抗Trop2纳米抗体及其应用的制作方法

抗trop2纳米抗体及其应用
1.本案是申请日为2020年4月16日、申请号为cn202010301498.0、发明名称为“抗trop2纳米抗体及其应用”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及生物医学或生物制药技术领域，公开了抗trop2纳米抗体及其应用。


背景技术：

3.trop2属于tacstd家族，是由tacstd2基因编码表达的细胞表面糖蛋白，又名肿瘤相关钙离子信号转导子2(tacstd2)、表皮糖蛋白1(egp
‑
1)、胃肠肿瘤相关抗原(ga733
‑
1)、表面标志物1(m1s1)。trop
‑
2主要通过调节钙离子信号通路、细胞周期蛋白表达及降低纤黏蛋白黏附作用促进肿瘤细胞生长、增殖和转移。trop2也可以与wnt信号级联中的β
‑
连环蛋白相互作用，因而对细胞核癌基因的转录、细胞的增殖起作用。
4.研究表明，trop2在胃癌、宫颈癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌和子宫内粘膜浆液性乳头癌等肿瘤中都有大量的表达，并证实其与肿瘤的转移和预后有明显的相关性，在肿瘤的发生中扮演着重要的角色。trop2是一种跨膜蛋白，其细胞外结构域在多种肿瘤上过度表达，因此它是靶向治疗发展的天然候选。trop2的组织表达局限性使得治疗的毒性降低，这也是靶向trop2治疗的优势所在。以trop2为靶点的抗体、抗体偶联物以及联合用药等多种形式的药物正处于研发中。抗trop2抗体与其他化疗药物偶联的效用已在各种临床前研究中得到证实。用于治疗trop2过表达的上皮恶性肿瘤的抗体偶联药物(adc)immu
‑
132已处于ii/iii期临床试验阶段。新型抗体偶联药物sacituzumab govitecan(immu
‑
132)以trop2为靶点，它是利用人源化抗体hrs7作为靶向载体与伊立替康活性代谢产物sn38偶联而成，可用于治疗多种上皮恶性肿瘤如乳腺癌(三阴乳腺癌)、卵巢癌、小细胞肺癌等。此外，其他人源化的抗trop2 igg
‑
sn
‑
38偶联物，如抗trop2hrs7
‑
cl2a
‑
sn
‑
38抗体偶联药物，已被证明在多种肿瘤细胞系(calu
‑
3、capan
‑
1、bxpc
‑
3和colo
‑
205)的异种移植模型中具有显著的特异性抗癌作用。
5.截至目前，市场上尚未有针对trop2靶点的纳米抗体药物公布，而纳米抗体(nanobody，nb)，即重链单域抗体vhh(variable domain of heavy chain of heavy
‑
chain antibody)—骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy
‑
chain antibody，hcab)，克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的单域抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。单域抗体具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，在免疫实验、诊断与治疗中，发挥着超乎想象的巨大功能。单域抗体正逐渐成为新一代抗体诊断及治疗中的新兴力量。
6.因此，本领域需要开发一种抗trop2纳米抗体，尤其是具备良好的trop2抗原结合性的抗trop2纳米抗体。


技术实现要素：

7.本发明提供了7株特异性针对trop2的纳米抗体，同时提供纳米抗体的编码序列、制备方法。同时本发明为基于trop2靶点的研究包括抗体偶联药物及多特异性抗体药物开发提供了研发基础。
8.在本发明的第一方面，本发明提供了一种抗trop2纳米抗体的互补决定区cdr区。
9.在另一优选例中，所述trop2纳米抗体包含一个特异性结合trop2的免疫球蛋白单一可变结构域。在一些实施方案中，所述trop2纳米抗体包含两个或更多个特异性结合trop2的免疫球蛋白单一可变结构域。
10.在另一优选例中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下组合的cdrl、cdr2和cdr3:
11.(1)seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、seq id no:3所示的cdr3(对应于抗体株nb1
‑
70或hunb1
‑
70的cdr)；
12.(2)seq id no:10所示的cdr1、seq id no:11所示的cdr2、seq id no:12所示的cdr3(对应于抗体株nb1
‑
78或hunb1
‑
78的cdr)；
13.(3)seq id no:18所示的cdr1、seq id no:19所示的cdr2、seq id no:20所示的cdr3(对应于抗体株nb1
‑
81或hunb1
‑
81的cdr)；
14.(4)seq id no:25所示的cdr1、seq id no:26所示的cdr2、seq id no:27所示的cdr3(对应于抗体株nb2
‑
22或hunb2
‑
22的cdr)；
15.(5)seq id no:33所示的cdr1、seq id no:34所示的cdr2、seq id no:35所示的cdr3(对应于抗体株nb2
‑
38或hunb2
‑
38的cdr)；
16.(6)seq id no:41所示的cdr1、seq id no:42所示的cdr2、seq id no:43所示的cdr3(对应于抗体株nb2
‑
59或hunb2
‑
59的cdr)；
17.(7)seq id no:49所示的cdr1、seq id no:50所示的cdr2、seq id no:51所示的cdr3(对应于抗体株nb6
‑
24或hunb6
‑
24的cdr)。
18.在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1
‑
3个，较佳地1
‑
2个，更佳地1个)氨基酸并能保留与trop2高亲和力结合能力的衍生序列。
