嵌合抗原受体(CAR)以及它们在药物中的用途的制作方法

本发明涉及细胞疗法领域。具体地，本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)、编码CAR的核酸、表达它们的免疫细胞和它们在骨肉瘤治疗药物中的应用。

背景技术

骨肉瘤(OS)是最常见的原发性骨癌并且是儿童和青少年中第八最常见的癌症形式。OS是侵袭性癌症类型，其中5年总存活率低至60％。自上世纪70年代化疗引入起，该数字未得到改善。尽管已建立了多个国际协会来通过创新解决方案进行临床试验，但至今仅报道了不佳的结果。这些消极结果的原因与OS的生物学有关。大部分患者将由于肺转移而死于它们的癌症，这种情况大多是化疗耐受性的。在该领域仍有明显未满足的需要。

已基于表达CAR的自体同源T细胞对HER2的靶向报道了有关肉瘤患者(包括骨肉瘤患者)的一个临床试验(Ahmed等人2015,J Clin Oncol.2015年5月20；33(15):1688-96)。尽管HER2存在于多种类型的癌症上，但是健康组织也表达HER2。静脉内接受CAR T细胞的患者在细胞输注后15分钟内经历呼吸困难，并且尽管有深切医学干预，但患者在治疗后5天死亡(Morgan等人Mol Ther.2010年4月；18(4):843-51)。

为了实现治疗性CAR T细胞，所述细胞需要在细胞膜中表达足够量的CAR，并且抗原结合域必须在CAR构建体中表现出足够的亲和力和特异性。即使铰链中的细微差异也可能影响CAR触及靶细胞上靶标表位并随后将信号递送至免疫细胞的能力。

当然，CAR T细胞的体外活性可以是体内活性的指示。然而，如Long等人,Cancer Immunol Res.2016Oct；4(10):869–880所公开的，CAR T细胞的体外活性不必需转化为体内效力，特别是对于OS不是：“然而，体内GD2-CAR T细胞介导了对成神经细胞瘤异种移植的有效抗肿瘤活性，但是对骨肉瘤异种移植仅有最低的活性。抗肿瘤活性的缺乏与抑制人T细胞的CD11b Ly6G 鼠科MDSCs的相当大的扩增有关”。此外，如Mount等人,Nature Medicine,第24卷,第572-579页(2018)所公开的，可以发生严重的副作用，其中GD2-CAR T细胞的施用在具有正位异种移植的大部分小鼠中是耐受的。在抗肿瘤活性的急性期期间，瘤周神经性炎症导致脑积水，这在一部分动物中是致命的。

另外，与血液学恶性肿瘤相比，实体瘤的CAR T细胞疗法提供了需要克服的不同的一组障碍。如Srivastava和Riddle,J Immunol 2018；200:459-468中所述，这些障碍包括不良的运输(poor trafficking)、提高的免疫抑制分子和细胞表达和免疫检查点。例如，CAR T细胞向肿瘤的运输取决于肿瘤分泌的趋化因子的受体的表达。抗原-激活的CAR T细胞还显示上调抑制性受体的表达，其可以导致T细胞功能障碍。免疫抑制分子和细胞可以直接和间接促进肿瘤生长并抑制T细胞活性。因此，对于使CAR T细胞在实体瘤中有效，将需要克服多个障碍。

另一个问题与CAR T细胞在靶标位点的有效接近有关。与血液学恶性肿瘤相反，实体瘤的识别需要从血液流出至肿瘤位点，并且发展出多个恶性肿瘤，从而主动阻碍T细胞浸润。

可以预期仅一部分具有体外活性的CAR T细胞将成功体内迁移至肿瘤转移并浸润实体瘤，如OS的不利的肿瘤微环境。此外，CAR T细胞将可能需要随时间保持它们的活性以提供体内治疗效果。如Quintarelli等人,ONCOIMMUNOLOGY 2018,第7卷,第6期所公开的，CAR构建体的信号转导域是重要的：“尽管如此，当在异种移植NSG小鼠模型中测试具有两种不同共刺激信号转导域的IIICAR.GD2 T细胞时，我们观察到仅CARGD2.28.4-1BBz T细胞介导了持续的体内抗肿瘤效果(图2D-F)。[...]至今，使用靶向GD2的第一^17,18和第三(CD28.OX40)²¹代CAR在患有NB的儿童中所实施的临床试验已证明仅有有限的效力。”

因此，当在免疫细胞的细胞膜中被表达时，获得能够对OS提供体内治疗效果的新CAR是重要且非常期望的。

技术实现要素：

提供了新嵌合抗原受体(CAR)。在本文中表达CAR的免疫细胞在模拟转移性OS的鼠科模型，即具有在肺中建立的OS肿瘤的小鼠中显示出治疗效果，参见图7、8和9。OS是实体瘤，其通常扩散至肺，且具有致死后果。本文所提供的CAR识别先前显示非常特异的肺转移特异性标志物。另外，我们通过测试它们对健康组织的反应性评价了CAR的安全性。与来自健康骨髓的干细胞不显著受表达任何CAR的T细胞的影响的发现结合，本公开为人类患者中OS的治疗提供了有吸引力的细胞治疗替代方案。此外，表达CAR的免疫细胞还在模拟微转移OS的模型中显示出活性(参见图10)。

