一种外周血含有CIK细胞的培养方法与流程

一种外周血含有cik细胞的培养方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种外周血含有cik细胞的培养方法。


背景技术：

2.cik(cytokine
‑
induced killer cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有t淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有nk细胞(自然杀伤细胞)的非mhc(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。cik细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
3.目前，cik细胞的常用活化方法是将分离得到的外周血单个核细胞采用cd28单克隆抗体、白细胞介素
‑
1(il
‑
1α)，白细胞介素
‑
2(il
‑
2)以及γ
‑
干扰素(英文名称ifn
‑
γ)等因子进行活化，进一步长期培养法采用静态和间歇换液的方式进行扩增，然而普遍存在激活效率低、培养周期长及因营养物耗竭或毒副产物积累而限制细胞生长的现象，细胞扩增效果难以满足临床需要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种外周血含有cik细胞的培养方法，用以解决目前cik细胞的培养方法培养出来的cik细胞繁殖能力差、细胞毒活性低的技术问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种外周血含有cik细胞的培养方法，包括以下步骤：
7.步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养：在无菌环境下，采集患者或志愿者的外周血，并加入肝素钠，用淋巴分离液一次离心分离出单个核细胞；用毛细血管吸取单个核细胞层，然后用生理盐水洗涤、二次离心，纯化，重复2
‑
3次；再用培养基a悬浮并调整细胞密度为4
×
106/l，并将此培养基a接种于30cm2的培养瓶中，然后培养瓶置于37℃，5％co2培养箱中97
‑
100％湿度培养24h后收集细胞，进行三次离心，弃上清，获得培养后的单个核细胞；
8.步骤2、cik细胞的培养：将步骤1获得的培养后的单个核细胞用活化培养基b悬浮并调整细胞密度为1.8
×
106/l，并将此活化培养基b接种于180cm2的已包被cd28抗体的培养瓶中，并置于37℃，5％co2培养箱中97
‑
100％湿度培养，24小时后，依次加入il
‑
15和il
‑
21，继续培养，每1
‑
2天半量换取扩增培养基c，维持细胞密度为1.8
×
106/ml，培养至需要数量。
9.进一步地，步骤1中一次离心的离心条件为离心力为260xg，离心18min，温度为13
‑
18℃，二次离心的离心条件为离心力为300xg，离心23min，温度为20
‑
23℃，三次离心的离心条件为离心力为250xg，离心17min，温度为17
‑
22℃。
10.进一步地，步骤1中培养基a为培养基干粉、l
‑
谷氨酰胺、碱性成纤维细胞生长因子、维生素c、alk抑制剂、gsk
‑
3抑制剂、胰岛素、人血浆白蛋白、碳酸氢胺混合形成，其中，l
‑
谷氨酰胺的浓度为0.5
‑
1.5g/l、碱性成纤维细胞生长因子的浓度为0.2
‑
0.6mg/l、维生素c的浓度为12
‑
18mg/l、alk抑制剂的浓度为1
‑
5ug/l、gsk
‑
3抑制剂的浓度为1
‑
5ug/l、胰岛素
的浓度为6
‑
9mg/l、人血浆白蛋白的浓度为1
‑
5g/l、碳酸氢铵的浓度为5
‑
15g/l。
11.进一步地，步骤2中活化培养基b为向培养基a中加入il
‑
2、il
‑
1α和ifn
‑
γ形成的，且il
‑
2的浓度为5
×
104‑1×
105u/l，il
‑
1α的浓度为5
×
104‑1×
105u/l，ifn
‑
γ的浓度为2
×
105‑2×
106u/l，已包被cd28抗体的培养瓶为用包被液包被于培养瓶底部，在14℃孵育70min形成的，其中，包被液为cd28单克隆抗体和ifn
‑
γ溶于pbs缓冲溶液配制而成，且cd28的浓度为1
×
105‑1×
106u/l，ifn
‑
γ的浓度为2
×
105‑2×
106u/l。
12.进一步地，步骤2中il
‑
15、il
‑
21加入后占培养液的浓度分别为16
‑
19μg/l和7
‑
9μg/l。
13.进一步地，步骤2中活化培养基c为向培养基a中加入il
‑
