一种含有HDAC10基因启动子序列和报告基因的重组质粒、制备方法及应用与流程

一种含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒、制备方法及应用
技术领域
1.本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒、制备方法及应用。


背景技术：

2.缺氧(hypoxia)是指因组织用氧障碍或氧气供应不足而导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。缺氧时间过长会给机体造成严重的损害，导致细胞凋亡，引起癌症、慢性炎症、心肌梗死、心绞痛、卒中和缺血性急性肾损伤等一些疾病的产生，最终可引起人体心、脑、肝等重要脏器由于能量供应不足而死亡。
3.急性心肌梗死(ami)在世界范围内导致高发病率和高死亡率是最严重的心血管疾病之一，缺氧发生在急性冠状动脉阻塞中，并导致心肌细胞死亡，是ami的第一阶段。在原发性血管成形术中会发生完全的缺氧/复氧，是一个有害事件，缺氧/复氧(h/r)诱导局部心肌细胞凋亡，导致心肌产生不可逆的损伤。
4.hdacs抑制剂在心肌缺血/再灌注损伤中通过抑制未成熟血管的产生、减少炎症或促进能量代谢来介导对心肌的保护作用，被认为是减少i/r损伤、改善心脏功能障碍和减少梗死大小的有效药物。研究发现，hdacs参与一系列心脏和血管的事件，包括心肌细胞的胚胎发生、生长发育、凋亡，缺血心肌的修复，血管内皮的分化、抗凝、纤溶，血管平滑肌细胞的迁移和增殖，心脏氧化应激、炎症细胞募集等。在ami、心力衰竭、心脏肥大、动脉粥样硬化、先天性心脏病如室间隔缺损和薄壁心肌等疾病模型中，都报道检测到某些特定的hdac的表达水平较基线水平有较为明显的升高或降低。hdac10在hdacs家族中属于iib类，位于细胞质和细胞核中，可作为转录调节剂。有研究发现，hdac10与血管新生抑制因子pedf在蛋白表达上显著负相关， hdac10通过其去乙酰化酶活性，参与介导了mi大鼠心肌组织中pedf的基因沉默，从而导致心肌细胞死亡和心功能障碍，与心肌细胞缺氧损伤密切相关。
5.hdac10表达受启动子区域的调控。因此，针对hdac10基因启动子设计相应的筛选和检测方法很有必要，这对进一步研究hdac10调控心肌细胞缺氧损伤的作用有重要意义。本发明人利用基因重组技术，采用pcr的方法，从大鼠基因组中扩增出了1613bp的hdac10启动子序列，并将其克隆到荧光素酶报告基因载体上。将荧光素酶报告基因的重组质粒转染到h9c2细胞中，成功构建了hdac10启动子细胞模型，研究不同缺氧时间对hdac10启动子表达的影响,后续可用于抗缺氧损伤药物的筛选。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒及制备方法。
7.技术方案
8.一种含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒：以含双荧光素酶报告基
因(萤火虫荧光素酶和海参荧光素酶)的pgl3
‑
basic质粒为载体，在pgl3
‑
basic质粒的kpni和mlui 的限制性酶切位点之间，插入hdac10基因启动子序列，得到含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒；所述hdac10基因启动子序列的核苷酸序列如seq id no.1所示。
9.进一步，所述pgl3
‑
basic质粒为pgl3
‑
basic质粒4818bp。
10.上述含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：
11.(1)设计hdac10基因启动子的引物，以大鼠基因组为模板，进行pcr扩增，得到含有hdac10 基因启动子的目的片段；
12.(2)采用限制性内切酶kpni和mlui分别对含有hdac10基因启动子的目的片段和 pgl3
‑
basic基础质粒进行双酶切，然后将酶切产物进行连接，得到连接后的重组质粒；
13.(3)筛选连接后的重组质粒，并测序鉴定，得到含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒。
