茶树CsHAC1基因和蛋白及其应用的制作方法

茶树cshac1基因和蛋白及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，特别是涉及一种茶树cshac1基因和蛋白及其应用。


背景技术：

2.茶树起源于我国，在我国有着悠久的种植历史，是我国重要的经济作物之一。茶叶加工而成的“茶”因其独特风味备受喜爱，它不仅对中国人的健康、医药、文化、贸易等都产生巨大的影响，而且在世界众多人的日常生活中也发挥着重要的作用，茶树已经成为了许多地区重要的栽培作物。
3.茶树在生长周期中经常受到来自各种不良环境的影响，导致茶叶的产量和品质下降，严重时甚至会导致茶树死亡。茶树抗逆研究迫在眉睫。因此，通过生物技术手段筛选茶树潜在的抗性基因，对提高茶树逆境胁迫下的耐受能力、选育出新型抗逆茶树品种具有重要的意义。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的之一是提供一种茶树cshac1基因和其编码的蛋白在提高植物抗逆性中的应用，该基因和其编码的蛋白具有提高植物抗逆性的功能。
5.实现上述发明目的的具体技术方案如下：
6.一种茶树cshac1基因在提高植物抗逆性中的应用，所述茶树cshac1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；或为如seq id no.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个核苷酸，且能编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；或为编码氨基酸序列为seq id no.2所示的核苷酸序列。
7.在其中一些实施例中，所述抗逆性为对过氧化氢和/或氯化钠胁迫的耐受性。
8.在其中一些实施例中，所述植物为茶树、大豆、小麦、水稻或拟南芥。
9.一种茶树cshac1基因编码的蛋白在提高植物抗逆性中的应用，所述茶树cshac1基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；或如seq id no.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一个或多个氨基酸，但蛋白活性相同。
10.在其中一些实施例中，所述抗逆性为对过氧化氢和/或氯化钠胁迫的耐受性。
11.在其中一些实施例中，所述植物为茶树、大豆、小麦、水稻或拟南芥。
12.本发明的另一目的在于提供一种重组表达载体pcambia1300(m)
‑
cshac1在提高植物抗逆性中的应用。
13.实现上述发明目的的具体技术方案如下：
14.一种重组表达载体pcambia1300(m)
‑
cshac1在提高植物抗逆性中的应用，所述重组表达载体上插入有茶树cshac1基因，或插入可用于表达上述茶树cshac1基因编码的蛋白的基因。
15.在其中一些实施例中，所述抗逆性为对过氧化氢和/或氯化钠胁迫的耐受性。
16.在其中一些实施例中，所述植物为茶树、大豆、小麦、水稻或拟南芥。
17.本发明的另一目的在于提供一种酿酒酵母重组表达载体在提高酵母抗逆性中的应用。
18.实现上述发明目的的具体技术方案如下：
19.一种酿酒酵母重组表达载体在提高酿酒酵母抗逆性中的应用，所述酿酒酵母重组表达载体上插入有上述茶树cshac1基因，或插入有可用于表达上述茶树cshac1基因编码的蛋白的基因。
20.在其中一些实施例中，所述酿酒酵母重组表达载体为pyes2
‑
cshac1。
21.在其中一些实施例中，所述抗逆性为对过氧化氢和/或氯化钠胁迫的耐受性。
22.本发明还提供了一种提高植物抗逆性的方法。
23.一种提高植物抗逆性的方法，所述方法包括提高上述茶树cshac1基因在植物中的表达。
24.在其中一些实施例中，所述抗逆性为对过氧化氢和/或氯化钠胁迫的耐受性。
25.在其中一些实施例中，所述植物为茶树、大豆、小麦、水稻或拟南芥。
26.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
27.本发明从茶树中克隆得到茶树cshac1基因，并构建得到插入了茶树cshac1基因的酿酒酵母重组表达载体，将该重组表达载体转化进入酿酒酵母中，通过半乳糖诱导该基因在酿酒酵母中的超表达，能够提高酿酒酵母对h2o2和nacl胁迫的耐受性，证明该基因可以提高酿酒酵母对过氧化氢和/或氯化钠胁迫的耐受性，因此，本发明的茶树cshac1基因及其编码的蛋白为后续利用基因工程技术培育抗逆茶树提供理论研究基础，对培育抗逆优良茶树品种具有重大的应用价值。
附图说明
28.图1为本发明实施例1中pcr扩增的茶树cshac1基因片段；其中：m：dna分子量标准；cshac1：扩增的cshac1片段；
29.图2为本发明实施例1中构建得到的酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1；