19.在另一优选例中，所述的cdr1、cdr2和cdr3由vhh链的框架区fr1、fr2、fr3和fr4所隔开。
20.在本发明的第二方面，提供了一种抗trop2纳米抗体的vhh链，所述vhh链包括框架区fr和如本发明第一方面所述的cdr区中的一种或多种。
21.在一些实施方案中，所述至少一个免疫球蛋白单一可变结构域包含选自以下组合的frl、fr2、fr3和fr4:
22.(1)seq id no:4所示的fr1、seq id no:5所示的fr2、seq id no:6所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb1
‑
70的fr)；
23.(2)seq id no:13所示的fr1、seq id no:14所示的fr2、seq id no:15所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb1
‑
78的fr)；
24.(3)seq id no:13所示的fr1、seq id no:21所示的fr2、seq id no:22所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb1
‑
81的fr)；
25.(4)seq id no:28所示的fr1、seq id no:29所示的fr2、seq id no:30所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb2
‑
22的fr)；
26.(5)seq id no:36所示的fr1、seq id no:37所示的fr2、seq id no:38所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb2
‑
38的fr)；
27.(6)seq id no:44所示的fr1、seq id no:45所示的fr2、seq id no:46所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb2
‑
59的fr)；
28.(7)seq id no:13所示的fr1、seq id no:52所示的fr2、seq id no:53所示的fr3、和seq id no:7所示的fr4(对应于抗体株nb6
‑
24的fr)；
29.(8)seq id no:56所示的fr1、seq id no:57所示的fr2、seq id no:58所示的fr3、和seq id no:59所示的fr4(对应于抗体株hunb1
‑
70的fr)；
30.(9)seq id no:56所示的fr1、seq id no:62所示的fr2、seq id no:63所示的fr3、和seq id no:64所示的fr4(对应于抗体株hunb1
‑
78的fr)；
31.(10)seq id no:56所示的fr1、seq id no:67所示的fr2、seq id no:63所示的fr3、和seq id no:64所示的fr4(对应于抗体株hunb1
‑
81的fr)；
32.(11)seq id no:56所示的fr1、seq id no:70所示的fr2、seq id no:71所示的fr3、和seq id no:64所示的fr4(对应于抗体株hunb2
‑
22的fr)；
33.(12)seq id no:56所示的fr1、seq id no:74所示的fr2、seq id no:63所示的fr3、和seq id no:59所示的fr4(对应于抗体株hunb2
‑
38的fr)；
34.(13)seq id no:56所示的fr1、seq id no:77所示的fr2、seq id no:63所示的fr3、和seq id no:64所示的fr4(对应于抗体株hunb2
‑
59的fr)；
35.(14)seq id no:56所示的fr1、seq id no:80所示的fr2、seq id no:81所示的fr3、和seq id no:64所示的fr4(对应于抗体株hunb6
‑
24的fr)。
36.在另一优选例中，所述vhh链选自seq id no:8、seq id no:16、seq id no:23、seq id no:31、seq id no:39、seq id no:47、seq id no:54、seq id no:60、seq id no:65、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:78或seq id no:82中的一种或多种。
37.在另一优选例中，所述vhh链选自seq id no:60、seq id no:65、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:78或seq id no:82中的一种或多种。
38.本发明的第三方面，提供了一种抗trop2抗体，所述抗体包括一条或多条如本发明第二方面所述的抗trop2纳米抗体的vhh链。
39.在另一优选例中，所述抗trop2抗体还涵盖能够与由seq id no:8、seq id no:16、seq id no:23、seq id no:31、seq id no:39、seq id no:47、seq id no:54、seq id no:60、seq id no:65、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:78或seq id no:82中任一的氨基酸序列组成的vhh结合trop2上的相同表位的抗trop2抗体分子。
40.在另一优选例中，所述抗体可以为单体、二价抗体、和/或多价抗体。
41.本发明的第四方面，提供了一种分离的多核苷酸序列，所述多核苷酸编码选自下组的蛋白质：如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体。
42.在另一优选例中，所述多核苷酸序列为组合形式，优选地，所述多核苷酸序列包含seq id no:9、seq id no:17、seq id no:24、seq id no:32、seq id no:40、seq id no:48、