14.进一步，步骤(1)中，所述hdac10基因启动子的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物序列为：5
’‑
ggggtaccttctttctgagtttgc
‑3’
(seq id no.2)，下游引物序列为：5
’ꢀ‑
ccgacgcgtacttaacagtatgc
‑3’
(seq id no.3)。
15.进一步，步骤(1)中，所述pcr扩增的反应体系为：25μl体系，premix：12.5μl，模板：2μl，引物：5μl，ddh2o：5.5μl。
16.进一步，步骤(1)中，所述pcr扩增的反应条件为：98℃变性2min；循环为98℃20s, 58℃20s,72℃1min30 s,共进行32个循环，72℃延伸10min。
17.上述重组质粒在制备筛选抗缺氧损伤药物中的应用。
18.通过氯化钴和无糖培养基双刺激构建h9c2心肌细胞的氧气
‑
葡萄糖剥夺(oxygen
‑
glucosedeprivation，ogd)模型，采用cck
‑
8检测细胞凋亡，采用rt
‑
qpcr检测不同缺氧时间下hdac10 在mrna水平上的表达情况。将构建的含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒采用 pei试剂转染到h9c2细胞中，24h后换液进行缺氧处理，双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性，确定hdac10基因启动子活性在不同缺氧时间下的变化情况。
19.本发明的有益效果：
20.本发明利用基因工程技术，设计hdac10启动子的引物，以大鼠基因组为模板进行pcr扩增得到的目的片段，将其与pgl3
‑
basic载体双酶切后再连接，经酶切鉴定并测序后，得到 pgl3
‑
hdac10重组质粒，构建h9c2细胞的氧糖剥夺模型后，将构建的pgl3
‑
hdac10重组质粒转染到h9c2细胞中，通过同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性来反应hdac10基因启动子活性在不同缺氧时间下的变化情况，用于筛选抗缺氧损伤药物，该方法具有靶向性强、灵敏度高、检测速度快的特点。
附图说明
21.图1为pgl3
‑
hdac10重组质粒的构建图；
22.图2为pgl3
‑
hdac10重组质粒的双酶切验证结果；
23.图3为h9c2心肌细胞在不同处理条件下的增殖活性测试结果；
24.图4为ogd处理不同时间下hdac10 mrna水平表达情况的real
‑
time pcr检测结果；
25.图5为ogd处理不同时间对hdac10基因启动子活性的影响测试结果。
具体实施方式
26.下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
27.备注:1.下述实施例中，所用的试剂及来源见表1：
28.表1
[0029][0030][0031]
其余试剂均为国产分析纯。
[0032]
2.采用的主要溶液和培养基如下：
[0033]
2.1培养基
[0034]
lb液体培养基(1l)：胰蛋白胨10g；酵母抽提物5g；nacl 10g
[0035]
lb固体培养基(1l)：胰蛋白胨10g；酵母抽提物5g；nacl 10g；琼脂粉15g
[0036]
2.2小提质粒溶液
[0037]
溶液ⅰ：葡萄糖：分析纯，0.9g，终浓度为50mmol/l；1mol/ltris
‑
hl(ph8.0)2.5ml，
[0038]
终浓度25mmol/l；0.5mol/l edta(ph8.0)2ml，终浓度10mmol/l；加水定容至
[0039]
100ml。高压蒸汽灭菌后，4℃贮存。
[0040]
溶液ⅱ：0.4mol/l naoh与2％sds按1：1比例混合，现用现配。
[0041]
溶液ⅲ：5mol/l kac 60ml，冰醋酸11.5ml，无菌水28.5ml，终含3mol/l kac，5mol/l 冰醋酸(ph4.8)。
[0042]
2.3大提质粒溶液
[0043]
溶液ⅰ：1mol/ltris
‑
hl(ph8.0)2.5ml，终浓度25mmol/l；0.5mol/l edta(ph8.0)2ml，终浓度10mmol/l；加水定容至100ml。高压灭菌保存。
