一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用的制作方法

技术特征：
1.一种用于筛选克氏原螯虾crustin基因snp位点的引物，其特征在于，所述引物的dna序列如下所示：正向引物cru
‑
f：5
‘‑
ggggacacacatcctgaggacc
‑3’
，反向引物cru
‑
r：5
‘‑
tgaaca agcgagccaacaacc
‑3’
；pcr反应体系：10μl 2
×
pcr mix，crustin正向引物和反向引物各1μl，克氏原螯虾cdna(200ng/μl)1μl，超纯水7μl；pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；4℃保存；将pcr产物进行测序，经过比对后确定克氏原螯虾crustin基因存在5个snp位点，所述位点分别位于以起始密码子atg为初始编号的第46，67，146，151和271位碱基。2.一种用于筛选克氏原螯虾alf基因snp位点的引物，其特征在于，所述引物的dna序列如下所示：正向引物alf
‑
f：5
‘‑
atgcagccgtgccaggctcaggt
‑3’
，反向引物alf
‑
r：5
‘‑
ctattgcttgagccaagct
‑3’
；pcr反应体系：10μl 2
×
pcr mix，alf的正向引物和反向引物各1μl，克氏原螯虾cdna(200ng/μl)1μl，超纯水7μl；pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；4℃保存；将pcr产物进行测序，经过比对后确定克氏原螯虾alf基因存在4个snp位点，所述位点分别位于以起始密码子atg为初始编号的第106，110，149和179位碱基。3.一种筛选克氏原螯虾优良抗病能力snp基因型的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)分别提取每个个体克氏原螯虾的血淋巴rna，具体步骤如下所述：使用1ml注射器从克氏原螯虾虾体内抽取390
‑
400μl血液样品，按体积比为1：1与acd抗凝剂，其配方为0.48g柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖，溶于100ml双蒸水；混合至400μl，置于ep管中，并置于冰上；在800
×
g，4℃，离心20min离心，分离血细胞；弃上清，保留白色沉淀，加入预冷的trizol试剂200μl，使用研磨器研磨至白色沉淀消失，使trizol溶液呈粉色，每个样品再次加入800μl trizol试剂；在室温下静置5min，然后在4℃，12000
×
g离心10min；取上清900μl置于新的ep管中，加入200μl氯仿，在振荡条件下充分混匀，不要涡旋震荡，前后晃动15s左右，室温下静置5min；在4℃，12000
×
g，离心10min；离心后溶液呈现三层，用枪头置于液面以下小心吸取上层清液400μl；加入等量异丙醇至400μl，轻柔混匀，在室温下静置5min；在4℃，12000
×
g，离心15min，直到观察到白色沉淀；去上清，不要吸走沉淀，若无沉淀留少量溶液，加入depc水配置的1ml 75％浓度的乙醇，重悬；在4℃，8000
×
g，离心5min，去上清；吸干溶液，将ep管置于通风橱内晾干2
‑
5min；(2)使用反转录试剂盒反转录得到cdna，具体步骤为：将8μl rna溶液，2μl 5
×
fastking
‑
rt supermix，加10μl ddh2o混合于pcr管中，放入pcr仪，于42℃15min，随后95℃，3min；(3)设计引物：根据ncbi核酸数据库数据，利用primer5软件设计引物：cru
‑
f：5
‘‑
ggggacacacatcctgaggacc
‑3’
，
cru
‑
r：5
‘‑
tgaaca agcgagccaacaacc
‑3’
；以及alf
‑
f：5
‘‑
atgcagccgtgccaggctcaggt
‑3’
，alf
‑
r：5
‘‑
ctattgcttgagccaagct
‑3’
；(4)对不同克氏原螯虾个体的cdna样本进行pcr检测，具体步骤如下：利用正向引物cru
‑
f，反向引物cru
‑
r，正向引物alf
‑
f和反向引物alf
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r扩增目的片段，利用琼脂糖凝胶电泳检测片段完整性；pcr条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s；50℃退火30s；72℃延伸30s；35次循环后，在72℃再延伸10min；于4℃保存；(5)将pcr产物送测序公司进行测序，根据测序公司返回的具体序列信息后，利用软件sequencher比对各个个体间抗病基因的序列差异，筛选得到snp位点；(6)参与检测的克氏原螯虾个体数量为176尾，其中雌性克氏原螯虾75尾，雄性克氏原螯虾101尾，经检测确定抗病基因alf共有4个snp位点，共2种基因型；经检测确定抗病基因crustin共有5个snp位点，10种基因型，其中四种基因型基因频率极低，故舍弃。(7)从90只克氏原螯虾为样本，接种抽取500μl血淋巴，提取rna，之后对每只克氏原螯虾接种病菌副溶血弧菌，具体接种步骤如下：使用lb培养基培养副溶血弧菌，使其数量达到108个/毫升，取两毫升菌液，使用离心机以5000
×
g离心5min，弃上清，使用1ml ddh2o重悬沉淀，在每只克氏原螯虾于第5步足关节处，使用1ml无菌注射器缓慢推入200μl重悬液；(8)对接种副溶血弧菌后的每只克氏原螯虾进行标记，并记录其死亡时间；(9)检测每只接种副溶血弧菌后的克氏原螯螯虾alf基因和crustin的基因型，并与存活时间形成对应；根据存活时间筛选不同基因型抗病能力差异；通过归纳和总结，筛选抗病能力最强的基因型组合；经过分析得出在两种基因crustin和alf的共同作用下拥有基因型cru
‑4‑
alf
‑
1的抗病效果为最优。4.如权利要求3所述的筛选克氏原螯虾优良抗病能力snp基因型的方法，其特征在于，筛选目的基因snp时克氏原螯虾采样量最少为120尾，雌性与雄性各60尾；验证snp基因型抗病能力时，克氏原螯虾个体数最少为90尾，雌雄各45尾。5.权利要求1或2所述的crustin基因snp位点的引物和/或alf基因snp位点的引物在crustin基因和alf基因的抗病基因型分型中的应用。6.权利要求3或4所述的方法在crustin基因和alf基因的抗病基因型分型中的应用。

技术总结
本发明属于水产养殖分子标记筛选技术领域。具体涉及一种提高克氏原螯虾抗病能力的SNP分子标记及应用。发明的特征为：分别提取随机收集的克氏原螯虾RNA，通过反转录获得其cDNA。根据克氏原螯虾抗病基因Crustin基因和ALF基因序列设计引物组合，利用引物组合对克氏原螯虾cDNA样本进行PCR扩增并得到目的片段，利用琼脂糖胶电泳检测并确认目的片段被扩增出。进一步通过一代测序手段获得其cDNA序列并进行序列比对，鉴定克氏原螯虾群体中Crustin和AFL基因编码区中的SNP位点，对两基因及其组合进行分型；比较各基因型之间抗病能力的差异，筛选得到抗病能力最强的基因型及其组合标记引物。可用于辅助选择。可用于辅助选择。


技术研发人员：白旭峰 任鑫 彭国辉 谭云飞 彭波
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2021.07.13
技术公布日：2021/10/15