一种全分子量分布的透明质酸钠及其制备方法和应用与流程

1.本技术涉及生物材料技术领域，具体涉及一种全分子量分布的透明质酸钠及其制备方法和应用。


背景技术：

2.透明质酸(haluronic acid，ha)是由d
‑
葡糖醛酸和n
‑
乙酰
‑
d
‑
葡糖胺链接而成的线性多糖，分子量为数十万至数百万道尔顿，广泛分布于动物组织中，特别是在人皮肤、脐带、眼玻璃体及关节滑液中含量最高，也广泛分布于植物和微生物中。在自然界中，ha结构一致，没有种族差异性，无免疫原性。
3.ha在高浓度(1％)时，分子间以网状形式存在，有很高的黏弹性。ha的水溶液为黏弹性流体，填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上，主要功能为保护及润滑细胞，调节细胞在此弹性基质上的移动。在皮肤中，ha可锁住水分，使皮肤光滑细嫩，维持皮肤弹性。人体关节滑液中的ha，可起到润滑关节，隔离有害信号因子的刺激，保护关节软骨的功能。眼玻璃体中的ha，起到支撑眼房、保护视网膜、使眼睛明亮的功能。ha是国际公认的理想的天然保湿因子，可以应用到各种化妆品中，起到美容保湿的功效。ha口服吸收后，可参与体内ha的合成，分布在人体皮肤、关节腔及眼玻璃体中，可补充关节滑液内玻尿酸，增加皮肤弹性。
4.ha在生产及应用时多以透明质酸钠的形式存在，不同种类的透明质酸钠功效差别较大，例如，高分子量透明质酸钠(分子量>50万)具有较好的黏膜保护作用，低分子量透明质酸钠(分子量1万～50万)和寡聚透明质酸钠(分子量<1万)在皮肤渗透能力及口服吸收能力方面具有较好的优势。目前，透明质酸产品主要集中在单一分子量分布的透明质酸，分子量分布宽度较窄，且质量参差不齐。因此，现有的方法想要获得较宽分子量分布的透明质酸钠，需将各分子量段的透明质酸钠进行混合复配，然而，不同分子量的透明质酸钠产品之间的黏度等性能差异较大，直接混合获得的产物均匀性很难保证。现有技术中还提供了一些物理、化学或生物类的透明质酸钠降解方法，然而现有的降解方法处理后的透明质酸钠分子量分布并不均匀，稳定性也较差，难以进一步提升透明质酸钠产品的质量。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明旨在提供一种均匀性好、稳定性高且为全分子量分布的高质量透明质酸钠，以及其制备方法和应用。
6.一方面，本技术提供了一种全分子量分布的透明质酸钠的制备方法，所述方法包括：
7.步骤1)：对透明质酸钠固体原料进行喷淋双氧水和紫外照射处理，获得透明质酸钠降解物料；
8.步骤2)：将所述透明质酸钠降解物料溶解于水中，并用naoh溶液调ph至碱性，获得透明质酸钠碱性溶液；
9.步骤3)：对所述透明质酸钠碱性溶液进行超声处理；
10.步骤4)：将所述透明质酸钠固体原料配制成浓度为0.1％～1％(w/v)的透明质酸钠溶液，以20％～60％(v/v)的添加比例与步骤3)所得超声后的透明质酸钠碱性溶液混合均匀；
11.步骤5)：分别采用硅藻土和活性炭进行吸附处理，并采用纳米滤膜过滤浓缩，干燥后即得所述全分子量分布的透明质酸钠。
12.进一步地，所述步骤1)中，每千克所述透明质酸钠固体原料喷淋质量浓度1％～5％的双氧水50～100毫升，紫外照射剂量为300～1500μw/cm2，照射时长50～70min。
13.可以理解的是，本技术中所述紫外照射剂量指单位面积上所接受紫外光的光通量。可选的，所述紫外照射的步骤为置于紫外灯下进行照射，其中紫外灯的照射波长为200
‑
400nm，优选220
‑
320nm。
14.进一步地，所述透明质酸钠固体原料的分子量为100～200万。
