用于构建smallRNA文库的接头、试剂盒及smallRNA文库的构建方法与流程

用于构建small rna文库的接头、试剂盒及small rna文库的构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于构建small rna文库的接头、试剂盒及small rna文库的构建方法。


背景技术：

2.small rna主要指的是20
‑
30nt长的小rna，包括mirna、snrna、snorna、piwirna等，在基因调控中起到非常重要的作用。近年来，随着高通量测序技术的发展，small rna的种类、表达水平以及功能特点不断被挖掘出来。目前，标准的small rna建库可参考neb建库试剂盒(neb#e7300s)，以1μg总rna起始，首先进行3’端接头连接，随后用反转录引物与3’端接头杂交封闭，防止残留的3’端接头在5’端接头连接反应中产生非特异性二聚体；紧接着，进行5’端接头连接，再通过反转录合成cdna，在pcr扩增后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)，对文库区域进行切胶并回收纯化，得到最终上机文库。
3.现有技术的缺点是建库起始量高，一般以1μg起始，不适合稀有物种样本建库；反转录引物封闭不理想，导致5’端接头连接反应产生非特异性连接；pcr扩增过程中产生较多非特异性扩增，导致文库产率低；上机前需切胶回收纯化文库，制胶跑胶及切胶回收时间长，导致整体建库时间延长。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种用于构建small rna文库的接头、试剂盒及small rna文库的构建方法，以解决现有技术中small rna建库起始量过高的技术问题。
5.为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于构建small rna文库的接头。该接头包括3’端接头，3’端接头为seq id no：1所示的随机末端接头，其中，n表示随机碱基；3’端接头的5’末端连接一个rapp，3’末端连接一个封闭基团，5’末端的第二位碱基修饰有mp。
6.进一步地，接头还包括5’端接头，5’端接头为seq id no：2所示的末端接头，5’端接头的3’末端具有2’ome修饰。
7.根据本发明的另一个方面，提供一种用于构建small rna文库的试剂盒。该试剂盒包括上述接头。
8.进一步地，试剂盒还包括3’端接头连接体系试剂和5’端接头连接体系试剂，3’端接头连接体系试剂包括rnase抑制剂、截短型t4连接酶2、10％～30％peg8000和10％～30％dmso。
9.进一步地，5’端接头连接体系试剂包括1
×
t4 ligase1 buffer、rnase抑制剂、t4连接酶1和atp，其中，1
×
t4 ligase1 buffer包括50mm tris
‑
hcl、10mm mgcl2和1mm dtt，ph 7.5。
10.进一步地，试剂盒还包括如seq id no：3所示的反转录引物。
11.进一步地，试剂盒还包括如seq id no：4和seq id no：5所示的pcr扩增引物。
12.根据本发明的再一个方面，提供一种small rna文库的构建方法。该构建方法包括：获取small rna样本，采用上述任一种用于构建small rna文库的试剂盒进行small rna文库的构建。
13.进一步地，采用上述任一种用于构建small rna文库的试剂盒进行small rna文库的构建包括以下步骤：3’端接头连接：采用3’端接头连接体系试剂配制3’端接头连接混合液进行small rna和3’端接头连接，得到连接有3’端接头的small rna，其中，3’端接头连接混合液包括10u～40u rnase抑制剂、100u～300u截短型t4连接酶2或截短型t4连接酶2kq、10％～30％peg8000、10％～30％dmso和1
×
buffer；5’端接头连接：采用5’端接头连接体系试剂配制5’端接头连接混合液进行连接有3’端接头的small rna和5’端接头连接，得到连接有3’端接头和5’端接头的small rna，其中，5’端接头连接混合液包括1
