特异结合电压门控钠离子通道α亚基Nav1．7的抗体或抗体片段的制作方法

特异结合电压门控钠离子通道
α
亚基nav1.7的抗体或抗体片段
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及以nav1.7的离子传导孔模块为靶点，特异性识别上述靶点(多肽)的抗体和/或抗体片段。


背景技术：

2.疼痛起源于周围神经系统的伤害感受器，而外周神经组织作为一种游离的神经末梢，广泛分布于全身的皮肤、肌肉、关节和内脏组织中，它可以将感受到热的、机械的或化学刺激后转化为动作电位，通过神经纤维传递到其位于背根神经节(dorsal root ganglia,drg)的胞体部分，最终传递到高级神经中枢，从而引起痛觉。而神经元中动作电位的产生和传导又依赖于位于细胞膜上的电压门控钠离子通道(voltage-gated sodium channels,vgscs)。当细胞膜去极化时，钠离子通道激活，通道打开，引起钠离子内流，使细胞膜进一步去极化，导致动作电位的产生，由于异常的动作电位而产生疼痛感。因此，抑制异常的钠离子通道活动有助于疼痛的治疗或缓解。
3.电压门控钠离子通道可以9个亚型分类，目前，已经在哺乳动物中鉴定了9种电压门控钠离子通道α亚型，由于其氨基酸序列相似度均大于50％。因此，被认为来自同一家族，命名为nav1(nav1.1～nav 1.9)。电压门控钠离子通道广泛存在于如神经元、骨骼肌细胞的细胞膜上，是一类跨膜糖蛋白复合体，由一个α亚基和多个辅助的β亚基组成，其中α亚基有2个功能结构域(domains)，即离子传导孔结构域(ion-conducting pore domain)和电压感应结构域(voltage-sensing domains，vsds)组成，α亚基的孔形成由4个重复的结构域(di-div)，每个重复结构域含有6个跨膜螺旋片段(s1-s6)。s1-s4含有电压感应结构域vsd，s5-s6组成四聚体构象形成孔结构域。在vsd结构域里，s4含有vsd,并s4富含有门控电荷的精氨酸，可感应膜电位变化，它与s3的c末端一起形成电压感应桨(voltage-sensor paddle)，它们的运动反映了膜电位的变化，并耦合到孔的开放、关闭和失活。由于这个电压感应桨移动是通道的开与锁。因此，这个功能结构域是重要药物作用靶点，可以通过蛋白相互作用来调节通道的开关。
4.最近研究表明nav1与疼痛相关的亚型主要是nav1.7、nav1.8和nav 1.9。其中nav1.7是主要负责疼痛的重要成员之一。nav1.7为ttx-s型，编码基因为scn9 a，主要分布于外周初级感觉神经元和交感神经节神经元，参与人疼痛信号通路。最近在人体无疼痛的病人中发生在nav1.7的遗传突变后，产生了不痛的症状；进一步研究表明，该基因是主要负责疼痛的钠离子通道之一。
5.临床上普遍应用化学小分子(如卡马西平、利多卡因、美西律等)作为电压门控钠离子通道抑制剂治疗疼痛，但是它们对电压门控钠离子通道亚型缺乏足够的选择性，因而会产生心脏毒性和中枢神经副作用的缺点。最近针对nav1.7的一些小分子的阻断剂(blocker)进入临床研究，由于钠离子通道的亚型同源性很高，小分子阻断剂的选择性较差，其副作用难以克服。但大分子的阻断剂具有特异性高、稳定性好，副作用较小，但由于产
生抗体的电压门控钠离子通道抗原不易制备，因此研究十分困难。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段，所述特异结合为以nav1.7中divs3结构域的离子传导孔模块(ion-conducting pore module,pm)作为靶点，利用该区域的靶点设计多肽作为抗原获得单克隆抗体，通过特异性抗体与其靶点结合，可以干扰vgscs离子通道的正常状态，从而抑制疼痛。
7.本发明的第二目的在于提供含有所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的divs3结构域的离子传导孔模块的抗体或其抗体片段的药物组合物。
8.本发明的第三个目的在于提供所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的divs3结构域的离子传导孔模块的抗体或其抗体片段或所述的药物组合物的用途。
9.本发明也提供编码上述抗体或抗体片段的核苷酸、含有该核苷酸的表达载体，以及上述抗体或抗体片段的制备方法。
10.根据本发明的一方面，本发明的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的divs3结构域的离子传导孔模块的抗体或其抗体片段，其特异结合的靶点为电压门控钠离子通道α亚基的div/s3结构域的离子传导孔模块。更优选地，其结合的抗原氨基酸序列为：dsvnvdkqpkyeys(seq id no.9)
11.根据nav 1.7的晶体结构，在nav 1.7的电压传感器阀门的结构域div/s3结构域的离子传导孔模块来筛选合适靶点区域的多肽作为抗原，经过亲水性和抗原性的分析，选择一个具有亲水性好、抗原性高的多肽，其氨基酸序列为dsvnvdkqpkyeys(seq id no.9)。
12.化学合成上述多肽，将该合成多肽编号为c9797bl020-7(seq id no.9)，将其偶联到载体蛋白klh上，然后免疫balb/c小鼠，多次接种免疫刺激机体产生免疫应答从而产生多克隆抗体，采血测试、elisa检测和评价。
13.基于抗原抗体反应，通过elisa来评价免疫动物产生的多克隆抗体效价，根据免疫的动物抗体效价和人神经组织的特异性，最终确定符合要求的三只动物#4061、#4062、#4063进行细胞融合，取三只动物的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)进行细胞电融合，融合后进行细胞培养，在筛选培养基上筛选阳性细胞株，利用多肽c9797bl020-7作为抗原筛选杂交瘤细胞株，根据elisa检测结果，根据抗体效价和和人神经组织特异性来选择阳性细胞株进行亚克隆。所得亚克隆再次进行elisa检测和神经组织特异性检测后，选择对神经组织特异性好进行亚克隆，进行细胞冻存。
14.提取细胞株总rna，合成cdna，建立cdna文库，进行可变区测序。扩增编码抗体可变区的多核苷酸序列，可将编码vh和vl的dna序列(也可用编码可变区的rna序列来操作)整合到同一个载体，或将它们分别整合到载体上，用上述载体转染合适的宿主细胞；然后对其进行测序分析。测序结果显示，其vh的dna序列如seq id no:10所示，其vl的dna序列如seq id no:11所示。