15.可以理解的是，本技术中所述透明质酸钠的分子量均指其重均分子量。
16.进一步地，所用透明质酸钠固体原料选自化妆品级透明质酸钠、食品级透明质酸钠、医药级透明质酸钠中的一种或多种。
17.进一步地，所述步骤2)中，所述透明质酸钠降解物料溶解于水后的体积浓度为1％～10％(w/v)；和/或，
18.用naoh溶液调ph至10～12。
19.进一步地，所述步骤3)中，超声处理的频率为10～100khz，时间为15～180min。
20.进一步地，所述步骤5)中，
21.采用硅藻土吸附处理的步骤包括：加入基于所述透明质酸钠碱性溶液质量0.1％～1％(w/v)的硅藻土，于45
‑
80℃下搅拌吸附30～60min，过滤；和/或，
22.采用活性炭吸附处理的步骤包括：用稀酸溶液调ph至6～7，加入基于透明质酸钠溶液质量0.1％～1％(w/v)的活性炭，于45
‑
80℃下搅拌吸附30～60min，过滤；优选的，所述稀酸溶液选自稀盐酸溶液、稀硫酸溶液、稀醋酸溶液、稀次氯酸溶液中的一种或多种。
23.进一步地，所述步骤5)中，所述纳米滤膜的截留分子量为200
‑
300da，操作压力控制在15
‑
30bar，温度控制在30
‑
50℃。
24.另一方面，本技术还提供了采用上述方法所制备获得的全分子量分布的透明质酸钠，所述全分子量分布透明质酸钠的重均分子量范围为0.2万～150万，分子量分散系数mw/mn在5以上；
25.优选的，所述透明质酸钠中内毒素含量<0.01eu，蛋白质含量<0.01％；
26.优选的，所述透明质酸钠在280nm处od值<0.01，在260nm处od值<0.01。
27.另一方面，本技术还提供了采用上述制备方法所制备获得的透明质酸钠在制备医药用、食品用和/或化妆品用的保湿剂、润滑剂、抗炎剂和/或细胞修复剂中的应用。
28.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
29.1、本发明提供的制备方法能够快速、高效地制备获得全分子量分布的透明质酸钠，并且制得的透明质酸钠均匀性好、稳定性高，可充分利用各分子量透明质酸钠的功效优势，分子量分散系数mw/mn在5以上。
30.2、本发明提供的全分子量透明质酸钠的制备方法，同时融合了紫外照射降解、超
声
‑
碱解处理、硅藻土过滤、活性炭吸附和纳米膜过滤，获得的透明质酸钠的内毒素含量<0.01eu，蛋白质含量<0.01％，280nm处od值<0.01，260nm处od值<0.01，具有更高的生物相容性，可达到较高的质量水平，有利于提高透明质酸钠在皮肤保湿、细胞保护、口服等方面的应用效果。
31.3、本发明提供的全分子量透明质酸钠的制备方法，将紫外照射降解、超声降解置于高黏度透明质酸溶液过滤之前，大大降低了高黏度溶液过滤的难度，提高了制备效率及收率，提高了杂质去除效率。
32.4、本发明提供的全分子量透明质酸钠的制备方法，获得的高品质全分子量分布透明质酸钠，具备优越的智能补水保湿、抗炎及细胞保护等活性。
具体实施方式
33.为了更清楚的阐释本技术的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
34.实施例1：
35.该实施例提供了一种全分子量分布透明质酸钠的制备方法，具体包括如下步骤：
36.步骤1)：取分子量100万的食品级透明质酸钠原料1kg，均匀喷洒1％的双氧水50ml至透明质酸钠原料表面，采用300μw/cm2的剂量进行紫外照射60min；
37.步骤2)：将紫外照射后的透明质酸钠原料溶于水中，浓度为1％(w/v)，室温下搅拌，使其完全溶解；