seq id no:55、seq id no:61、seq id no:66、seq id no:69、seq id no:73、seq id no:76、seq id no:79或seq id no:83中的一种或多种。
43.在另一优选例中，本发明涉及编码本发明的trop2纳米抗体的核酸分子。本发明的核酸可为rna、dna或cdna。
44.本发明的第五方面，提供了一种表达载体，所述表达载体表达本发明第四方面的多核苷酸。
45.本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第五方面所述的表达载体，或其基因组中整合有本发明第四方面所述的多核苷酸。
46.在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
47.在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞。
48.本发明的第七方面，提供了一种产生抗trop2纳米抗体的方法，包括步骤：
49.(a)在适合产生纳米抗体的条件下，培养本发明第六方面所述的宿主细胞，从而获得含所述抗trop2纳米抗体的培养物；以及
50.(b)从所述培养物中分离或回收所述的抗trop2纳米抗体；及任选的
51.(c)纯化和/或修饰步骤(b)所获得的trop2纳米抗体。
52.在另一优选例中，所述的抗trop2纳米抗体具有如seq id no:8、seq id no:16、seq id no:23、seq id no:31、seq id no:39、seq id no:47、seq id no:54、seq id no:60、seq id no:65、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:78或seq id no:82所示的氨基酸序列。
53.本发明的第八方面，提供了一种结合物，所述结合物含有：
54.(a)如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体；和可操作性连接的
55.(b)选自下组的修饰标记：化学标记和生物标记。
56.在另一优选例中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物。
57.在另一优选例中，所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。
58.在本发明的第九方面，提供了一种偶联物，所述偶联物由如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链、如本发明第三方面所述的抗trop2抗体，或如本发明第八方面所述的结合物与固体介质或半固体介质偶联制得。
59.在另一优选例中，所述偶联物由本发明第八方面所述的结合物与选自以下的偶联元件构成：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如il
‑
2等)、抗体、抗体fc片段、抗体scfv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，dt
‑
心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶
‑
样蛋白质(bphl))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
60.在另一优选例中，所述偶联物含有：多价(如二价)的如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体。
61.在另一优选例中，所述多价是指，在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体。
62.本发明的第十方面，提供了如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体的用途，用于制备(a)用于检测trop2分子的试剂；(b)用于治疗肿瘤的药物。
63.在另一优选例中，所述的检测包括流式检测、细胞免疫荧光检测。
64.本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，含有：
65.(i)如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链、如本发明第三方面所述的抗trop2抗体，和/或本发明第八方面所述的结合物；
66.(ii)药学上可接受的载体。
67.在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
68.在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、头颈部肿瘤、神经系统肿瘤。
69.在另一优选例中，所述的生殖系统肿瘤如：子宫内膜癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌等。
70.在另一优选例中，所述的消化系统肿瘤如：胰腺癌、结肠癌、胃癌、食管癌、胆管癌等。
71.在另一优选例中，所述的头颈部肿瘤如：口腔癌、喉癌、舌癌、牙龈癌等。
72.在另一优选例中，所述的神经系统肿瘤如：脑胶质瘤、髓母细胞瘤等。
73.本发明的第十二方面，提供了如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体的一种或多种的用途：
74.(i)用于检测trop2分子；
75.(ii)用于流式检测；
76.(iii)用于细胞免疫荧光检测；
77.(iv)用于治疗肿瘤；
78.(v)用于肿瘤诊断。
79.在另一优选例中，所述用途为非诊断的和非治疗的。
80.本发明的第十三方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
81.(i)如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链，或如本发明第三方面所述的抗trop2抗体；以及