15.构建基因工程抗体，根据不同需要，将上述编码vh和vl(或编码vh中cdr和编码vl中cdr)的dna序列导入合适的宿主进行抗体表达，并验证抗体效果。
16.检测单克隆抗体的免疫原性，将靶点部分序列进行原核表达，从原核表达细菌提取总蛋白质，然后进行初步纯化获得抗原片段，采用western blotting方法，分析该抗体结
合的特异性，如图4所示，该抗体能特异性识别nav 1.7的靶点蛋白序列。采用小鼠用5％福尔马林诱导急性炎症疼痛造模，经尾静脉注射适量抗体，检测抗体对疼痛模型小鼠镇痛的效果。结果如图5所示，注射10mg/kg抗体后，比对照具有显著的镇痛作用。
17.根据本发明的另一方面，本发明的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或其抗体片段，包括：
18.重链互补决定区hcdr1、hcdr2、hcdr3，所述hcdr1的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述hcdr2的氨基酸序列如seq id no.2所示，所述hcdr3的氨基酸序列如seq id no.3所示；和
19.轻链互补决定区lcdr1、lcdr2、lcdr3，所述lcdr1的氨基酸序列如seq id no.4所示，所述lcdr2的氨基酸序列如如seq id no.5所示，所述lcdr3的氨基酸序列如seq id no.6所示。
20.根据本发明，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。优选的，所述抗体为单克隆抗体。
21.根据本发明，所述抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体等。优选的，所述抗体为人源化抗体。
22.根据本发明，所述抗体片段包括fab、f(ab’)2、dsfv、scfv、双链抗体、微抗体、双特异抗体、多特异抗体、嵌合抗体和cdr移植抗体等形式。
23.根据本发明的优选实施例，所述特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。本领域技术人员可以理解的是，本发明的抗体或抗体片段也包括与上述重/轻链可变区seq id no:7/seq id no.8所示的序列具有80％，80～85％，85～90％,90～95％或95～99％同源的结构类似的衍生序列。
24.根据本发明的优选实施例，所述特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段包括重链恒定区和轻链恒定区，所述轻链恒定区和重链恒定区物种来源可以选自于：人源抗体恒定区、牛源抗体恒定区、羊源抗体恒定区、犬源抗体恒定区、猪源抗体恒定区、猫源抗体恒定区、马源抗体恒定区、驴源抗体恒定区。优选地，所述重链恒定区选自igg1、igg2、igg3和igg4重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ或λ轻链恒定区。优选地，所述重链恒定区为igg4重链恒定区，所述轻链恒定区为κ轻链恒定区。
25.根据本发明的优选实施例，所述特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段包括重链和轻链，所述重链的氨基酸序列如seq id no：14所示，所述轻链的氨基酸序列如seq id no：15所示。
26.根据本发明的又一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码本发明所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段。
27.根据本发明的优选实施例，所述核苷酸序列包括：如seq id no：10所示编码重链可变区的核苷酸序列，如seq id no：11所示编码轻链可变区的核苷酸序列。
28.根据本发明的优选实施例，所述核苷酸序列包括：如seq id no：16所示编码重链的核苷酸序列，如seq id no：17所示编码轻链的核苷酸序列。
29.本发明也提供了一种表达载体，所述表达载体含有如上任一项所述的核苷酸序列。
30.本发明的也提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有如上所述的表达载体。
31.本发明的也提供了如上所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段的制备方法，所述方法包括以下步骤：
32.(a)在表达条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段；
33.(b)分离并纯化(a)所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7的抗体或抗体片段。
34.根据本发明的另一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7抗体或抗体片段作为活性成分，以及含有药学上可接受的载体，所述药物组合物有镇痛和提高疼痛阈值效果，能治疗疼痛、瘙痒和咳嗽。
35.根据本发明的再一方面提供了本发明所述的特异结合电压门控钠离子通道α亚基nav1.7抗体或抗体片段或本发明所述的药物组合物在制备治疗疼痛相关疾病的药物中的用途。
36.有益效果：采用抗体这种生物大分子针对nav 1.7电压门控钠离子通道的电压传感器的靶向的特异性结合，来失活divs3结构域的离子传导孔模块，导致不能正常钠离子进入神经细胞，从而达到治疗和缓解疼痛的效果，由于而其具有很好的靶向性，可以克服由于化学小分子药物产生的副作用。
附图说明
37.图1：钠离子通道nav 1.7的结构图及靶点示意图；
38.图2：免疫动物血清的人神经组织特异性的免疫组化分析；
39.a、4061；b、4062；c、4063；d、4064；e、4065
40.图3：单克隆抗体的western blotting免疫原性分析；
41.图4：spr测定nav1.7靶点单克隆抗体5c12d2c8亲和力结合曲线；
42.图5：nav1.7靶向单克隆抗体5c12d2c8在人外周神经细胞定位；
43.图6：5c12d2c8抗体对野生型小鼠5％福尔马林诱导的急性炎症疼痛的镇痛效果。
具体实施方式
44.以下通过对本发明较佳实施方式的详细描述，说明但不限制本发明。
45.材料来源：
46.下述使用的材料和试剂如无特别说明均为商业购买。
47.实施例1抗原合成
48.根据nav 1.7的氨基酸序列(genbank no.np_002968)和晶体结构的功能区(图1)进行亲水性和抗原性的分析，筛选出dsvnvdkqpkyeys序列，其亲水性和抗原性符合抗原的要求，采用全自动合成仪人工合成了cdsvnvdkqpkyeys(seq id no.9)多肽。