[0044]
溶液ⅱ：0.2mol/l naoh与1％sds按1：1比例混合，现用现配。
[0045]
溶液ⅲ：5mol/l kac 60ml，冰醋酸11.5ml，无菌水28.5ml，终含3mol/l kac，5mol/l 冰醋酸(ph4.8)。高压灭菌保存。
[0046]
2.4琼脂糖凝胶溶液配制
[0047]
(1)50
×
tae电泳缓冲液：tris碱242g，edta钠盐37.2g，加双蒸水至1l，ph约8.5。
[0048]
(2)1.5％琼脂糖凝胶溶液：1.5g琼脂糖，加1
×
tae电泳缓冲液至100ml。
[0049]
(3)6
×
上样缓冲液。
[0050]
(4)gel green核酸染料：5μl/100ml。
[0051]
实施例1
[0052]
一种含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒：以含双荧光素酶报告基因的 pgl3
‑
basic质粒为载体，在pgl3
‑
basic质粒的kpni和mlui的限制性酶切位点之间，插入 hdac10基因启动子序列，得到含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒 (pgl3
‑
hdac10重组质粒)；所述pgl3
‑
basic质粒为pgl3
‑
basic质粒4818bp。pgl3
‑
hdac10 重组质粒的构建图见图1。
[0053]
上述含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：
[0054]
(1)pgl3
‑
basic质粒的大量扩增、抽提：
[0055]
用pgl3
‑
basic质粒(美国addgene公司)转化dh5a感受态细胞(北京全式金生物技术 (transgen biotech)有限公司)，进行大量的扩增；碱裂解法大量制备pgl3
‑
basic质粒，电泳检测质粒的纯度和含量。具体步骤如下：
[0056]
制备感受态：
[0057]
1)取ecoli dh5
ɑ
甘油菌按1：100接于3ml lb液体培养基中，37℃培养过夜。
[0058]
2)取1ml活化dh5
ɑ
菌液，接于100ml lb液体培养基中，37℃摇菌至od
600
为0.4
‑
0.6。
[0059]
3)将菌液转至2个50ml预冷的离心管中，冰浴10min。
[0060]
4)4℃、4000rpm离心10min，弃上清，倒置1min。
[0061]
5)用冰预冷的0.1m cacl
2 10ml悬浮沉淀，冰浴30min。
[0062]
6)4℃4000rpm离心10min，弃上清，用冰预冷的0.1m cacl
2 2ml悬浮沉淀。
[0063]
7)分装细胞，100μl/管，加入等体积40％甘油，摇匀，
‑
70℃保存。
[0064]
转化：
[0065]
1)于冰上将1μl质粒加入到200μl感受态细胞，冰浴30min。
[0066]
2)42℃热激90s。
[0067]
3)冰浴1
‑
2min。
[0068]
4)在超净台上加入800μl培养基预培养50min，然后离心，弃掉上面800μl培养基，打散沉淀。
[0069]
5)涂布平板，37℃正置培养1h，倒置培养过夜。
[0070]
保存菌种：从固体培养基上挑取单菌落接种到含有氨苄的lb液体培养基中，37℃、100rpm 摇菌过夜，取摇完的菌液，按照40％甘油：菌液＝1：1的比例保存菌种600μl于
‑
80℃环境下。
[0071]
小量提取纯化质粒：
[0072]
1)收集剩余菌体于2ml离心管12000rpm、4℃离心1min，一次不够可分两次或多次离心。
[0073]
2)弃上清，向菌体沉淀中加入预冷的小提溶液ⅰ150μl，用力振荡使混合均匀，冰上放置5min。
[0074]
3)向其中加入小提溶液ⅱ(现用现配的2％sds 0.4m naoh按照1：1体积比)，轻柔颠倒几下离心管，使尽可能混匀，不要振荡，放置冰上5min。
[0075]
4)向其中加入小提溶液ⅲ150μl，温和振荡数次，冰浴3
‑
5min。
[0076]
5)12000rpm、4℃离心5min，转移上清至1新管中。
[0077]
6)加入等体积酚/氯仿(1：1)约450μl，振荡混匀，12000rpm、4℃离心5min。