82.(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
83.在另一优选例中，所述的标签序列包括6his标签和ha标签。
84.在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性结合trop2蛋白。
85.本发明的第十四方面，提供了如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链、如本发明第三方面所述的抗trop2抗体、或如本发明第八方面所述的结合物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
86.其中，所述试剂、检测板或试剂盒用于：检测样品中trop2蛋白；
87.其中，所述药剂用于治疗或预防表达trop2的肿瘤。
88.本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有如本发明第一方面所述的cdr区或如本发明第二方面所述的vhh链、如本发明第三方面所述的抗trop2抗体、或如本发明第八方面所述的结合物。
89.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
90.图1是人trop2蛋白胞外段融合fc的sds
‑
page检测结果。结果表明，该蛋白的纯度达到90％以上。
91.图2是噬菌体展示trop2纳米抗体文库的库容检测结果。结果表明，该文库的库容为1.0
×
109cfu。
92.图3是噬菌体展示trop2纳米抗体文库的目的基因vhh插入率检测结果。结果表明，该文库的vhh插入率为91.6％。
93.图4是噬菌体展示技术筛选trop2特异性纳米抗体噬菌体富集的结果。结果表明，经过3轮筛选，抗体特异性噬菌体达到46倍富集。
94.图5是流式细胞术检测trop2纳米抗体与colo205细胞的结合活性结果。结果表明，在23株纳米抗体中有7株纳米抗体能够有效结合细胞表面的trop2蛋白。
95.图6是trop2纳米抗体人源化前后与colo205细胞的结合活性。结果表明，trop2纳米抗体人源化后仍对colo205细胞(trop2阳性)有较好的结合活性。
96.图7是trop2纳米抗体的内吞性质鉴定结果。结果表明，hunb1
‑
70和hunb2
‑
59、hunb2
‑
22抗体被colo205细胞内吞比例较低，而hunb6
‑
24、hunb2
‑
38、hunb1
‑
78和hunb1
‑
81能够明显地被colo205细胞内吞。
具体实施方式
97.本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一组抗trop2纳米抗体。具体地，本发明利用人源的trop2胞外段抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将trop2蛋白分子偶联在酶标板上，展示trop2蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了trop2特异性的纳米抗体基因。实验结果表明，本发明获得的7株抗trop2纳米抗体能够有效地与trop2结合。在此基础上完成了本发明。
98.如本文所用，术语“本发明纳米抗体”、“本发明的抗trop2纳米抗体”、“本发明trop2纳米抗体”可互换使用，均指特异性识别和结合于trop2(包括人trop2)的纳米抗体。特别优选的是vhh链的氨基酸序列如seq id no:60、seq id no:65、seq id no:68、seq id no:72、seq id no:75、seq id no:78或seq id no:82所示的纳米抗体。
99.如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
100.如本文所用，术语“纳米抗体(single domain antibody，sdab，或vhh)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(vhh)。
101.纳米抗体/单域抗体(nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(vhh)克隆获得。nanobody(nb)具有优良的生物学特性，分子量12
‑
15kda，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，几乎完美克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，逐渐成为新一代抗体治疗中的新兴力量，在免疫诊断和治疗中显示出广阔的应用前景。
102.如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈β
‑
折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等，nih publ.no.91
‑
3242，卷i，647
‑
669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
103.如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗trop2蛋白抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
104.如本文所用，术语“重链可变区”与“v
h”可互换使用。
105.如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determining region，cdr)”可互换使用。
106.在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区cdr1、cdr2、和cdr3。
107.在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。