49.具体步骤如下：
50.(1)将第一个aa的-cooh用diea连接到cl-resin,然后将树脂上未反应完的功能团用meoh封闭；
51.(2)用dmf洗涤；
52.(3)用pip去除第一个aa中-nh2的保护基团fmoc，使-nh2裸露；
53.(4)用dmf洗涤；
54.(5)将第二个aa的-cooh用dic hobt活化，然后缩合至第一个aa中的-nh2上，形成酰胺键；
55.(6)用dmf洗涤；
56.(7)用pip去除第二个aa中-nh2的保护基团fmoc，使-nh2裸露；
57.(8)用dmf洗涤；
58.(9)
…
重复5-8直到最后一个aa的-nh2裸露；
59.(10)将多肽从树脂上切割，并切除所有氨基酸的侧链保护基团，切割试剂为：三氟乙酸 乙二硫醇 苯酚 茴香硫醚 水；
60.(11)将切割液加入乙醚中，使多肽沉淀，离心即得到多肽粗品(c9797bl020-7)；
61.(12)多肽hplc的c18制备/分析柱进行纯化，编号为c9797bl020-7获得纯化的多肽用于免疫动物。
62.注：为方便多肽偶联，可在此多肽末端额外添加半胱氨酸。
63.实施例2单克隆细胞株制备
64.2.1动物免疫
65.准备弗氏完全佐剂sigma,f5881和弗氏不完全佐剂(sigma,f5506)。利用多肽c9797bl020-7的末端-sh将多肽偶联到载体蛋白klh上，作为免疫原。
66.选取5只8周龄的雌性balb/c(动物编号：#4061,#4062,#4063,#4064,#4065)进行3次腹腔免疫，刺激机体产生免疫应答从而产生抗体。初免：50μg/只，三周后进行二次免疫，剂量为50μg/只；在第二次免疫后的2周后进行第三次免疫，剂量为50μg/只，在第三次免疫的1周后进行采血进行抗体检测。
67.2.2动物血清elisa检测
68.2.2.1仪器与设备：
69.洗板机：北京楠华zdmx
70.酶标仪：thermo multiskanascent
71.2.2.2使用的试剂：
72.包被抗原为多肽c9797bl020-7；包被液为1*pbs(ph7.4)；洗涤缓冲液：1*pbs(ph7.4)，0.05％pbs；采用一抗为3免后抗血清；酶标二抗：peroxidase-affinipure goat anti-mouse igg,fcγfragment specific(min x hu,bov,hrssrprot)；tmb显色液；终止液：1m盐酸。
73.具体方法如下：
74.(1)包被：用包被液将抗原稀释成1μg/ml，混匀后每孔100μl加入板条中，盖上盖板膜，放置4℃过夜。
75.(2)封闭：取出板子弃去包被液，加入封闭液，盖上盖板膜，37℃恒温箱0.5h。
76.(3)加一抗：3免抗血清首孔1/1000稀释，然后倍比稀释9个梯度，盖上盖板膜，37℃恒温箱1h。
77.(4)加二抗：取出酶标板，弃去内液，加入稀释后的酶标二抗，浓度为0.033μg/ml，
盖上盖板膜，37℃恒温箱半小时。
78.(5)显色：取出酶标板，弃去内液，加入显色液，25℃显色13min。
79.(6)终止反应:加入终止液，终止反应。
80.(7)加入终止液后，即刻在酶标仪上450nm读数，将od值大于设定的阴性对照od值的2.1倍的孔所对应的最大稀释度，定为该样品的效价，检测结果如表1所示，nc是未免疫血清的阴性对照，起始稀释倍数是1:1,000。经对三次免疫后的抗血清进行检测，动物编号为#4061、#4062、#4063的抗血清滴度在1:512,000；s/b值最高，其余2只动物(#4064,#4065)的抗血清滴度虽然在1:256,000，但s/b仅为2.7以下；同时血清进行人神经细胞的组化分析，三只小鼠的血清均能有较好的组化信号(图2)。因此，选择3只动物进行细胞融合。
81.表1.第三次免疫后的血清elisa检测结果
82.动物号.#4061#4062#4063#4064#4065空白对照0.0630.0630.0630.0630.0631:1,0002.7072.7832.6742.6322.5411:2,0002.6062.582.5322.4382.4051:4,0002.5712.282.4052.3452.3191:8,0002.442.2492.2131.8971.7921:16,0002.2062.011.9341.6241.4351:32,0001.8881.621.5661.2461.0031:64,0001.4791.2271.1990.8430.6771:128,0001.0870.8330.8260.5290.4031:256,0000.7330.5120.5280.3060.241:512,0000.4350.3130.3060.1740.165滴度1:512,0001:512,0001:512,0001:512,0001:512,000s/b6.9054.9684.8572.7622.619
83.2.3.细胞学特异性确认
84.为了确认这些刺激免疫所产生的血清是否具有神经组织的特异性，对5只动物血清进行人神经组织的免疫组织化学分析。具体实验方法如下：
85.2.3.1组织脱水处理：
86.取人神经组织切片进行脱水处理，脱水处理采用徕卡asp300s，具体流程如下：采用70％、85％、90％，无水乙醇分别脱水各30分钟；再用无水乙醇脱水2次，每次60分钟；然后透明剂处理30分钟，再用透明剂处理2次，每次60分钟；再用石蜡处理3次，分别为60分钟、120分钟和180分钟，采用徕卡eg1150包埋机进行包埋操作，制作成蜡块，进行切片，切片厚度为4μm。
87.2.3.2原位杂交：
88.取人神经组织切片在85℃烤片20min；脱蜡剂处理3次，每次1分钟；用无水酒精脱蜡3次，每次1分钟；水洗3次，每次1分钟；采用er2(ph＝9缓冲溶液)热修复20分钟，冷却12分钟，再用水洗3次，每次1分钟；然后封闭30分钟；水洗3次，每次1分钟；加入细胞株的上清孵育30分钟，水洗3次，每次1分钟；采用增强剂孵育8分钟，水洗3次，每次2分钟，加入二抗孵育8分钟；水清洗3次，每次2分钟；dab显色8分钟；水洗3次，每次1分钟，苏木素染色10分钟；水
洗3次，每次1分钟，酒精脱水后风干封片。在奥林巴斯光学显微镜下进行观察。
89.经光学显微镜观察，5个动物的血清均能与人神经组织反应呈阳性，表明免疫的动物产生了神经组织的特异性抗体(见图2)。
90.2.4细胞融合