38.步骤3)：采用2％的naoh溶液调节ph为10，然后置于10khz的超声下处理，超声处理时间15min；
39.步骤4)：配置浓度为1％(w/v)的100万透明质酸钠溶液，按添加比例60％(v/v)与上述处理后的透明质酸钠碱性溶液混合；
40.步骤5)：采用0.1％的硅藻土，45℃，搅拌，吸附处理30min，过滤；
41.步骤6)：采用2％稀盐酸溶液调ph 5.0后，用0.1％活性炭，45℃，搅拌，吸附处理30min，过滤；
42.步骤7)：采用纳滤膜系统对滤液进行浓缩，其中纳滤膜截留分子量300da，操作压力15bar，温度控制为40℃，得纳滤浓缩液，对其进行喷雾干燥，获得高品质全分子量分布透明质酸钠样品。
43.实施例2：
44.该实施例提供了一种全分子量分布透明质酸钠的制备方法，具体包括如下步骤：
45.步骤1)：取分子量120万的食品级透明质酸钠原料1kg，均匀喷洒3％的双氧水80ml至透明质酸钠物料表面，采用600μw/cm2的剂量进行紫外照射60min；
46.步骤2)：将紫外照射后的透明质酸钠原料溶于水中，浓度为3％(w/v)，室温下搅拌，使其完全溶解；
47.步骤3)：采用5％的naoh溶液调节ph为12，然后置于30khz的超声下处理，超声处理时间30min；
48.步骤4)：配置浓度为0.8％(v/v)的120万的透明质酸钠原料溶液，按添加比例40％与上述处理后的透明质酸钠碱性溶液混合；
49.步骤5)：采用0.2％的硅藻土，50℃，搅拌，吸附处理40min，过滤；
50.步骤6)：采用2％稀硫酸溶液调ph 5.0后，用0.3％活性炭，50℃，搅拌，吸附处理50min，过滤；
51.步骤7)：采用纳滤膜系统对滤液进行浓缩，其中纳滤膜截留分子量250da，操作压力20bar，温度控制为50℃，得纳滤浓缩液，对其进行喷雾干燥，获得高品质全分子量分布透明质酸钠样品。
52.实施例3：
53.该实施例提供了一种全分子量分布透明质酸钠的制备方法，具体包括如下步骤：
54.步骤1)：取分子量120万的化妆品级透明质酸钠原料1kg，均匀喷洒5％的双氧水80ml至透明质酸钠物料表面，采用900μw/cm2的剂量进行紫外照射60min；
55.步骤2)：将紫外照射后的透明质酸钠物料溶于水中，浓度为5％(w/v)，室温下搅拌，使其完全溶解；
56.步骤3)：采用5％(w/v)的naoh溶液调节ph为12，然后置于60khz的超声下处理，超声处理时间60min；
57.步骤4)：配置浓度为0.6％(w/v)的120万的高分子量透明质酸钠溶液，按添加比例40％(v/v)与上述处理后的透明质酸钠碱性溶液混合；
58.步骤5)：采用0.4％的硅藻土，55℃，搅拌，吸附处理40min，过滤；
59.步骤6)：采用2％稀硫酸溶液调ph 5.0后，用0.3％活性炭，55℃，搅拌，吸附处理50min，过滤；
60.步骤7)：采用纳滤膜系统对滤液进行浓缩，其中纳滤膜截留分子量200da，操作压力30bar，温度控制为50℃，得纳滤浓缩液，对其进行喷雾干燥，获得高品质全分子量分布透明质酸钠样品。
61.实施例4：
62.该实施例提供了一种全分子量分布透明质酸钠的制备方法，具体包括如下步骤：
63.步骤1)：取分子量140万的化妆品级透明质酸钠原料1kg，均匀喷洒5％的双氧水100ml至透明质酸钠物料表面，采用1200μw/cm2的剂量进行紫外照射60min；
64.步骤2)：将紫外照射后的透明质酸钠原料溶于水中，浓度为5％(w/v)，室温下搅拌，使其完全溶解；
65.步骤3)：采用6％的naoh溶液调节ph为12，然后置于90khz的超声下处理，超声处理时间60min；