[0078]
7)小心转移上清(勿吸太多且勿吸入中间蛋白层及下层氯仿)至1新管中。
[0079]
8)向其中加入2倍体积的无水乙醇，振荡均匀，
‑
20℃醇沉20min或更长时间。
[0080]
9)12000rpm、4℃离心10min，弃上清。
[0081]
10)向沉淀中加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀，12000rpm、4℃离心2min。
[0082]
11)弃上清，抽干乙醇，室温干燥5
‑
15min。
[0083]
12)向其中加入20μl ter(含0.5％rnase的te溶液)溶解dna。
[0084]
大量制备质粒：
[0085]
1)收集生长饱和的250ml菌液，4℃1000rpm离心3min，弃上清，加20ml solution i(冰预冷)，重悬均匀。
[0086]
2)加20ml solution ii，轻轻转动瓶子，混匀至透明。
[0087]
3)加20ml solution iii(冰预冷)充分混匀，置冰浴30min。
[0088]
4)4℃16000rpm离心30min，取上清再离心20min，上清转入另一离心管中，加0.7倍异丙醇，混匀，冰浴10min，4℃16000rpm离心3min。
[0089]
5)2ml无菌水充分溶解，转入50ml离心管中，用65℃的5ml无菌水分3次清洗原离心管残留dna，一并转入50ml离心管中。
[0090]
6)加入等体积5m licl 5ml，混匀，冰浴10min，4℃、16000rpm离心20min，上清转入另一离心管中，加等体积异丙醇(10ml)，冰浴30min，4℃、16000rpm离心20min，烘干。
[0091]
7)500μl无菌水分三次溶解转入1.5mlep管中，加入10μl rna酶，室温1h或37℃30min，过夜，加入管体积13％peg8000(600μl)混匀，室温1h。
[0092]
8)4℃、13800rpm离心10min，弃上清，用吸水纸吸干余下的液体，400μl无菌水溶解沉淀，加入400μl酚/氯仿，混匀。
[0093]
9)4℃、13800rpm离心10min，转移上层水相到另一离心管。
[0094]
10)加200μl无菌水到酚/氯仿中，4℃、13800rpm离心10min，转移上层水相到一新管中，合并两次水相，加入1/10体积solutioniii(naac)。
[0095]
11)加入1ml无水乙醇，4℃、13800rpm离心15min。
[0096]
12)400μl无菌水溶解沉淀，测a260/280nm吸光值确定浓度。
[0097]
(2)通过ensembl网站查找hdac10启动子序列，hdac10基因启动子序列的核苷酸序列如 seq id no.1所示，设计hdac10基因启动子的引物，所述hdac10基因启动子的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物序列为：5
’‑
ggggtaccttctttctgagtttgc
‑3’
(seq id no.2)，下游引物序列为：5
’‑
ccgacgcgtacttaacagtatgc
‑3’
(seq id no.3)；
[0098]
以大鼠基因组为模板，进行pcr扩增，反应体系为：25μl体系，premix：12.5μl，模板： 2μl，引物：5μl，ddh2o：5.5μl；反应条件为98℃变性2min；循环为98℃20s,58℃20s, 72℃1min30 s,共进行32个循环，72℃延伸10min；
[0099]
反应结束后，取8μl pcr扩增反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图1，其中，通道1为marker dl2000，2、3、4为目的样本，箭头所指为目的片段，可看到明显的1613bp 片段，即扩增的hdac10基因片段。取pcr产物，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用凝胶回收试剂盒回收，得到含有hdac10基因启动子的目的片段；
[0100]
(3)采用限制性内切酶kpni和mlui分别对含有hdac10基因启动子的目的片段和 pgl3