91.根据elisa检测结果，结合人神经组织特异性分析结果，选择三只动物#4061,#4062和#4063进行终免，三天后取该两只动物的脾细胞和瘤细胞进行融合，小鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)与脾脏细胞按照1：3比例，利用电融合的方式进行细胞融合，将融合后的细胞用hat培养基铺入到15块饲养细胞板中，放入co2培养箱培养。
92.2.5杂交瘤细胞株筛选:
93.融合后的细胞培养7-10d后，进行整板更换培养液，在换液4h后采用elisa进行检测。elisa具体材料和步骤与2.2中所述动物血清elisa检测相同。
94.每只动物铺板10个，总计40个96孔板，总计3840孔，加入融合动物血清1：1000稀释液，设置为阴性对照加入空白培养基，以空白对照的od值检测，选择抗体滴度最高，并s/b(signal/blank)>＝2.1时，确认为阳性克隆，共筛选获得135个候选克隆，进行下一轮亚克隆。
95.2.5.1亚克隆：
96.将第一次筛选的135个单孔细胞的的克隆进行第二次检测(检测方法同上)，根据抗体滴度和s/b比值，从135个候选克隆中筛选到14个候选克隆，14个克隆的检测结果如表2所示。这14个克隆将用于进一步筛选。
97.2.6.亲和力排序：
98.为了筛选亲和力相对较高的单克隆抗体细胞株，对14个单克隆抗体细胞株进行了亲和力排序。结果如表3所示，14个单克隆抗体只有5c12d2c8,18f9g6d5和55f8c3b2三个克隆拟合曲线的可信度较高，其中5c12d2c8的亲和力最高，kd(m)达到4.55x10-9
，rmax(ru)只达到291.1(表3)，该克隆的细胞株作为候选克隆。
99.表2.第二轮亚克隆筛选(elisa)
[0100][0101]
表3抗原抗体结合的亲和力排序结果
[0102][0103]
实施例3抗体免疫原性检测
[0104]
3.1抗原制备
[0105]
3.1.1：载体构建与粗蛋白制备
[0106]
合成80个氨基酸含有nav1.7的divs3结构域的离子传导孔模块靶点的多肽，构建原核表达的his融合蛋白表达载体,接种于2000ml lb液体培养基(卡那抗性)中，在37度下震荡培养过夜，当od600约0.6，降低培养温度到30℃；加入iptg诱导剂至终浓度0.1mm，30℃继续震荡培养8h；离心3min收集菌体，重悬于50ml预冷nta-0缓冲液中，冰浴30min后，进行超声破碎菌体，在4℃离心50min，收集沉淀(包涵体)；沉淀以50ml nta-0缓冲液重悬，加入dtt至终浓度1mm；超声促进杂蛋白溶解，在4℃离心10min，去上清，获得粗蛋白制备液；
[0107]
3.1.2蛋白变性与复性
[0108]
采用2倍体积的3m盐酸胍稀释蛋白溶液进行变性，取蛋白溶液于透析袋中，以peg20000浓缩体积至50～100ml，在4℃以pbs缓冲液透析过夜进行复性，然后将蛋白浓缩。
[0109]
3.1.2蛋白纯化
[0110]
按照厂家说明书制备ni-nta柱，按照说明书进行蛋白纯化
[0111]
3.2蛋白质印记(westernblotting)
[0112]
(1)按照12％的分离胶配方制作分离胶；
[0113]
(2)取对应的抗原与上样缓冲液4：1混合，95℃变性5min；
[0114]
(3)按照marker 4μl，抗原50μl这样的量交错加入泳道中；
[0115]
(4)以90v的电压将跑至浓缩胶末端，再切换至120v跑至分离胶末端2/3处；
[0116]
(5)将胶取出后去除浓缩胶，把裁好的pvdf膜先放在甲醇中浸泡2min，后将胶，pvdf膜，裁好的6张滤纸以及支持垫放入转膜缓冲液中平衡10min；
[0117]
(6)按照负极
→
黑板
→
支持垫
→
3张滤纸
→
胶
→
膜
→
3张滤纸
→
支持垫
→
白板
→
正
极的顺序组装好，注意没装一层都要用玻璃棒将气泡赶出；
[0118]
(7)向转膜槽中加满转膜缓冲液，以100v的电压转膜30min，并将转膜槽放入冰水中；
[0119]
(8)将膜取出后用丽春红染液染色5min，然后用水稍微冲洗观察是否转膜成功，有条带后将丽春红用洗涤液洗干净；
[0120]
(9)将膜用封闭液浸润，再摇床上封闭1h，然后用洗涤液洗3次，每次5min；
[0121]
(10)将膜剪成5条，取5种不同的杂交瘤上清，按1比10的比例用pbs稀释后作为一抗，4℃孵育过夜；
[0122]
(11)第二天用洗涤液洗3次，每次5min后，加入用洗涤液按的1：5000比例稀释的hrp-羊抗鼠igg，室温孵育1h；
[0123]
(12)用洗涤液洗三次，每次10min后，将配好的dab工作液滴到膜上，避光显色8min后观察结果。
[0124]
4，western blot结果
[0125]
对nav1.7的单克隆抗体5c12d2c8与覆盖靶点多肽抗原进行westernblotting杂交，具体结果见图3。从图3结果可以看出：5c12d2c8能识别靶点多肽抗原信号，具有抗原-抗体免疫反应，证明5c12d2c8能够识别靶点，且具有较好特异性。
[0126]
实施例4抗体测序
[0127]
为了确定单克隆抗体序列，对单克隆5c12d2c8进行测序。按照trizol试剂的技术手册从杂交瘤细胞中分离总rna。然后使用同种型特异性反义引物或通用引物将总rna逆转录成cdna，遵循primescript tm第一链cdna合成试剂盒技术手册。根据genscript的快速扩增cdna末端(race)的标准操作程序(sop)方法，扩增vh和vl的抗体片段。分别将扩增的抗体片段克隆入标准克隆载体。进行菌落pcr以筛选具有正确大小的插入片段的克隆。至少对5个具有正确大小的插入片段的菌落进行测序。比对不同克隆的序列，确定这些克隆的共有序列。
[0128]
由此确定vh的dna序列，其如seq id no:10所示；确定vl的dna序列，其如seq id no:11所示。
[0129]
单克隆抗体5c12d2c8的重链可变区(vh)dna序列如seq id no:10所示；轻链可变区(vl)的dna序列如seq id no:11所示。vh和vl分别包含三个互补决定区(cdr)，位置关系如下所示：其中虚线下划线的为引导序列(信号肽)，实线下划线为cdr序列，加粗黑体为框架区(fr)。
[0130]
重链：
[0131]-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-恒定区-终止密码重链可变区(vh)：
[0132][0132]
gaggtgcagctggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagcggcggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtaatggtggtggtgagacctactatgaggacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctacaaatgaacagtctgaagtctgaggacacagccat