108.在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合trop2蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
109.本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
110.一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定区域来描述，称为可变
区域(cdr)，将该段间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了fr或cdr区域。
111.本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带cdr的抗体重链可变区的分子，只要其cdr与此处鉴定的cdr具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
112.本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
113.如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6his标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
114.本发明抗体指具有trop2蛋白结合活性的、包括上述cdr区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述cdr区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1
‑
50个，较佳地1
‑
30个，更佳地1
‑
20个，最佳地1
‑
10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
115.该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
116.本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
117.在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
118.表1
119.最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlys
asn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
120.本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。
121.编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
122.术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
123.本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
124.本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6his)融合在一起，形成融合蛋白。
125.一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
126.目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
127.本发明序列如表2所示
128.表2
129.130.131.132.[0133][0134]
本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0135]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos7、293细胞的动物细胞等。
[0136]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0137]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0138]
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0139]
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、pk(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
[0140]
用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、mri(磁共振成像)或ct(电子计算机x射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
[0141]
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如il
‑
2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.药激活酶(例如，dt
‑
心肌黄酶(dtd)或联苯基水解酶
‑
样蛋白质(bphl))；9.疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
[0142]
vhh链组合
[0143]
本发明还包含了一种纳米抗体vhh链的组合。其中，所述组合至少含有一组以下cdr区：
[0144]
(1)seq id no:1所示的cdr1，seq id no:2所示的cdr2，seq id no:3所示的cdr3；
[0145]
(2)seq id no:10所示的cdr1，seq id no:11所示的cdr2，seq id no:12所示的cdr3；