‑
basic基础质粒进行双酶切，然后将酶切产物进行连接反应，得到连接后的重组质粒；
[0101]
连接反应体系为10μl体系：稀释dna片段1μl；10
×
buffer 1μl；载体1μl；t4连接酶1μl；无菌水6μl；循环水浴16℃过夜反应。
[0102]
(4)筛选连接后的重组质粒：
[0103]
取10μl连接产物直接转化100μl感受态大肠杆菌，经过含有氨苯青霉素的lb培养基(氨苄浓度为100mg/ml)中选择培养，从转化子的平板上随即挑取10个菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用；进行酶切、电泳、测序鉴定：
[0104]
重组质粒的双酶切验证结果见图2，其中，6为marker dl2000，通道1、2是pgl3
‑
basic 空载体，1无酶切，2经过kpni和mlui双酶切，3、4、5是重组质粒，3无酶切，4、5经kpni 和mlui双酶切，可以看出，切出了载体和hdac10启动子目的片段两部分，说明重组质粒构建成功。
[0105]
测试结果显示，重组质粒中含有插入的hdac10基因启动子片段并且未发现有碱基突变。
[0106]
经鉴定，得到含有hdac10基因启动子序列和报告基因的重组质粒。
[0107]
实施例2hdac10基因启动子缺氧调控功能研究
[0108]
1.h9c2心肌细胞在不同处理条件下的增殖活性测试
[0109]
实验方法如下：
[0110]
1)细胞培养
[0111]
取h9c2心肌细胞(购于美国模式菌种收集中心)用高糖dmem培养基培养，添加10％胎牛血清、1％青链霉素混合液。细胞在37℃，5％co2恒温培养箱中培养。
[0112]
2)h9c2心肌细胞铺板
[0113]
吸弃培养基，加入2mlpbs进行简单清洗；吸弃pbs，加入适量胰酶作用15s，吸弃大
部分，用残余继续消化直至可以看到细胞开始脱落；加入含血清培养基终止并吹打h9c2细胞使其完全脱离并分散开，800rpm、常温离心5min；吸弃培养基，向离心管中加入适量培养基和胎牛血清轻轻混匀；吸取细胞悬浮液均匀地滴入板中(按照6孔板每孔2ml、24孔板每孔1ml、96 孔板每孔0.5ml原则)，加入1％的青霉素和链霉素混合液，摇匀后放置于37℃、5％co2培养箱中培养。
[0114]
3)建立h9c2心肌细胞的ogd模型
[0115]
为了研究不同培养环境对h9c2细胞增殖活性的影响(n＝6)，建立h9c2心肌细胞的ogd 模型，共分6个处理组：a、normoxia组：常氧条件下，完全培养基培养的h9c2细胞；b、 hypoxia组：缺氧条件下(15min)，完全培养基培养的h9c2细胞；c、ogd 1h组：ogd处理h9c2细胞1h；d、ogd 2h组：ogd处理h9c2细胞2h；e、ogd 4h组：ogd处理h9c2 细胞4h；f、ogd 8h组：ogd处理h9c2细胞8h。
[0116]
ogd(缺氧)处理方法为：待h9c2心肌细胞生长至融合密度80％左右进行缺氧处理，先将不含fbs的无糖dmem和氯化钴混合(每ml无糖培养基中加入1.2μl氯化钴)，再对h9c2细胞换液加入混有氯化钴的无糖dmem，进行不同时间的缺氧(1h、2h、4h、8h)。
[0117]
4)细胞活力检测(使用vicmed公司cck
‑
8试剂盒)
[0118]
将各处理组h9c2心肌细胞接种于96孔板中(1
×
105/孔)，每组6个复孔，每孔100μl 相应培养基，24h后进行处理。各组细胞经相应处理后，使用多通道移液器向各孔加入10μl cck
‑
8试剂。将孔板放入相应培养条件下，1h后使用酶标仪测量450nm波长处的吸光度(a)。
[0119]
细胞活力(％)＝[(as
–
ab)/(ac
–
ab)]
×
100％
[0120]
as：实验孔(含有细胞并经ogd处理、含cck
‑
8)的吸光度；
[0121]
ac：对照孔(含有细胞而不经ogd处理、含cck
‑
8)的吸光度；
[0122]
ab：空白孔(不含有细胞和不经ogd处理、含cck
‑
8)的吸光度。
[0123]
实验结果：
[0124]
h9c2心肌细胞在不同处理条件下的增殖活性测试结果见图3，可以看出，与常氧组相比，单独缺氧15min显著降低h9c2细胞的增殖活性(