[0133]
gtattactgtgctagggaggagtacgagggtacgtggtactgagatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca(seq idno:10)重链恒定区：
[0134]
gccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgccc
[0135]
aaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctac
[0136]
actctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttg
[0137]
cccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttg
[0138]
catatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcacc
[0139]
attactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagt
[0140]
tcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaa
[0141]
cagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttc
[0142]
aaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggca
[0143]
gaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcag
[0144]
tctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcag
[0145]
ccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagca
[0146]
agctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgaggg
[0147]
cctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga
[0148]
轻链：
[0149]-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-恒定区-终止密码子轻链可变区(vl)：
[0150][0150]
gatgttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcacatctagtcagagcggagtacatagtaatggaaacaccgagttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtct
[0151]
ccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgaacatctggggtcccagacaggttcagtggcagtg
[0152]
gatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactgcggccaaggttcacatgttggccggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa(seq idno:11)
[0153]
轻链恒定区：
[0154]
cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacg
[0155]
acaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagc
[0156]
accctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaaga
[0157]
catcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag
[0158]
根据dna序列推导出氨基酸序列，vh氨基酸序列如seq id no:7所示，vl氨基酸序列如seq id no:8所示。
[0159]
重链：
[0160]-fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-恒定区-终止密码子重链可变区(vh)：
[0161]
evqlvesggdlvkpggslklscaasgftfssggmswvrqt
pdkrlewvatisngggetyyedsvkgrftisrdnakntlylqmnslksedtamyycareeyegtwyedvwgagttvtvss(seq id no:7)恒定区
[0162]
akttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdlytlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvlt
[0163]
itltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkef
[0164]
kcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngq
[0165]
paenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk-[0166]
轻链：
[0167]
fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4-恒定区-终止密码子轻链可变区(vl)
[0168]
dvlmtqtplslpvslgdqasisctssqsgvh
[0169]
sngntelewylqkpgqspklliykvsnrtsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycgqgshvgrtfgggtkl
[0170]
kei(seq id no:8)
[0171]
恒定区