66.步骤4)：配置浓度为0.3％(w/v)的140万高分子量透明质酸钠溶液，按添加比例30％(v/v)与上述处理后的透明质酸钠碱性溶液混合；
67.步骤5)：采用0.6％的硅藻土，55℃，搅拌，吸附处理60min，过滤；
68.步骤6)：采用2％稀硫酸溶液调ph 5.0后，用0.4％活性炭，55℃，搅拌，吸附处理60min，过滤；
69.步骤7)：采用纳滤膜系统对滤液进行浓缩，其中纳滤膜截留分子量200da，操作压力30bar，温度控制为50℃，得纳滤浓缩液，对其进行喷雾干燥，获得高品质全分子量分布透明质酸钠样品。
70.实施例5：
71.该实施例提供了一种全分子量分布透明质酸钠的制备方法，具体包括如下步骤：
72.步骤1)：取分子量150万的化妆品级透明质酸钠原料1kg，均匀喷洒5％的双氧水100ml至透明质酸钠物料表面，采用1500μw/cm2的剂量进行紫外照射60min；
73.步骤2)：将紫外照射后的透明质酸钠原料溶于水中，浓度为3％(w/v)，室温下搅拌，使其完全溶解；
74.步骤3)：采用5％的naoh溶液调节ph为12，然后置于90khz的超声下处理，超声处理时间60min；
75.步骤4)：配置浓度为0.3％(w/v)的150万高分子量透明质酸钠溶液，按添加比例20％(v/v)与上述处理后的透明质酸钠碱性溶液混合；
76.步骤5)：采用0.8％的硅藻土，55℃，搅拌，吸附处理30min，过滤；
77.步骤6)：采用2％稀硫酸溶液调ph 5.0后，用0.6％活性炭，55℃，搅拌，吸附处理30min，过滤；
78.步骤7)：采用纳滤膜系统对滤液进行浓缩，其中纳滤膜截留分子量300da，操作压力30bar，温度控制为50℃，得纳滤浓缩液，对其进行喷雾干燥，获得高品质全分子量分布透明质酸钠样品。
79.实施例6：
80.该实施例提供了一种全分子量分布透明质酸钠的制备方法，具体包括如下步骤：
81.步骤1)：取分子量200万的化妆品级透明质酸钠原料1kg，均匀喷洒5％的双氧水100ml至透明质酸钠物料表面，采用1500μw/cm2的剂量进行紫外照射60min；
82.步骤2)：将紫外照射后的透明质酸钠原料溶于水中，浓度为1％(w/v)，室温下搅拌，使其完全溶解；
83.步骤3)：采用5％的naoh溶液调节ph为12，然后置于100khz的超声下处理，超声处理时间60min；
84.步骤4)：配置浓度为0.1％(w/v)的200万高分子量透明质酸钠溶液，按添加比例30％(v/v)与上述处理后的透明质酸钠碱性溶液混合；
85.步骤5)：采用1％的硅藻土，55℃，搅拌，吸附处理50min，过滤；
86.步骤6)：采用2％稀硫酸溶液调ph 5.0后，用1％活性炭，55℃，搅拌，吸附处理50min，过滤；
87.步骤7)：采用纳滤膜系统对滤液进行浓缩，其中纳滤膜截留分子量300da，操作压力30bar，温度控制为50℃，得纳滤浓缩液，对其进行喷雾干燥，获得高品质全分子量分布透明质酸钠样品。
88.对比例1：
89.该对比例选取某商品化的市售透明质酸钠1号(化妆品级，重均分子量125万)。
90.对比例2：
91.该对比例选取某商品化的市售透明质酸钠2号(化妆品级，重均分子量10万)。
92.对比例3：
93.该对比例与实施例1的制备方法大致相同，区别仅在于，在步骤1)中只均匀喷洒1％的双氧水50ml，而不进行紫外照射，并且在采用活性炭吸附后不再使用纳滤膜系统对滤液进行过滤浓缩。
94.对比例4：
95.该对比例与实施例1的制备方法大致相同，区别仅在于，在步骤1)中只采用300μw/cm2的剂量进行紫外照射60min，而不使用双氧水处理，并且在采用活性炭吸附后不再使用纳滤膜系统对滤液进行过滤浓缩。
96.对比例5：