[0146]
(3)seq id no:19所示的cdr1，seq id no:20所示的cdr2，seq id no:21所示的cdr3；
[0147]
(4)seq id no:28所示的cdr1，seq id no:29所示的cdr2，seq id no:30所示的cdr3；
[0148]
(5)seq id no:37所示的cdr1，seq id no:38所示的cdr2，seq id no:39所示的cdr3；
[0149]
(6)seq id no:46所示的cdr1，seq id no:47所示的cdr2，seq id no:48所示的cdr3；
[0150]
(7)seq id no:55所示的cdr1，seq id no:56所示的cdr2，seq id no:57所示的cdr3。
[0151]
药物组合物
[0152]
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5
‑
8，较佳地ph约为6
‑
8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
[0153]
本发明的药物组合物可直接用于结合trop2蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
[0154]
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001
‑
99wt％，较佳地0.01
‑
90wt％，更佳地0.1
‑
80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重
‑
约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
[0155]
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重
‑
约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0156]
标记的纳米抗体
[0157]
在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
[0158]
胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗trop2的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。
[0159]
本发明的抗trop2纳米抗体具有很好的结合活性。
[0160]
检测方法
[0161]
本发明还涉及检测trop2蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中trop2蛋白的水平。
[0162]
在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。
[0163]
试剂盒
[0164]
本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
[0165]
本发明还提供了用于检测trop2水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别trop2蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
[0166]
应用
[0167]
如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与trop2相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对trop2的临床诊断和靶向治疗。
[0168]
本发明的主要优点包括：
[0169]
(1)本发明纳米抗体能够有效结合细胞表面的trop2蛋白。
[0170]
(2)本发明纳米抗体为基于trop2靶点的研究包括抗体偶联药物及多特异性抗体药物开发提供了研发基础。
[0171]
(3)本发明纳米抗体的生产简便。
[0172]
(4)本发明纳米抗体适合于原核表达和真核表达，具有可溶性极高，不易聚集，能耐高温、强酸、强碱等致变性条件的优点。适用于实验室及工业开发。
[0173]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0174]
实施例1：人trop2胞外段蛋白表达
[0175]
利用哺乳动物细胞hek293f瞬转表达人trop2胞外段蛋白：将已经克隆有人trop2胞外段基因的pfuse
‑
igg重组质粒与转染试剂pei 1:3混合后，转染至hek293f细胞；37℃、6％co2摇床培养箱中培养6天；随后收集细胞上清，与protein a珠子在室温下结合1h；再用磷酸盐缓冲液ph 7.0洗涤珠子后，用0.1m ph3.0甘氨酸溶液洗脱蛋白；再将洗脱的蛋白超滤至pbs溶液中，测定产量后取样进行sds
‑
page检测。检测结果如图1所示，表达纯化的htrop2(ecd)
‑
fc蛋白纯度大于90％，可用于骆驼免疫及抗体筛选。
[0176]
实施例2：人trop2胞外段蛋白免疫文库构建及筛选
[0177]
将纯化的htrop2(ecd)
‑
fc蛋白免疫1只新疆双峰驼，7次免疫结束后从骆驼外周血中分离total rna，经反转录和pcr扩增出vhh基因，再将vhh基因克隆至噬菌体载体pmecs上，转化至tg1宿主细胞中构建成噬菌体展示文库。经检测，构建的文库库容为1.0
×
109cfu
(图2)，文库插入率为91.6％(图3)。
[0178]
随后利用噬菌体展示技术进行文库筛选，经3轮“吸附
‑
洗涤
‑
富集”的筛选过程最终获得含抗体基因的噬菌体富集46倍(图4)。从以上富集的噬菌体克隆中随机挑选600颗进行pe
‑
elisa鉴定，将获得的阳性克隆全部进行测序鉴定，将所有序列不同的抗体(23株)均作为候选对象。
[0179]
实施例3：抗人trop2纳米抗体的表达
[0180]