[0172]
radaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdsk
[0173]
dstysmsstltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec-[0174]
推测出编码vh的rna序列如seq id no:12所示，编码vl的rna序列如seq id no:13所示。
[0175]
实施例55c12d2c8抗体结合抗原的亲和力测定
[0176]
抗原抗体的解离速率平衡常数(kd)可反映了抗体和抗原之间的亲和力高低，kd值越低，亲和力越高。利用表面等离子共振(surface plasmon resonance，spr)技术测定单克隆抗体的抗原抗体解离速率平衡常数，以评价单克隆抗体对抗原的亲和力。
[0177]
对单克隆抗体5c12d2c8在12.5，25，50，100，200，400nm不同浓度进行spr测定与抗原的结合曲线。结果如图5所示：单克隆抗体5c12d2c8对抗原的解离常数kd(1/s)为2.47x10-4
，平衡解离常数kd(m)为8.78x10-9
(图4)。
[0178]
实施例65c12d2c8抗体在人外周神经细胞的特异性
[0179]
由于神经细胞高度分化，为了检验5c12d2c8在人外周神经细胞的特异性，采用ips诱导的人外周神经细胞进行验证。在进行试验之前，对ips诱导的神经细胞类型进行确认，采用外周神经组织特异性的分子标记，鉴定所诱导的是否属于神经元细胞，三种在神经元细胞特异表达的分子markerpsd95进行人神经组织定位。psd95由dlg4基因所编码，是膜相关鸟苷酸激酶(maguk)家族的成员之一，它与psd93可以在突触后位点相互作用，在神经组织中特异性表达。因此，psd95抗体都可以作为分子marker(对照)研究抗体的人外周神经细胞表达特异性和分布。
[0180]
6.1ips诱导人外周神经元
[0181]
6.1.1：使用2μg/cm2的laminin(sigma)包被t25培养瓶，按照2.5x106每瓶的细胞数量将人源神经干细胞(iregene therapeutics)接种于2个包被好的t25培养瓶中，接种培养基为无血清无动物源性成分的fp神经干细胞培养基(iregene therapeutics)，其中添加10μm的抑制剂y-27632。接种后的t25培养瓶置于37度，5％的co2中培养过夜。
[0182]
6.1.2：次日移除含有y-27632的fp神经干细胞培养基，并更换培养基为无血清无动物源性成分的外周神经元定向分化培养基(iregene therapeutics)，此后一直使用此培养基直至实验结束。之后每隔天更换一次培养基，直至第14天；中间记录细胞形态变化。
[0183]
6.1.3：双层包被15mm光学玻片(deckglaser)以制备细胞爬片。15mm光学玻片置于24孔板中(1片/孔)。使用50μg/ml poly-l-lysine溶液浸没玻片，置于37度，5％的co2下孵育不少于2小时。移除poly-l-lysine后用灭菌水洗涤3次。使用5μg/ml的laminin溶液浸没玻片，置于37度，5％的co2下孵育不少于3小时，之后使用pbs充分洗涤。
[0184]
6.1.4：使用accutase细胞消化液(invitrogen)消化t25培养瓶中的细胞，按照1x105/孔细胞数将细胞接种于包被好的15mm光学玻片(deckglaser)上。培养基为无血清无动物源性成分的神经元定向分化培养基(iregene therapeutics)，之后每隔天更换一次培养基，直至第21天。
[0185]
6.2荧光免疫检测
[0186]
6.2.1：移除24孔板中细胞分化的培养基，使用dpbs洗涤培养孔。
[0187]
6.2.2：采用4％多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用dpbs缓冲液清洗两遍；然后用0.1％triton x-100处理5分钟，用dpbs缓冲液清洗两遍；然后用含10％马血清和0.1％triton x-100的dpbs缓冲液将细胞4℃孵育过夜；最后加入用dpbs缓冲液稀释的抗体，37℃孵育2小时，用dpbs缓冲液清洗三遍；之后使用与一抗对应的荧光二抗(1:1000)进行孵育，45分钟后移除二抗，用dpbs缓冲液清洗三遍；使用300nm dapi进行核染色，室温2分钟；用灭菌水清洗三遍封片制备光学细胞爬片；使用olympus fv3000激光共聚焦显微镜或nikon n-sim高分辨率显微镜进行读片。
[0188]
6.3人外周神经细胞定位结果
[0189]
采用外周神经细胞特异分子标记psd95对ips诱导的外周神经细胞进行细胞类型分析，结果表明：ips诱导的外周神经细胞能与特异性分子标记结合，证明ips诱导的神经细胞属于外周神经细胞，可以用于抗体的细胞特异性分析。单克隆抗体5c12d2c8在ips诱导的人外周神经细胞分布如图5所示：单克隆抗体5c12d2c8在外周神经细胞的轴突上有较强荧光信号，与对照组psd95相比，其在轴突上的荧光强度更强，结果显示nav1.7通道单克隆抗体5c12d2c8与轴突分子特异的分子标记共定位，表明5c12d2c8具有很好的外周神经细胞特异性，并在外周神经细胞的轴突上呈点状排列。
[0190]
实施例75c12d2c8抗体在野生型小鼠体内镇痛效果
[0191]
在伤害感受器受到刺激后，会产生动作电位并通过外周神经传导到脊髓再传到大脑中从而感受到疼痛，而nav1.7电压门控钠离子通道对动作电位的产生和传递起到了至关重要的作用，我们假设单克隆抗体药物特异性与电压门控钠离子通道nav1.7的离子传导孔结合，可能阻止电信号传导，从而达到镇痛效果。
[0192]
为了验证检测单克隆抗体5c12d2c8的镇痛效果，利用福尔马林炎症疼痛模型被用于本研究，由于福尔马林实验所造成的疼痛更偏向于紧张性疼痛，且引起的状态与临床疼痛十分相似，该方法现已经被广泛用于测定动物的疼痛感受情况。福尔马林后动物对伤害性刺激的反应行为呈现为2个时期，第一个时期在注射后立即产生，持续10min左右，第二期为注射后15min左右出现，持续大约45min，因此将这2个时期分别命名为i相和ii相。一般认为造成i相疼痛的原因是福尔马林直接刺激了伤害性感受器，导致c纤维的兴奋从而产生疼
痛，而ii相疼痛的产生原因是炎症引起前列腺素，组胺，5-羟色胺等神经递质的释放，从而使痛觉神经兴奋产生疼痛感，一般认为ii相更能反应药物的作用。
[0193]
7.1实验方法
[0194]
7.1.1：实验仪器：
[0195]
小鼠尾注固定器(yls-q9g)购于上海软隆科技发展有限公司，50μl微量注射器和1ml人胰岛素注射器购于武汉勤志杰生物。