×
t4 ligase1 buffer、10～40u rnase抑制剂、10u～30u t4连接酶1和1mm～20mm atp；反转录反应：采用seq id no：3所示的反转录引物对连接有3’端接头和5’端接头的small rna进行反转录，得到cdna；纯化cdna产物：使用磁珠进行纯化cdna，去除二聚体；pcr扩增并纯化：使用q5 mix进行文库扩增，扩增引物如seq id no：4和seq id no：5所示的pcr扩增引物；使用磁珠进行纯化。
14.进一步地，3’端接头连接的条件为20
‑
37℃孵育10分钟～2小时，优选1小时，65℃～85℃酶灭活，优选65℃；优选的，5’端接头连接的条件为25～28℃孵育10min～2小时，65～85℃酶灭活20min，4℃放置5min；优选的，pcr扩增的反应条件为：第一阶段：95℃，3min；第二阶段：98℃10s，65℃30s，72℃30s，共15个循环；第三阶段：72℃2min。
15.应用本发明的技术方案，3’端接头的mp修饰和5’端接头的2’ome修饰，能够有效的防止3’端接头和5’端接头连接，提高接头连接效率，降低建库的起始量。
附图说明
16.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
17.图1示出了根据本发明一实施例的建库流程示意图；
18.图2示出了实施例1中牛
‑
9文库检测峰图；
19.图3示出了实施例1中牛
‑
10文库检测峰图；
20.图4示出了实施例1中牛
‑
11文库检测峰图；
21.图5示出了实施例1中牛
‑
12文库检测峰图；
22.图6示出了实施例1中牛
‑
13文库检测峰图；
23.图7示出了实施例1中牛
‑
14文库检测峰图；
24.图8示出了实施例1中牛
‑
15文库检测峰图；
25.图9示出了实施例1中牛
‑
16文库检测峰图；
26.图10示出了实施例2中人
‑
1文库检测峰图；
27.图11示出了实施例2中人
‑
2文库检测峰图；
28.图12示出了实施例2中人
‑
3文库检测峰图；
29.图13示出了实施例2中人
‑
4文库检测峰图；
30.图14示出了实施例2中小鼠
‑
1文库检测峰图；
31.图15示出了实施例2中小鼠
‑
2文库检测峰图；
32.图16示出了实施例2中小鼠
‑
3文库检测峰图；以及
33.图17示出了实施例2中小鼠
‑
4文库检测峰图。
具体实施方式
34.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
35.针对现有技术中small rna建库起始量过高的技术问题，本发明提出了下列技术方案。
36.根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种用于构建small rna文库的接头。该接头包括3’端接头，3’端接头为seq id no：1所示的随机末端接头，其中，n表示随机碱基；3’端接头的5’末端连接一个rapp，3’末端连接一个封闭基团(封闭基团可以是ddc，nh2，spacer c12、spacer c6、spacer c3等)，5’末端的第二位碱基修饰有mp。
37.进一步地，接头还包括5’端接头，5’端接头为seq id no：2所示的末端接头，5’端接头的3’末端具有2’ome修饰。
38.其中，rapp为adenylation(腺苷化)；mp为methylphosphonate，甲基膦酸酯；2’ome为2
′‑
o
‑
methyl，2’甲氧基。3’端接头的mp修饰和5’端接头的2’ome修饰，能够有效的防止3’端接头和5’端接头连接，提高接头连接效率，降低建库的起始量。
39.为了操作的便捷，根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于构建small rna文库的试剂盒。该试剂盒包括上述接头。优选的，试剂盒还包括3’端接头连接体系试剂和5’端接头连接体系试剂，3’端接头连接体系试剂包括rnase抑制剂、截短型t4连接酶2、10％～30％peg8000、10％～30％dmso和1