30.图3为本发明实施例2中转化超表达cshac1基因的转基因酵母能够提高酵母对氧化胁迫的耐受性；
31.图4为本发明实施例3中转化超表达cshac1基因的转基因酵母能够提高酵母对盐胁迫的耐受性。
具体实施方式
32.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
33.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
34.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
35.为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
36.在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
37.此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
38.本发明中的cshac1基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其所编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
39.seq id no.1
40.atgaatgtgcaggtacatatgtcaggacaaatctcaggacaggtacctaatcaagcaggcactcagttgcctggattacctccccagaatggaagttctctctctaaccatatacaaaatttagctggtcagtgtaatacactgaatatggagcctgagctagcgaaagctcgcagatttatgcaagagaaaatctatgattttcttatgcagcggcagcagcaaactaatgatataccaccaacgcgggttctggaaattgtaagacgcctagacgagggtctattcagaaatgctgccactaaggaggagtatgtgaacctggagactttggagaatcgtttacgtgttgtgattgagagtttaccaatgagtactcacaaccaaaaatatccgcaccttgttaatgctccctctcctattgagcctgagctagcgaaagctcgcagatttatgcaagagaaaatctatgattttcttatgcagcggcagcagcgaactaatgatataccaccaaagcgggttctggaaattgtaagacgcctagacgagggtctattcagaaatgctgccactaaggaggagtatttgaacctggagactttggagaatcgtttacatgttttgattaagcgtttaccaatgagtactcacaaccaacaatatccgcgccttgttaatgctccttctcctattggtacaatgataccaaccccagatagtgcgaattcaagcgtgatggttgcatcggctgtagatacttccatgattgctaccggtggtggtaatagcatgccatctgtggctgtcaatactggaagcttactacctcctgctaatgggtcgtctgttgggatacatggtggttctttcaattctcaagtaccagcgaactttttgcatgagcagaatattcaagaggaattccatcagagaatagctgtgcaagatgaagctcagctgagcagaatattcaagaggcattccatcagagaataa
41.seq id no.2
42.mnvqvhmsgqisgqvpnqagtqlpglppqngsslsnhiqnlagqcntlnmepelakarrfmqekiydflmqrqqqtndipptrvleivrrldeglfrnaatkeeyvnletlenrlrvvieslpmsthnqkyphlvnapspiepelakarrfmqekiydflmqrqqrtndippkrvleivrrldeglfrnaatkeeylnletlenrlhvlikrlpmsthnqqyprlvnapspigtmiptpdsanssvmvasavdtsmiatgggnsmpsvavntgsllppangssvgihggsfnsqvpanflheqniqeefhqriavqdeaqlsrifkrhsire
43.应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对以下实施例中涉及到的碱基序列进行修改，也属于本发明的保护范围。
44.以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。