将以上23株序列不同的纳米抗体基因克隆至pfuse
‑
igg载体上，然后将重组质粒与转染试剂pei 1:3混合后，转染至hek293f细胞；37℃，6％co2摇床培养箱中培养6天；随后收集细胞上清，与protein a珠子在室温下结合1h；再用磷酸盐缓冲液ph 7.0洗涤珠子后，用0.1m、ph3.0甘氨酸溶液洗脱蛋白；再将洗脱的蛋白超滤至pbs溶液中，测定产量后取样进行纯度检测。经检测表达纯化的纳米抗体纯度大于90％，可用于候选功能活性研究。
[0181]
实施例4：trop2纳米抗体与细胞表面抗原的结合活性检测
[0182]
利用高表达trop2的细胞colo205进行抗体结合功能验证：将培养的colo205细胞用胰酶消化并用完全培养基中和后，用pbs洗涤细胞一次，然后收集细胞；平均分装至96孔板中，加入稀释好的抗体(每组抗体稀释浓度分别为0.313ug/ml、0.156ug/ml、0.078ug/ml)于4℃孵育20min；离心后用pbs洗涤细胞一次，再加入山羊抗人igg
‑
fitc(按照1：200稀释)，4℃孵育20min；用pbs洗涤一次细胞后，3000rpm，4℃离心4min，弃上清，加入200ul pbs/孔，重悬细胞，转移至流式管中，流式检测每个样本fitc信号。结果如图5所示，其中7株纳米抗体能够有效结合细胞表面的trop2蛋白。7株纳米抗体序列见表1。
[0183]
表1 trop2纳米抗体序列编号
[0184]
抗体编号氨基酸序列编号核苷酸序列编号nb1
‑
70seq id no：8seq id no：9nb1
‑
78seq id no：16seq id no：17nb1
‑
81seq id no：23seq id no：24nb2
‑
22seq id no：31seq id no：32nb2
‑
38seq id no：39seq id no：40nb2
‑
59seq id no：47seq id no：48nb6
‑
24seq id no：54seq id no：55
[0185]
实施例5：抗体人源化设计
[0186]
将以上7株纳米抗体的氨基酸序列置于结构数据库中进行同源结构的搜索，取其中序列等源性较高的结构，对这些结构进行比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的蛋白，进行目标纳米抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构；然后对模建的最优结构，利用protsa服务器计算残基的溶剂可接触性，对模建的最优结构和dp
‑
47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。最终确定出一种人源化trop2纳米抗体,人源化后抗体序列对应如下表2：
[0187]
表2人源化trop2纳米抗体序列编号
[0188]
抗体编号氨基酸序列编号核苷酸序列编号hunb1
‑
70seq id no：60seq id no：61hunb1
‑
78seq id no：65seq id no：66
hunb1
‑
81seq id no：68seq id no：69hunb2
‑
22seq id no：72seq id no：73hunb2
‑
38seq id no：75seq id no：76hunb2
‑
59seq id no：78seq id no：79hunb6
‑
24seq id no：82seq id no：83
[0189]
将以上人源化抗体氨基酸序列按照人密码子优化后，将其核苷酸序列合成至pfuse载体上，然后将重组质粒转染hek293f细胞，转染方法见实施例3。
[0190]
实施例6：人源化trop2纳米抗体与细胞表面抗原的结合活性检测
[0191]
将以上表达纯化的人源化抗体与其对应的人源化前抗体共同进行细胞结合活性检测：将培养的colo205细胞用胰酶消化并用完全培养基中和后，用pbs洗涤细胞一次，然后收集细胞；平均分装至96孔板中，加入稀释好的抗体(每组抗体稀释浓度分别为20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2.5ug/ml、1.25ug/ml、0.625ug/ml、0.313ug/ml、0.156ug/ml、0.078ug/ml)于4℃孵育20min；离心后用pbs洗涤细胞一次，再加入goat anti human igg
‑
fitc(按照1：200稀释)，4℃孵育20min；用pbs洗涤一次细胞后，3000rpm，4℃离心4min，弃上清，加入200ul pbs/孔，重悬细胞，转移至流式管中，流式检测每个样本fitc信号。结果如图6所示，每株抗体与细胞的结合活性ec
50
值统计如下表3，人源化后的trop2纳米抗体仍然具有较好的细胞结合活性。
[0192]
表3 trop2纳米抗体与colo205细胞的结合活性ec
50
[0193][0194]
实施例7：人源化trop2纳米抗体的内吞活性检测
[0195]
收集培养好的colo205细胞，pbs溶液洗涤一次，计数并分装至96孔板中；再将稀释好的trop2纳米抗体(1.25ug/ml，100ul)加入细胞中混匀，4℃孵育20min；pbs溶液洗涤一次，然后将未内吞(0h)实验组的96孔板立刻置于冰上，同时将内吞(2h)实验组放进培养箱培养，37℃，5％co2；2h后，同时取出两块板，4℃离心，3000rpm，4min；弃上清，pbs洗涤细胞一次后再离心；加入goat anti human igg
‑
fitc(按照1：200稀释)，4℃孵育20min；用pbs洗涤一次细胞后，3000rpm，4℃离心4min，弃上清，加入200ul pbs/孔，重悬细胞，转移至流式管中，流式检测每个样本fitc信号。结果如图7所示，hunb1
‑
70和hunb2
‑
59、hunb2
‑
22抗体被colo205细胞内吞比例较低，而hunb6
‑
24、hunb2
‑
38、hunb1
‑
78和hunb1
‑
81能够明显地被colo205细胞内吞。
[0196]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。