97.该对比例分别将单独的重均分子量200万的高分子量透明质酸钠、重均分子量100万的透明质酸钠、重均分子量30万的低分子量透明质酸钠和重均分子量小于1万的寡聚透明质酸钠按照1:1:1:1的质量比进行混合搅拌60min，获得透明质酸钠样品。
98.实施例7：
99.对上述实施例1
‑
6以及对比例3
‑
5获得的不同透明质酸钠进行不同位置取样，测定均匀性和稳定性，在25℃下采用ndj
‑
1型旋转黏度计3号转子，60r/min分别对1％的不同透明质酸钠溶液进行黏度测定。各样品分别于制备后4℃保存，并于6个月后取样检测黏度。结果如表1所示，实施例1～6获得的透明质酸钠外观均匀，稳定性好；而对比例3和对比例4获得的透明质酸钠外观较为均匀，但稳定性稍差，并且黏度较大，过滤效率低，且难以使用纳滤膜系统进行过滤，对比例5获得的透明质酸钠均匀性和稳定性均较差。
100.表1透明质酸钠均匀度和稳定性检测结果
[0101][0102]
实施例8：
[0103]
对上述实施例和对比例所得透明质酸钠样品进行分子量分布测定，其中，重均分子量mw分别在0.2万～1万、1万～30万、30万～100万、＞100万之间的透明质酸钠分子占比如表2所示。
[0104]
表2透明质酸钠分子量分布检测结果
[0105][0106]
由表2中的数据可知，与市售不同分子量规格透明质酸钠比较，实施例1～6所得透明质酸钠原料分子量分布范围较宽，分子量分散系数mw/mn在5以上。对比例3和对比例4的分子量分布范围较窄，分子量分散系数在2.5以下，由此可见，单独使用紫外照射或双氧水处理的效果并不理想。
[0107]
实施例9：
[0108]
分别采用鲎试剂检测法、folin酚法对上述实施例1～6所制备的透明质酸钠的内毒素和杂蛋白进行检测，所得结果如表3所示：
[0109]
表3透明质酸质量检查结果
[0110]
示例内毒素(eu)杂蛋白实施例10.045<0.01％实施例20.031<0.01％实施例30.043<0.01％实施例40.032<0.01％实施例50.026<0.01％实施例60.028<0.01％对比例10.1320.09对比例20.1260.08对比例30.1250.08对比例40.1130.07对比例50.1420.11
[0111]
由表3中的结果可知，采用实施例1～6的制备方法获得的透明质酸的内毒素含量<0.01eu，蛋白质含量<0.01％，并测得280nm处od值<0.01，260nm处od值<0.01，具有更高的生物相容性和较高的质量水平。
[0112]
实施例10：
[0113]
选择有效受试志愿者45名，年龄在20～55岁，受试部位前2～3d不能使用任何产品，包括化妆品和外用药品等。试验前，受试者统一清洁双手前臂内侧，对4
×
4cm测试区域
做好标记，配方1～8样品(分别为实施例1～6全分子量透明质酸钠1％，配方7为市售120万透明质酸钠1％，配方8为对比例5透明质酸钠1％，配方中其余成分为甘油2％，丁二醇2％)，均匀涂布随机分布在左右侧手臂上，用量3mg/cm2，用皮肤水分测试仪测试产品涂抹前及涂抹后30min、1h、3h、6h时受试皮肤区域的含水量，每个区域平行测定5次，以平均值作为测试者，同一受试者的测试由同一测定人员完成，所有测试者测试前后处于温湿度恒定的室内空间。皮肤水分增加量(％)＝(涂抹后含水量
‑
涂抹前含水量)/涂抹前含水量
×
100％。
[0114]
表4透明质酸对皮肤水分的影响
[0115] 30min1h3h6h配方132.2
±
1.9831.6
±
1.4525.0
±
1.6719.6
±
1.86配方233.3
±
2.1232.3
±
2.1227.8