45.实施例1茶树cshac1基因的克隆及酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1的构建
46.取茶树“英红9号”组织，利用北京华越洋生物科技有限公司的plant rnakit超快型植物rna提取试剂盒提取茶树总rna，并用mightyscript第一链cdna合成master mix进行逆转录成cdna。以cdna为模板，设计酵母表达载体pyes2同源重组引物(引物序列大写部分为pyes2载体同源片段，小写部分为cshac1基因特异性扩增引物)
47.pyes2
‑
cshac1/f(seq id no.3)
[0048]5’‑
taccgagctcggatccatgaatgtgcaggtacatatgtcaggac
‑3’
[0049]
pyes2
‑
cshac1/r(seq id no.4)
[0050]5’‑
tagatgcatgctcgagttattctctgatggaatgcctcttgaatattctgctcag
‑3’
[0051]
采用东洋纺生物科技有限公司的kod酶pcr扩增cshac1基因的cdna阅读框全长，pcr体系参考该酶说明书。扩增得到的dna片段依照magen公司hipure gel pure dnamini kit琼脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书进行回收，测序(图1)。回收得到的片段用于插入至酵母表达载体pyes2中。
[0052]
酿酒酵母表达载体pyes2经bamh i和xho i双酶切处理，回收线性化载体。回收后的cshac1片段和线性化pyes2载体经南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpressⅱone step cloning kit进行dna片段和载体的同源重组连接。按照说明书的方法将反应产物转化大肠杆菌感受态dh5
ɑ
。挑取单克隆进行菌落pcr鉴定后，挑取阳性菌落扩大培养提取质粒，经测序鉴定正确，构建得到酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1(图2)，保存质粒备用。经测序分析后，cshac1的核苷酸序列如seq id no.1所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0053]
实施例2酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1对酿酒酵母h2o2胁迫的耐受性检测
[0054]
培养酿酒酵母氧化敏感型菌株skn7δ、yap1δ(实验室保存)及其对应的野生型酵母株系by4741(实验室保存)，将pyes2空载体和酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1质粒转化到上述酵母菌株中。
[0055]
酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如下：
[0056]
1)取出
‑
80℃保存的氧化敏感营养缺陷型酵母菌株skn7δ、yap1δ和野生型酵母株系by4741，在ypd培养基平板上划线，放置于30℃恒温培养箱倒置培养。
[0057]
2)挑取单菌落到10mlypd液体培养基中，30℃恒温摇床(200rpm)培养；
[0058]
3)将过夜培养的酵母母液转移到20mlypd液体培养基中，调整浓度使od
600
为0.2
‑
0.3，置于30℃恒温摇床培养至od
600
为0.4
‑
0.6。
[0059]
4)将酵母菌液转移至离心管中，3000rpm离心5分钟，弃去培养基。
[0060]
5)用20ml灭菌水重悬菌体，3000rpm离心5分钟，弃去上清液。
[0061]
6)往菌体沉淀中加入适量的te/liac溶液(按一个菌种所需转化的质粒数
×
100μl)，轻弹管壁使菌体沉淀悬浮。此时酵母细胞为感受态状态，需小心操作避免损伤细胞。
[0062]
7)煮沸鲑鱼精dna 5分钟，4℃冷却3分钟。准备好灭菌的1.5ml离心管，开始加样。
[0063][0064]
加好后反复颠倒混匀几次，于30℃恒温摇床(250rpm)培养30分钟。
[0065]
8)42℃热激15分钟后，4℃放置5分钟，室温6000rpm离心30秒，弃上清，再空离30秒，用移液枪吸干peg，用70μl的1
×
te重悬。
[0066]
9)将上述含有目的质粒的氧化敏感型酵母菌涂在添加了相应氨基酸的ynb培养基平板上(by4741、skn7δ、yap1δ生长的ynb培养基添加有组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸)，于30℃倒置培养3天，直到出现转化子。
[0067]
分别挑取转入了pyes2空载体的skn7δ、yap1δ和by4741酵母单克隆以及转入了酿酒酵母pyes2
