n
，其中n在1与10之间。
[0258]
70.如实施方案69所述的核酸构建体，其中n为3。
[0259]
71.如实施方案65-70中任一项所述的核酸，其中所述aga2肽具有seq id no:7所示的氨基酸序列。
[0260]
72.一种多肽或其成熟型式，所述多肽由如实施方案1-63中任一项所述的核酸构建体表达。
[0261]
73.如实施方案72所述的多肽，其中所述多肽在n
→
c方向包含：aga2信号肽、sars-cov-2抗原、v5表位、(g4s)
n
接头和aga2p亚基，其中n在1与10之间。
[0262]
74.如实施方案72所述的多肽，其中所述多肽在n
→
c方向包含：sars-cov-2抗原、v5表位、(g4s)
n
接头和aga2p亚基，其中n在1与10之间。
[0263]
75.如实施方案73或74所述的多肽，其中n为3。
[0264]
76.一种重组酵母，其包含如实施方案1-63中任一项所述的核酸构建体或如实施方案72-75中任一项所述的多肽。
[0265]
77.如实施方案76所述的重组酵母，其中所述重组酵母还包含编码第二酵母表面展示多肽的核酸。
[0266]
78.如实施方案77所述的重组酵母，其中所述第二酵母表面展示多肽可操作地连接到诱导型启动子。
[0267]
79.如实施方案77或78所述的重组酵母，其中所述第二酵母表面展示多肽是a-凝集素多肽或其片段。
[0268]
80.如实施方案79所述的重组酵母，其中所述a-凝集素多肽或其片段是aga1肽。
[0269]
81.如实施方案76-80中任一项所述的重组酵母，其中所述酵母是酿酒酵母。
[0270]
82.如实施方案81所述的重组酵母，其中所述酿酒酵母是菌株eby100。
[0271]
83.如实施方案76-82中任一项所述的重组酵母，其中所述重组酵母在其细胞表面上展示所述一种或多种sars-cov-2抗原。
[0272]
84.如实施方案83所述的重组酵母，其中所述一种或多种sars-cov-2抗原来自sars-cov-2s蛋白。
[0273]
85.如实施方案84所述的重组酵母，其中所述一种或多种sars-cov-2抗原来自sars-cov-2s1亚基。
[0274]
86.如实施方案85所述的重组酵母，其中所述一种或多种sars-cov-2抗原来自sars-cov-2rbd。
[0275]
87.一种疫苗组合物，其包含有效量的如实施方案76-86中任一项所述的重组酵母或其提取物。
[0276]
88.如实施方案87所述的疫苗组合物，其还包含佐剂。
[0277]
89.如实施方案87所述的疫苗组合物，其中所述组合物缺乏佐剂。
[0278]
90.一种口服剂量制剂，其包含如实施方案87、88或89所述的疫苗组合物。
[0279]
91.如实施方案90所述的口服剂量制剂，其还包含口服固体剂型赋形剂。
[0280]
92.如实施方案91所述的口服剂量制剂，其中所述口服固体剂型赋形剂选自由粘合剂和填充剂、包衣剂、润滑剂、基质形成剂和崩解剂组成的组。
[0281]
93.如实施方案90所述的口服剂量制剂，其中所述制剂是液体制剂或凝胶制剂。
[0282]
94.如实施方案93所述的口服剂量制剂，其中所述液体制剂或凝胶制剂呈单相形式。
[0283]
95.如实施方案94所述的口服剂量制剂，其中所述单相形式选自由水性溶液和非水性溶液组成的组。
[0284]
96.如实施方案93所述的口服剂量制剂，其中所述制剂呈双相形式。
[0285]
97.如实施方案96所述的口服剂量制剂，其中所述双相形式选自由混悬剂、乳剂和混合物组成的组。
[0286]
98.一种在受试者中诱导对sars-cov-2的抗原特异性免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如实施方案87-97中任一项所述的疫苗组合物或口服剂量制剂。
[0287]
99.如实施方案98所述的方法，其中所述受试者对于sars-cov-2未检测出阳性。
[0288]
100.如实施方案98或99所述的方法，其中所述受试者是人类受试者。
[0289]
101.如实施方案98-100中任一项所述的方法，其中所述施用包括口服施用。