[0196]
7.1.2：实验动物：
[0197]
25-35g spf级km小鼠购于湖北省动物试验研究中心；km小鼠在购买至少在实验室来适应环境2天左右，环境温度23
±
1℃，给与充足的水分以及食物，每笼5-8只。在实验前将小鼠置于透明笼子中适应30分钟。实验过程中隔绝食物及水，利用计时器记录结果，实验结束后将动物置入乙醚毒瓶中麻醉安乐死。
[0198]
7.1.3：药物处理方法
[0199]
从透明笼子中将小鼠捞出，放置于桌面上拉拽其尾部使其进入固定器中，然后用塞子将头部固定，使其尾巴伸出固定器底部。将固定器置于尾注辅助台上，将小鼠的尾部置于辅助灯下观察，观察到侧面血管后，通过尾静脉注射的方法向侧面血管中注入200μl单克隆抗体药物，拔出针头后按压针口20s，止血后将其放入透明笼子中。30min后使用微量注射器向小鼠足底注入新鲜配置的20μl 5％的福尔马林溶液，然后立即将小鼠放入透明笼子中进行观察，用计时器记录45min内小鼠舔舐注射爪的时间(s)，以5min为间隔记录数据，通过每5分钟内记录小鼠舔爪和缩爪的时间，总共45分钟，分别统计分析i相急性痛(0-10分钟)和ii相持续性痛(10-45分钟)，对照组为等体积等浓度的鼠源igg对照抗体。
[0200]
7.1.4：数据处理
[0201]
将数据进行双尾t-test检验，来检验是否具有显著性水平，在同剂量实验中实验组数据同时与pbs对照组和igg对照组进行双尾t-test检验；在不同剂量实验中，药物的实验组数据与pbs对照组以及等剂量的igg对照组进行对比，且同一药物不同剂量之间也进行对比。有显著性差异的用*表示，其中*表示p<0.05，**表示p<0.01。
[0202]
7.2实验结果
[0203]
在25mg/kg的剂量下，单克隆抗体5c12d2c8的镇痛效果如图6所示：igg阴性抗体对照(igg)在相同剂量下，在ii相的舔爪时间较i相显著增加，而注射单克隆抗体5c12d2c8在ii相的舔爪时间较给药后的i相和对照组相比有着极显著差异(p<0.01)，单克隆抗体5c12d2c8在ii相镇痛效果较阴性抗体对照(igg)减轻了32％(图6)。
[0204]
序列清单：
[0205]
hcdr 1:
[0206]
sggms(seq id no:1)
[0207]
hcdr2:
[0208]
tisngggetyyedsvkg(seq id no:2)
[0209]
hcdr 3:
[0210]
eeyegtwyedv(seq id no:3)
[0211]
lcdr 1:
[0212]
tssqsgvhsngntele(seq id no:4)
[0213]
lcdr2:
[0214]
kvsnrts(seq id no:5)
[0215]
lcdr 3:
[0216]
gqgshvgrt(seq id no:6)
[0217]
vh:
[0218]
mnfglsliflalilkgvqcevqlvesggdlvkpggslklscaasgftfssggmswvrqtpdkrlewatisngggetyyedsvkgrftisrdnakntlylqmnslksedtamyycareeyegtwyedvwgagtvtvss(seq id no:7)
[0219]
重链：
[0220]
mnfglsliflalilkgvqcevqlvesggdlvkpggslklscaasgftfssggmswvrqtpdkrlewatisngggetyyedsvkgrftisrdnakntlylqmnslksedtamyycareeyegtwyedvwgagt
[0221]
akttppsvyplapgsaaqtnsmvtlgclvkgyfpepvtvtwnsgslssgvhtfpavlqsdly
[0222]
tlsssvtvpsstwpsetvtcnvahpasstkvdkkivprdcgckpcictvpevssvfifppkpkdvlt
[0223]
itltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkef
[0224]
kcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngq
[0225]
paenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgk-(seq id no：14)
[0226]
vl：
[0227]
mklpvrllvlmfwipasssdvlmtqtplslpvslgdqasisctssqsgvhsngntelewylqkpgqpklliykvsnrtsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycgqgshvgrtfgggtklei(seq id no:8)
[0228]
轻链：
[0229]
mklpvrllvlmfwipasssdvlmtqtplslpvslgdqasisctssqsgvhsngntelewylqkpgqpklliykvsnrtsgvpdrfsgsgsgtdftlkisrveaedlgvyycgqgshvgrtfgggtklei
[0230]
kraaaptvsifppsseqltsggasvvcflnnfypkdinvkwkidgserqngvlnswtdqdskdstysmss
[0231]
tltltkdeyerhnsytceathktstspivksfnrnec-(seq id no：15)抗原肽：
[0232]
dsvnvdkqpkyeys(seq id no:9)
[0233]
vh核苷酸序列:
[0234]
atgaacttcgggctcagcttgattttccttgccctcattttaaaaggtgtccagtgtgaggtgcagc
[0235]
tggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctgg
[0236]
attcactttcagtagcggcggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtc
[0237]
gcaaccattagtaatggtggtggtgagacctactatgaggacagtgtgaaggggcgattcaccatct
[0238]
ccagagacaatgccaagaacaccctgtacctacaaatgaacagtctgaagtctgaggacacagccat
[0239]
gtattactgtgctagggaggagtacgagggtacgtggtactgagatgtctggggcgcagggaccacg