×
buffer。其中，截短型t4连接酶2和1
×
buffer可以是neb建库试剂盒(neb#e7300s)中的试剂。
40.在本发明一典型的实施例中，5’端接头连接体系试剂包括1
×
t4 ligase1 buffer、rnase抑制剂、t4连接酶1和atp。其中，1
×
t4 ligase1 buffer和t4连接酶1可以是neb建库试剂盒(neb#e7300s)中的试剂。
41.优选的，试剂盒还包括如seq id no：3所示的反转录引物，此反转录引物反转效率高、特异性好。进一步地，试剂盒还包括如seq id no：4和seq id no：5所示的pcr扩增引物。此对扩增引物扩增效率高、特异性好。
42.根据本发明的再一个方面，提供一种small rna文库的构建方法。该构建方法包括：获取small rna样本，采用上述任一种用于构建small rna文库的试剂盒进行small rna文库的构建。因为3’端接头的mp修饰和5’端接头的2’ome修饰，能够有效的防止3’端接头和5’端接头连接，从而提高了接头连接效率，降低了建库的起始量。
43.优选的，采用上述任一种用于构建small rna文库的试剂盒进行small rna文库的构建包括以下步骤：3’端接头连接：采用3’端接头连接体系试剂配制3’端接头连接混合液进行small rna和3’端接头连接，得到连接有3’端接头的small rna，其中，3’端接头连接混合液包括10u～40u rnase抑制剂、100u～300u截短型t4连接酶2或截短型t4连接酶2kq(neb的t4 ligase 2truncated kq)、10％～30％peg8000、10％～30％dmso和1
×
buffer(例如，
可以是来自neb，t4 ligase2 truncated kit，通过稀释得到)；5’端接头连接：采用5’端接头连接体系试剂配制5’端接头连接混合液进行连接有3’端接头的small rna和5’端接头连接，得到连接有3’端接头和5’端接头的small rna，其中，5’端接头连接混合液包括1
×
t4 ligase1 buffer、10～40u rnase抑制剂、10u～30u t4连接酶1和1mm～20mm atp；反转录反应：采用seq id no：3所示的反转录引物对连接有3’端接头和5’端接头的small rna进行反转录，得到cdna；纯化cdna产物：使用磁珠进行纯化cdna，去除二聚体；pcr扩增并纯化：使用q5 mix进行文库扩增，扩增引物如seq id no：4和seq id no：5所示的pcr扩增引物；使用磁珠进行纯化。
44.上述接头连接体系配合本发明的3’端接头和5’端接头的连接，能够达到很好的技术效果。从而进一步提高接头连接效率，降低建库的起始量。另外，本发明不需要page胶回收，采用磁珠进行纯化，提高文库产率的同时缩短建库时间，即本发明提供了一种无胶化、低起始量(例如，以100ng总rna起始)的small rna建库方法。
45.为了进一步提高接头连接效率，优选的，3’端接头连接的条件为20
‑
37℃孵育1小时，65℃酶灭活；优选的，5’端接头连接的条件为25～28℃孵育10min～2小时，65～85℃酶灭活20min，4℃放置5min。在本发明一优选的实施例中，pcr扩增的反应条件为：第一阶段：95℃，3min；第二阶段：98℃10s，65℃30s，72℃30s，共15个循环；第三阶段：72℃2min。
46.在本发明一优选的实施方式中，3’端接头连接：使用含有随机碱基的修饰接头进行接头连接，反应液包括：20u rnase inhibitor，200u t4 ligase2 truncated，20％peg8000，20％dmso和1
×
buffer；反应条件：28℃孵育1小时，65℃酶灭活；5’端接头连接：使用含有随机碱基的修饰接头进行连接，反应液包括：1
×
t4 ligase1 buffer，20u rnase inhibitor，20u t4 ligase1，10mm atp等；反应条件：28℃孵育10min，65℃酶灭活20min，4℃放置5min；反转录合成cdna：使用hiscript iii enzyme mix进行反转录合成cdna，反应条件：25℃孵育5min，50℃孵育45min，85℃酶灭活5s；纯化cdna产物：使用0.4