±
2.0120.1
±
2.02配方332.3
±
1.2431.3
±
21.328.3
±
2.0821.3
±
1.39配方433.2
±
1.5332.6
±
1.8529.6
±
1.7521.8
±
0.98配方532.3
±
2.1231.4
±
1.8628.7
±
1.7821.4
±
1.57配方632.2
±
2.3231.4
±
2.3129.3
±
1.8222.6
±
1.68配方727.1
±
1.3525.2
±
1.6221.4
±
1.2516.7
±
1.72配方830.1
±
1.3028.1
±
1.4122.5
±
1.2817.2
±
1.56
[0116]
由表3中的结果可知，本发明制备的全分子量透明质酸钠的保湿性能优越，且优于市售透明质酸钠产品，用于化妆品可发挥较好的保湿效果。
[0117]
实施例11
[0118]
以白细胞介素il
‑
1β诱导人永生化表皮细胞(hacat)的炎症反应为模型验证本发明制备的全分子量分布的透明质酸钠具有抗炎效果。
[0119]
将人永生化表皮细胞(hacat)以5
×
103cells/ml，每孔100μl接种于96孔板中，每组设6个复孔，培养24h后更换含10ng/ml白细胞介素il
‑
1β与20mg/ml本发明全分子量透明质酸钠(实施例1～6)及对照例透明质酸钠(对照例1～5)的培养基，以不加il
‑
1β和透明质酸钠的细胞作为正常对照组，以只加入il
‑
1β不加入透明质酸钠的细胞作为模型对照组，继续培养24h后，用elisa试剂盒检测白细胞介素il
‑
1α以及肿瘤坏死因子tnf
‑
α的表达水平。
[0120]
表5透明质酸钠的抗炎效果
[0121]
[0122][0123]
由表5数据可以看出，不同实施例与对比例的透明质酸均能降低细胞il
‑
1α及tnf
‑
α的表达水平，都体现出了有一定的抗炎效果，而本发明的工艺所制备的全分子量分布透明质酸钠与对比例普通透明质酸钠相比，有更好的抗炎效果。
[0124]
实施例12
[0125]
以十二烷基硫酸钠(sds)诱导皮肤模型损伤作为模型验证本发明制备的全分子量分布透明质酸钠的抗细胞损伤及细胞修复效果。
[0126]
将episkin皮肤模型转移至12孔板中培养，培养24h后更换含0.5％(v/v)sds的培养基，孵育2h后，每孔直接加入等体积含1％(w/v)本发明全分子量透明质酸钠(实施例1～6)及对照例透明质酸钠(对照例1～5)的培养基，得到培养基含透明质酸钠的终浓度为0.5％(w/v)，以不加sds和透明质酸钠的细胞作为正常对照组，以只加入sds不加入透明质酸钠的细胞作为模型对照组，继续培养24h后，取出皮肤组织模型，以mtt法用酶标仪在570nm测吸光度值，组织细胞活性按如下公式计算：
[0127]
组织细胞活性(％)＝a
p(t)
/a
n
×
100％
[0128]
其中，a
p(t)
是阳性对照组或实验组的吸光度值；a
n
是阴性对照组的吸光度值，结果如下表：
[0129]
表6 sds与透明质酸作用于皮肤模型后的组织细胞活性
[0130][0131][0132]
由表6中数据可以看出，本发明所制备的全分子量分布透明质酸钠对sds诱导的
episkin皮肤模型损伤有很强的抑制作用，可有效促进损伤细胞的修复。本发明的工艺所制备的全分子量分布透明质酸钠与对比例普通透明质酸钠相比，有更好的促进细胞修复效果。
[0133]
以上所述仅为本技术的实施例而已，并不用于限制本技术。对于本领域技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的权利要求范围之内。