2形成的，且il
‑
2的浓度为2
×
105‑1×
106u/l。
14.本发明的有益效果：
15.1、本发明在cik细胞的培养过程中添加了cd28单克隆抗体，利用了cd28可以增加t细胞的活化，促进t细胞il
‑
2生成和抗原特异性的多克隆t细胞的增殖，另外效应性t细胞经cd28抗体激发后大量活化增，能明显增加cik细胞的增殖倍数，提高了cik细胞繁殖能力；
16.2、本发明还在cik细胞的培养过程中添加了il
‑
1α、il
‑
15和il
‑
21刺激因子，诱导培养的cik细胞中穿孔蛋白、颗粒酶b和cd107a表达，提高cik细胞的细胞毒活性。
17.因此，本发明提供的一种外周血含有cik细胞的培养方法，可以解决目前cik细胞的培养方法培养出来的cik细胞繁殖能力差、细胞毒活性低的技术问题。
具体实施方式
18.对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
19.实施例1：
20.一种外周血含有cik细胞的培养方法，包括以下步骤：
21.步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养：在无菌环境下，采集患者或志愿者的外周血，并加入肝素钠，用淋巴分离液在温度为15℃、离心力为260xg条件下离心18min分离出单个核细胞；用毛细血管吸取单个核细胞层，然后用生理盐水洗涤，然后在温度为20℃、离心力为300xg条件下离心23min，重复2次；再用培养基a悬浮并调整细胞密度为4
×
106/l，并将此培养基a接种于30cm2的培养瓶中，然后培养瓶置于37℃，5％co2培养箱中97％湿度培养24h后收集细胞，在温度为17℃、离心力为250xg的条件下离心17min，弃上清，获得培养后的单个核细胞；
22.步骤2、cik细胞的培养：将步骤1获得的培养后的单个核细胞用活化培养基b悬浮并调整细胞密度为1.8
×
106/l，并将此活化培养基b接种于180cm2的已包被cd28抗体的培养瓶中，并置于37℃，5％co2培养箱中97％湿度培养，24小时后，依次加入il
‑
15和il
‑
21，继续培养，每1.5天半量换取扩增培养基c，维持细胞密度为1.8
×
106/ml，其中，已包被cd28抗体的培养瓶为用包被液包被于培养瓶底部，在14℃孵育70min形成的。
23.上述各步骤中使用的原料如表1所示。
24.表1
[0025][0026][0027]
实施例2：
[0028]
一种外周血含有cik细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0029]
步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养：在无菌环境下，采集患者或志愿者的外周血，并加入肝素钠，用淋巴分离液在温度为16℃、离心力为260xg条件下离心18min分离出单个核细胞；用毛细血管吸取单个核细胞层，然后用生理盐水洗涤，然后在温度为20℃、离心力为300xg条件下离心23min，重复2次；再用培养基a悬浮并调整细胞密度为4
×
106/l，并将此培养基a接种于30cm2的培养瓶中，然后培养瓶置于37℃，5％co2培养箱中98％湿度培养24h后收集细胞，在温度为19℃、离心力为250xg的条件下离心17min，弃上清，获得培养后的单个核细胞；
[0030]
步骤2、cik细胞的培养：将步骤1获得的培养后的单个核细胞用活化培养基b悬浮并调整细胞密度为1.8
×
106/l，并将此活化培养基b接种于180cm2的已包被cd28抗体的培养瓶中，并置于37℃，5％co2培养箱中98％湿度培养，24小时后，依次加入il
‑
15和il
‑
21，继续培养，每2天半量换取扩增培养基c，维持细胞密度为1.8
×
106/ml，其中，已包被cd28抗体的培养瓶为用包被液包被于培养瓶底部，在14℃孵育70min形成的。
[0031]
上述各步骤中使用的原料如表2所示。
[0032]
表2
[0033][0034]
实施例3：
[0035]
一种外周血含有cik细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0036]
步骤1、外周血的提取和单个核细胞的培养：在无菌环境下，采集患者或志愿者的外周血，并加入肝素钠，用淋巴分离液在温度为18℃、离心力为260xg条件下离心18min分离出单个核细胞；用毛细血管吸取单个核细胞层，然后用生理盐水洗涤，然后在温度为23℃、离心力为300xg条件下离心23min，重复2次；再用培养基a悬浮并调整细胞密度为4
×