**
p<0.01)；ogd处理具有显著地抑制作用 (
**
p<0.01)，并且随着缺氧时间的延长细胞活性逐渐降低。
[0125]
2.ogd处理不同时间对hdac10 mrna表达水平的影响
[0126]
实验方法：
[0127]
1)pei试剂转染
[0128]
转染前一小时换无血清无双抗培养基。准备若干酶切管，先加入适量质粒，做好标记。每管中加入100μl无血清培养基稀释质粒。取出pei(sigma)转染试剂(避光)，以质粒：pei 试剂＝4：1比例加入pei试剂，混匀，孵育20min。孵育完后，将混合物均匀加入细胞板各孔中，前后轻晃使混匀，做好标记。37℃、5％co2培养箱中培养。24h后进行换液并分组进行缺氧处理。
[0129]
2)采用real
‑
time pcr测定方法，检测hdac10基因在rna水平的表达变化
[0130]
细胞分组：ogd处理不同时间对hdac10mrna水平的影响(n＝3)
[0131]
a、normoxia组：常氧条件下，完全培养基培养的h9c2细胞；
[0132]
b、ogd 1h组：ogd处理h9c2细胞1h
[0133]
c、ogd 2h组：ogd处理h9c2细胞2h
[0134]
d、ogd 4h组：ogd处理h9c2细胞4h
[0135]
e、ogd 8h组：ogd处理h9c2细胞8h
[0136]
细胞总rna的提取：
[0137]
(1)弃去培养基，加入1ml的trizol，摇晃15s，静置3min；
[0138]
(2)用加样器反复吹打液体后，移至1.5ml的eppendorf管中(核酸专用)；
[0139]
(3)加入200μl(trizol的1/5体积)氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈震荡1min，待溶液充分乳化后再静置5min，12000g，4℃，离心8min；
[0140]
(4)离心后分三层，小心吸取无色上清至新的eppendorf管中，每管加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后静置10min，12000g，4℃，离心7min，离心后管底出现沉淀；
[0141]
(5)弃去上清，缓慢向离心管壁加入1ml的75％乙醇(切勿触及沉淀)，上下颠倒使沉淀漂浮，12000g，4℃，离心5min，弃去乙醇(尽量除净)，倒完乙醇后倒扣在滤纸上，再用小吸水纸将管壁液滴吸净(切勿触及沉淀)；
[0142]
(6)室温干燥5
‑
10min，每管加入20
‑
30μl rnase
‑
free水溶解沉淀。用移液枪轻吹沉淀待沉淀完全溶解后放置冰上；
[0143]
(7)测浓度，先用rnase
‑
free水清洗，再加1.5μl rnase
‑
free水选blank做对照。之后每加一次样品都要用纸擦净、样品加1.5μl(360nm 280nm)，在侧壁上记下浓度。提取的核酸
‑
80℃保存。
[0144]
逆转录：
[0145]
逆转录用promega公司的reverse transcription system试剂盒进行，具体体系如下：体系
①
：rna≦2μg，oligo 1μl，depc水补至11μl，65
‑
70℃水浴10min后放置冰上；体系
②
：体系
①
11μl，5xbuffer 4μl，rna酶抑制剂0.5μl，rt酶0.5μl，dntp 2μl，mgcl2 2μl。程序为25℃10min，42℃1h，70℃15min。逆转录完成后加100μl depc水稀释，放入
‑
20℃保存。
[0146]
q
‑
pcr检测：
[0147]
本实验中hdac10、内参18srrna基因均使用sybr green i进行检测，采用2
‑△△
ct法进行结果分析，具体程序及步骤如下：
[0148][0149]
实时定量荧光pcr反应上下游引物为：
[0150]
rathdac10:上游引物,5
’‑
tcccgttggcctttgagttt
‑3’
；
[0151]
下游引物,5
’‑
tagactccagggcactccaa
‑3’
。
[0152]
18srrna:上游引物,5
’‑
cctggataccgcagctagga
‑3’
；
[0153]
下游引物,5
’‑
gcggcgcaatacgaatgcccc