[0240]
gtcaccgtctcctca(seq id no:10)
[0241]
重链核苷酸序列：
[0242]
atgaacttcgggctcagcttgattttccttgccctcattttaaaaggtgtccagtgtgaggtgcagctggtggagtctgggggagacttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcctgtgcagcctctggattcactttcagtagcggcggcatgtcttgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtaatggtg
gtggtgagacctactatgaggacagtgtgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctacaaatgaacagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgctagggaggagtacgagggtacgtggtactgagatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggtaaatga(seq id no：16)
[0243]
vl核苷酸序列:
[0244]
atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagtgatgttttga
[0245]
tgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcacatctag
[0246]
tcagagcggagtacatagtaatggaaacaccgagttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtct
[0247]
ccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgaacatctggggtcccagacaggttcagtggcagtg
[0248]
gatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactg
[0249]
cggccaaggttcacatgttggccggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa(seq id no:11)
[0250]
轻链核苷酸序列：
[0251]
atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgcttccagcagtgatgttttga
[0252]
tgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatctcttgcacatctag
[0253]
tcagagcggagtacatagtaatggaaacaccgagttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtct
[0254]
ccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgaacatctggggtcccagacaggttcagtggcagtg
[0255]
gatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttattactg
[0256]
cggccaaggttcacatgttggccggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgggctgat
[0257]
gctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcg
[0258]
tgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacg
[0259]
acaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatgagcagc
[0260]
accctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaaga
[0261]
catcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag(seq id no：17)
[0262]
rna序列：
[0263]
augaacuucgggcucagcuugauuuuccuugcccucauuuuaaaagguguccagugugaggugcagcugguggagucugggggagacuuagugaagccuggagggucccugaaacucuccugugcagccucuggauucacuuuc
aguagcggcggcaugucuuggguucgccagacuccagacaagaggcuggagugggucgcaaccauuaguaauggugguggugagaccuacuaugaggacagugugaaggggcgauucaccaucuccagagacaaugccaagaacacccuguaccuacaaaugaacagucugaagucugaggacacagccauguauuacugugcuagggaggaguacgaggguacgugguacugagaugucuggggcgcagggaccacggucaccgucuccuca(seq id no：12)
[0264]
augaaguugccuguuaggcuguuggugcugauguucuggauuccugcuuccagcagugauguuuugaugacccaaacuccacucucccugccugucagucuuggagaucaagccuccaucucuugcacaucuagucagagcggaguacauaguaauggaaacaccgaguuagaaugguaccugcagaaaccaggccagucuccaaagcuccugaucuacaaaguuuccaaccgaacaucuggggucccagacagguucaguggcaguggaucagggacagauuucacacucaagaucagcagaguggaggcugaggaucugggaguuuauuacugcggccaagguucacauguuggccggacguucgguggaggcaccaagcuggaaaucaaa(seq id no：13)