106/l，并将此培养基a接种于30cm2的培养瓶中，然后培养瓶置于37℃，5％co2培养箱中100％湿度培养24h后收集细胞，在温度为22℃、离心力为250xg的条件下离心17min，弃上清，获得培养后的单个核细胞；
[0037]
步骤2、cik细胞的培养：将步骤1获得的培养后的单个核细胞用活化培养基b悬浮并调整细胞密度为1.8
×
106/l，并将此活化培养基b接种于180cm2的已包被cd28抗体的培养瓶中，并置于37℃，5％co2培养箱中100％湿度培养，24小时后，依次加入il
‑
15和il
‑
21，继续培养，每2天半量换取扩增培养基c，维持细胞密度为1.8
×
106/ml，其中，已包被cd28抗体的培养瓶为用包被液包被于培养瓶底部，在14℃孵育70min形成的。
[0038]
上述各步骤中使用的原料如表3所示。
[0039]
表3
[0040][0041]
对比例1：
[0042]
对比例以传统培养方法培养，具体步骤如下：
[0043]
取外周血70ml，2000rpm/min离心20min，分离收集血浆，56℃灭活30min，并1500rpm/min离心10min，得自体血浆，用于配制活化培养基；
[0044]
另向去掉血浆的血液中添加1.5倍血浆体积的无菌pbs稀释血液，用ficoll
‑
paque分离外周血单个核细胞(pbmcs)，得单个核细胞；
[0045]
使用含有10％体积胎牛血清的rpmi1640培养基将细胞密度调整至1
×
106/ml，加入ifn
‑
γ，终浓度为2000u/ml；24小时后加入cd3单克隆抗体，cd3终浓度为50μg/ml，人白细胞介素
‑
2(il
‑
2)，il
‑
2终浓度为500u/ml，il
‑
1α终浓度为50000u/ml，以后每隔48h计数，按照4
×
105/ml的密度传代，同时补充加入il
‑
2、il
‑
1α和ifn
‑
γ。
[0046]
实施例4：
[0047]
一、cik细胞增殖倍数
[0048]
在全自动五分类血液分析仪上进行细胞计数，将上述实施例1
‑
3和对比例1培养方法获得cik细胞，分别在培养的第3天、第5天、第10天、第15天分别计数，算出扩增倍数，计算公式如下所示：
[0049]
细胞增殖倍数＝培养后细胞数/培养前接种的细胞数。
[0050]
细胞增殖倍数比较统计表如表4所示：
[0051]
表4
[0052]
3d5d10d15d实施例14.3
±
0.322.7
±
3.2231.7
±
17.21317.1
±
71.1实施例25.1
±
0.223.1
±
3.1232.8
±
16.91321.3
±
72.3实施例34.7
±
0.322.5
±
3.3234.5
±
17.41319.1
±
71.9
对比例12.7
±
0.411.5
±
2.4132.4
±
13.9986.7
±
43.2
[0053]
从表4可以看出实施例1
‑
3在培养期间的增殖倍数要大大高于对比例1在培养期间的增殖倍数，具有显著性差异。
[0054]
二、cik细胞杀伤活性测定
[0055]
收集实施例1
‑
3和对比例1培养9d的细胞，用pbs洗涤3次后配成2
×
106/l的细胞悬液为效应细胞。将对数生长期的a549、mfc
‑
7和hme1细胞配成2
×
105/l细胞悬液为靶细胞，效靶细胞各取0.5ml细胞悬液等量混合，置37℃、5％co2、饱和湿度培养箱中孵育6h后，轻轻混匀，悬浮细胞，以252xg离心10min，收集上清液，用乳酸脱氢酶试剂盒按试剂说明书要求操作，在全自动生化分析仪340nm波长下测定吸光度值(a)，每检测样本设5个复管，取平均值。按下列公式计算杀伤活性：
[0056]
杀伤活性(％)＝[(a
实验组
‑
a
效应细胞自然释放组
)/(a
靶细胞最大释放组
‑
a
靶细胞自然释放组
)]
×
100％。
[0057]
测得的杀伤活性测得数据如表5所示。
[0058]
表5
[0059] a549mfc
‑
7hme1实施例1杀伤活性(％)80.9157.7772.31实施例2杀伤活性(％)79.3758.3471.79实施例3杀伤活性(％)80.6357.8971.81对比例1杀伤活性(％)64.3748.9148.79
[0060]
从表5可以看出实施例1
‑
3获得的cik细胞对a549、mfc
‑
7和hme1细胞杀伤活性明显高于对比例1获得的cik细胞对a549、mfc
‑
7和hme1细胞杀伤活性。
[0061]
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0062]
以上内容仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。