×
和1.4
×
磁珠进行纯化，去除二聚体；
47.pcr扩增并纯化：使用q5 mix进行文库扩增，反应条件：第一阶段：95℃，3min；第二阶段：98℃10s，65℃30s，72℃30s，共15个循环；第三阶段：72℃2min；使用1.3
×
和1.8
×
组合的磁珠进行纯化。
48.下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。本发明中没有特别指明的试剂或方法均可以采用本领域的常规试剂或方法实现。
49.实施例1
50.建库流程参见图1。
51.本实施例中接头及引物信息如表1所示。
52.表1
[0053][0054]
基本操作步骤如下：
[0055]
1.3’端接头连接，反应混合液如下表2所示。
[0056]
表2
[0057][0058][0059]
取总rna样本，稀释至1μl(100ng)，在70℃保温2min。
[0060]
将1μl样本加入表2所示的混合液中，共10μl，反应条件见表3。
[0061]
表3
[0062]
温度时间28℃1h65℃20min4℃至少5min
[0063]
反应结束后立即进行下一步。
[0064]
2.5’端接头连接反应
[0065]
按下表4配制5’端接头连接反应液。
[0066]
表4
[0067][0068][0069]
注：连接前5’端接头在70℃保温2min。
[0070]
反应条件见表5。
[0071]
表5
[0072]
温度时间28℃10min65℃20min4℃至少5min
[0073]
反应结束后立即进行下一步反转录。
[0074]
3.反转录反应，采用诺唯赞hiscriptiii 1ststrand synthesis cdna kit进行。
[0075]
取出反转录试剂，室温溶解，冰上配制如下表6所示的体系：
[0076]
表6
[0077][0078]
65℃加热5min，迅速置于冰上聚冷，并在冰上静置2min。
[0079]
4.配置第一链cdna合成反应液，如表7所示：
[0080]
表7
[0081]
试剂体积上步混合液20μl10
×
rt mix2.5μlhiscript iii enzyme mix2.5μl总计25μl
[0082]
用移液器轻轻吹打混匀。
[0083]
按下列条件进行第一链cdna合成反应，条件见表8：
[0084]
表8
[0085]
25℃5min50℃45min85℃5sec
[0086]
5.磁珠片选(翌圣磁珠货号：12600es08)
[0087]
(1)将rt产物补水至50μl，添加20μl翌圣磁珠(0.4
×
)，混匀后，在室温下放置5分钟。在磁力架上静置5分钟直到上清液完全变清。
[0088]
(2)将整个澄清的上清液转移到新管中。向上清液中加入50μl珠子(最终1.4
×
)混匀，在室温下放置5分钟。在磁力架上静置5分钟，弃上清。
[0089]
(2)使用80％乙醇洗涤晾干后，使用24μl无核酸酶水洗脱。
[0090]
6.pcr扩增反应
[0091]
q5 mix(neb，m0492l)体系及程序见表9。
[0092]
表9
[0093]
试剂体积cdna样本(步骤5中无核酸酶水洗脱产物)23μlq5 mix buffer25μlf引物(seq id no：4)(10μm)1μlr引物(seq id no：5)(10μm)1μl总计50μl
[0094]
充分混匀上表9中的试剂，按照表10所示条件反应。
[0095]
表10
[0096][0097]
7.pcr产物使用全式金磁珠(ec411
‑
03)纯化100
‑
200bp片段(1.3
×→
1.8
×
)
[0098]
(1)向50μl pcr产物中添加65μl磁珠(1.3
×
)，轻轻吹打10次混匀，在室温下放置5min。在磁力架上静置5min。
[0099]
(2)将整个澄清的上清液转移到新管中。
[0100]
(3)向上清液中加入25μl珠子(最终1.8
×
)，轻轻吹打10次混匀，在室温下放置5min。在磁力架上静置5min。
[0101]