‑3’
。
[0154]
数据处理：各组dna定量变化值采用2
‑△△
ct
法进行结果分析。
[0155]
实验结果：
[0156]
ogd处理不同时间下hdac10 mrna水平表达情况的real
‑
time pcr检测结果见图4，可以看出，与常氧组对照比较，ogd组hdac10 mrna水平表达量出现了增加现象(
**
p<0.01)。
[0157]
3.ogd处理不同时间对hdac10活性的影响
[0158]
1)pei试剂转染
[0159]
转染前一小时换无血清无双抗培养基。准备若干酶切管，先加入适量质粒，做好标记。每管中加入100μl无血清培养基稀释质粒。取出pei(sigma)转染试剂(避光)，以质粒：pei 试剂＝4：1比例加入pei试剂，混匀，孵育20min。孵育完后，将混合物均匀加入细胞板各孔中，前后轻晃使混匀，做好标记。37℃、5％co2培养箱中培养。24h后进行换液并分组进行缺氧处理。共分7个组，分组情况如下：组1：空载体组：pgl3
‑
basic(1μg) renilla；组2：低剂量组：pgl3
‑
basic(0.8μg) renilla pgl3
‑
hdac10(0.2μg)；组3：常氧组：pgl3
‑
hdac10 (1μg) renilla；组4：pgl3
‑
hdac10(1μg) renilla ogd 1h；组5：pgl3
‑
hdac10 (1μg) renilla ogd 2h；组6：pgl3
‑
hdac10(1μg) renilla ogd 4h；组7： pgl3
‑
hdac10(1μg) renilla ogd 8h。
[0160]
2)细胞转染后24h，按照分组对细胞进行不同处理(normoxia/ogd)，吸尽细胞培养液，加入pbs，轻轻洗涤细胞，弃去洗涤液；
[0161]
3)裂解细胞；向24孔板中分别加100μl lysis(5x)，室温15min，吹打使其充分裂解。每孔吸取20μl充分裂解的细胞到96孔板中；
[0162]
4)溶解荧光素酶检测试剂和renilla荧光素酶检测缓冲液，并达到室温。renilla荧光素酶检测底物(100
×
)置于冰浴或冰盒上备用；
[0163]
5)按照每个样品需100μl的量，取适量renilla荧光素酶检测缓冲液，按照1:100加入 renilla荧光素酶检测底物(100
×
)配制成renilla荧光素酶检测工作液；
[0164]
6)开启酶标仪，将测定间隔设为2s，测定时间设为10s；
[0165]
7)每个样品测定时，取样品50μl，加入100μl荧光素酶检测试剂，混匀，synergy2多功能酶标仪测定rlu(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液做为空白对照；
[0166]
8)完成上述测定荧光素酶步骤后，加入100μl renilla荧光素酶检测工作液，用移液器打匀或用其它适当方混匀，测定rlu(relative light unit)；
[0167]
9)在以renilla荧光素酶为内参的情况下，用荧光素酶测定得到的rlu值除以renilla 荧光素酶测定得到的rlu值。根据测得比值，比较不同样品间目的报告基因的激活程度。
[0168]
ogd处理不同时间对hdac10基因启动子活性的影响测试结果见图5，其中，n＝3，
*
对照 pgl3
‑
vector组，
**
p＜0.01；
#
对照常氧组1μg hdac10
‑
luc组，
##
p＜0.01。双报告检测结果显示，与常氧对照比较，在ogd条件下，随着缺氧时间的延长hdac10基因启动子活性逐渐升高， ogd4h的时候达到峰值(
**
p<0.01)。
[0169]
综上，本实验成功构建了pgl3
‑
hdac10启动子荧光素酶报告基因质粒；并证实hdac10基因启动子活性与细胞缺氧程度密切相关，随着缺氧时间的延长hdac10基因启动子活性逐渐增强，在ogd4h的时候达到峰值，hdac10基因启动子具有缺氧调控功能。通过同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性来反应hdac10基因启动子活性在不同缺氧时
间下的变化情况，具备灵敏度高，检测速度快的特点，后期可用于抗缺氧损伤药物的筛选。