‑
cshac1重组质粒的skn7δ、和yap1δ酵母单克隆，接种于600μl含相应酵母菌种所需氨基酸的ynb液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)培养2
‑
3天，培养至菌液浑浊。以ynb液体培养基调零，用无菌水稀释将酵母菌液od
600
值调到1.0(
±
0.05)，将菌液按照1：1、1:10、1:100、1:1000逐级稀释(图3中，每个浓度的h2o2平板上，从左到右，依次代表1：1、1:10、1:100、1:1000)。吸取2.5μl各浓度skn7δ、yap1δ、by4741菌液分别滴至添加0mmol/l、0.5mmol/l、0.75mmol/l、1mmol/l h2o2溶液的ynb固体培养基平板上。30℃恒温培养箱培养7天，观察酵母生长情况。
[0068]
结果如图3所示，转化超表达cshac1基因的转基因酵母(即pyes2
‑
cshac1重组质粒)的skn7δ和yap1δ酵母突变株，能够在添加0.5mm、0.75mm和1mm h2o2的ynb培养基中生长，而转化未表达cshac1基因的酵母(即空载体pyes2)的skn7δ和yap1δ酵母突变株，则在添加0.5mm、0.75mm h2o2的ynb培养基中生长微弱，几乎不能生长，在添加1mm h2o2的ynb培养基中几乎不能生长。
[0069]
以上结果表明：茶树cshac1基因能够提高酿酒酵母氧化敏感型菌株skn7δ、yap1δ对氧化胁迫的耐受性。
[0070]
实施例3酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1对酿酒酵母盐胁迫的耐受性检测
[0071]
培养酿酒酵母盐敏感型菌株axt3(实验室保存)及其对应的野生型酵母株w303(实验室保存)，将pyes2空载体和酿酒酵母重组表达质粒pyes2
‑
cshac1转化到上述酵母菌株中。
[0072]
酵母转化采用的方法为醋酸锂转化法，具体步骤如实施例2所示。
[0073]
将含有目的质粒(酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1)的敏感型酵母菌axt3及w303涂在添加了相应氨基酸的ynb培养基平板上(axt3生长的ynb培养基添加有腺嘌呤；w303生长的ynb培养基添加有组氨酸、亮氨酸、色氨酸、腺嘌呤)，于30℃倒置培养3天，直到出现转化子。
[0074]
分别挑取转入了pyes2空载体的axt3、w303酵母单克隆以及转入了pyes2
‑
cshac1重组质粒的axt3、w303酵母单克隆，接种于600μl含相应酵母菌种所需氨基酸的ynb液体培养基中，于30℃恒温摇床(200rpm)培养2
‑
3天，培养至菌液浑浊。以ynb液体培养基调零，用无菌水稀释将酵母菌液od
600
值调到1.0(
±
0.05)，将菌液按照1：1、1:10、1:100、1:1000逐级稀释(图4中，每个浓度的nacl溶液下，从左到右，依次代表1：1、1:10、1:100、1:1000)。吸取2.5μl逐级稀释的axt3菌液分别滴至添加0mmol/l、50mmol/l、75mmol/l、100mmol/lnacl溶液的ynb固体培养基平板上；吸取2.5μl逐级稀释的w303菌液分别滴至添加0mol/l、0.5mol/l、0.75mol/l、1mol/lnacl溶液的ynb固体培养基平板上。30℃恒温培养箱培养7天，观察酵母生长情况。
[0075]
结果如图4所示。在添加了1mol/l nacl的培养基平板上，转入超表达茶树cshac1基因(即转入了酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1)的转基因酵母w303在浓度为1：1和1：10能够生长；而转入未表达茶树cshac1基因(即转入了pyes2空载体)的酵母菌株w303仅在1：1浓度的情况下才能生长。
[0076]
同样，转入超表达茶树cshac1基因(即转入了酿酒酵母重组表达载体pyes2
‑
cshac1)的转基因酵母的axt3酵母突变株，在添加1mmol/lnacl的培养基平板上浓度为1和1：10的菌液能够生长，浓度为1：100的菌液也有少量生长；而转入未表达茶树cshac1基因(即转入了pyes2空载体)的axt3酵母突变株生长较差，仅有最高浓度菌液(1:1)才能够生长。在其他添加了nacl的培养基平板上均表现出转入了重组质粒的酵母菌株比转入空载体的酵母长势好的情况。
[0077]
以上结果表明茶树cshac1基因能够提高酿酒酵母盐敏感突变株axt3对盐胁迫的耐受性。
[0078]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0079]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。