(4)进行洗涤和洗脱，用20μl无核酸酶水洗脱。
[0102]
本实施例对实验条件进行了细致的摸索，如：3’端接头浓度及连接反应条件，3’端接头是否封闭，5’端接头浓度和连接反应时间，反转录后二聚体去除纯化等，具体如下表11所示：
[0103]
表11
[0104]
[0105][0106]
表12
[0107][0108]
图2示出了牛
‑
9文库检测峰图，图3示出了牛
‑
10文库检测峰图，图4示出了牛
‑
11文库检测峰图，图5示出了牛
‑
12文库检测峰图，图6示出了牛
‑
13文库检测峰图，图7示出了牛
‑
14文库检测峰图，图8示出了牛
‑
15文库检测峰图，图9示出了牛
‑
16文库检测峰图。
[0109]
将牛
‑
15和牛
‑
16两个单独文库主峰的样本进行上机测序，分析结果如表12所示，q20、q30和mapping率等数据正常，成熟mirna和前体mirna的检出数正常，可见本发明方法可实现低起始量、无胶化建库。
[0110]
实施例2
[0111]
对比添加peg8000和dmso对实验结果的影响，本实施例列举了人、小鼠样本对两种试剂添加后建库的结果，如下表13所示：
[0112]
表13
[0113]
样本起始量(ng)peg8000浓度dmso浓度库检结果
人1500
‑‑
杂峰人250020％
‑
杂峰人3500
‑
20％杂峰人450020％20％文库峰小鼠1500
‑‑
文库峰小鼠250020％
‑
文库峰小鼠3500
‑
20％文库峰小鼠450020％20％文库峰
[0114]
图10示出了人
‑
1文库检测峰图，图11示出了人
‑
2文库检测峰图，图12示出了人
‑
3文库检测峰图，图13示出了人
‑
4文库检测峰图，图14示出了小鼠
‑
1文库检测峰图，图15示出了小鼠
‑
2文库检测峰图，图16示出了小鼠
‑
3文库检测峰图，以及图17示出了小鼠
‑
4文库检测峰图。
[0115]
实验结果显示，不同物种建库过程中添加peg8000和dmso导致文库结果存在显著差异，人样本建库在不添加、添加peg8000、添加dmso及同时添加两种试剂条件下对文库结果影响较大(结果见图10
‑
13)，而对小鼠样本的文库结果影响较小(结果见图14
‑
17)，对比小鼠1
‑
3和小鼠4的文库库检图可见，peg8000和dmso的同时添加对文库去除接头二聚体也有一定的正向作用；从人
‑
4和小鼠
‑
4样本的文库检测峰图可见，peg8000和dmso同时存在是不同物种稳定建库的重要条件，数据结果如下表14所示。由此可见，peg8000和dmso的同时添加在建库过程中可有效减少接头二聚体的形成，更有益于稳定建库。
[0116]
表14
[0117][0118]
实施例3
[0119]
针对大豆、人、鼠及水稻样本，分别使用neb试剂盒和实施例1中描述的方法进行建库，对比两种方法建库结果，如下表15所示：
[0120]
表15
[0121][0122]
neb试剂盒和实施例1方法的起始量分别为1000ng和100ng，两种方法建库的数据质量都很好，但是在成熟mirna和前体mirna的检测上，实施例1方法检测的数量相对较少，主要原因是建库起始量低，对部分极低表达的mirna检测存在困难；不同物种，相同测序深
度，覆盖范围存在差异。通过上述数据可见，本发明方法在数据质量和数据结果上与neb试剂盒高度一致，介于本发明方法低起始量和无胶化建库的特点，更适用于高通量产业化的生产。
[0123]
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：
[0124]
1)修饰的接头及优化后的连接反应条件可提高特异性连接效率，使建库起始量降低至100ng；
[0125]
2)利用磁珠纯化法去除非特异性连接产物反转录后的cdna二聚体，提高pcr扩增中特异性模板含量，进而提高文库产率；
[0126]
3)整个建库流程操作简单，无需制胶跑胶及切胶回收过程，8个小时内即可完成文库构建，较切胶回收建库法缩短0.5
‑
1天时间，提高建库通量并缩短建库时间，更适用于产业化模式的建库。
[0127]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。