如利用我们的体内数据所证实的，当本文中的CAR在免疫细胞表面上被表达时，这些免疫细胞可以针对OS细胞。已证实了在几种异种移植OS模型中的治疗效果。在鼠科腹膜内模型中，对于表达包含含有SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2(TP1 scFv-片段)的抗原结合域的CAR的T细胞，肿瘤生长显著延缓。在相同模型中，对于表达包含含有SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4(TP3 scFv-片段)的抗原结合域的CAR的T细胞，基本避免了肿瘤生长。此外，对于接受表达任一种CAR的T细胞的小鼠，总存活率(overall survival，总生存期)显著改善。表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞的静脉内施用在具有强侵袭性OSA肺肿瘤的小鼠中提供了治疗效果和延长的存活，并且似乎甚至防止骨转移(参见图7和8)。表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞的静脉内施用还在具有LM-7肺肿瘤的小鼠中提供了延长的治疗效果(参见图9)。

在第一个方面，提供了CAR，其包含抗原结合域(domain，结构域)、铰链域、跨膜域和胞内信号转导域；其中抗原结合域包含TP1 scFv-片段，或者其中抗原结合域包含TP3 scFv-片段；铰链域包含CD8α铰链域，胞内信号转导域包含CD3ζ信号转导域。

所述铰链域可以由SEQ ID NO 5表示。

所述跨膜域可以由SEQ ID NO 6表示。

所述胞内信号转导域可以包含CD3ζ信号转导域和共刺激域。

所述胞内信号转导域可以包含CD3ζ信号转导域和4-1BB共刺激域。

所述胞内信号转导域可以由CD3ζ信号转导域和4-1BB共刺激域组成。

所述抗原结合域可以包含通过肽接头连接的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。

所述抗原结合域可以包含通过肽接头连接的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。

所述抗原结合域可以包含通过肽接头连接的SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，铰链域可以由SEQ ID NO 5表示，跨膜域可以由SEQ ID NO 6表示，并且胞内信号转导域可以包含CD3ζ信号转导域和4-1BB共刺激域。

所述抗原结合域可以包含通过肽接头连接的SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4，铰链域可以是由SEQ ID NO 5表示的CD8α铰链域，跨膜域可以是由SEQ ID NO 6表示的CD8α跨膜域，并且胞内信号转导域可以包含CD3ζ信号转导域和4-1BB共刺激域。

在第二方面，提供了编码根据第一方面的CAR的核酸。

在第三方面，提供了用根据第二方面的核酸转导的免疫细胞。

在第四方面，提供了表达根据第一方面的CAR的免疫细胞。

在第五方面，提供了包含根据第三或第四方面的免疫细胞的药物组合物。

可以在骨肉瘤的治疗中使用所述药物组合物。

可以在转移性骨肉瘤的治疗中使用所述药物组合物。

可以在微转移骨肉瘤(micrometastatic osteosarcoma)的治疗中使用所述药物组合物。

还证明在其细胞膜中表达嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞在转移性骨肉瘤的治疗中的用途，其中所述CAR包含抗原结合域，所述抗原结合域包含TP1 scFv-片段或者TP3 scFv-片段；铰链域、跨膜域、胞内信号转导域和任选地一个或多个共刺激信号转导域。

还提供了在患者中治疗骨肉瘤的方法，其包括将药学上有效剂量的根据第五方面的药物组合物静脉内施用至患者的步骤。

还提供了在患者中治疗转移性骨肉瘤的方法，其包括将药学上有效剂量的根据第五方面的药物组合物静脉内施用至患者的步骤。

附图说明

图1显示两种CAR构建体(OSCAR1和OSCAR3)在逆转录病毒转导的原代T细胞中被良好表达，并且可以通过抗-小鼠Fab抗体检测。

图2显示了通过BioPlex检测的细胞因子在细胞培养基(cell medium，细胞媒介物)中的释放。深色表示在24小时后上清液中细胞因子水平更高。如所示的，通过来自骨肉瘤细胞系的刺激，对于TNFα和IFNγ的释放，OSCAR重定向细胞被强烈激活。

图3a显示了通过表达OSCAR1或OSCAR3或者模拟转染的(mock transfected，空白转染的)原代T细胞对OHS细胞的体外杀死(BLI-测定)。

图3b显示了通过表达OSCAR1或OSCAR3或者模拟转染的原代T细胞对OSA细胞的体外杀死(BLI-测定)。

图3c显示了通过表达OSCAR1或OSCAR3或者模拟转染的原代T细胞对SAOS细胞的体外杀死(BLI-测定)。

图4a显示了如实施例4中所述的腹膜内小鼠模型的治疗方案。

图4b描绘了如实施例4所述，所处理的小鼠的OHS肿瘤负荷(通过IVIS检测的荧光素酶信号检测)和第20天时的存活。

图4c是如实施例4所述，所处理的每只小鼠的荧光素酶信号的蜘蛛图。OSCAR1和OSCAR3可以控制大部分动物中的肿瘤生长，然而与用模拟T细胞(mock T cell)处理的动物(对照)相比，对OSCAR3处理的动物观察到了肿瘤复发。

图4d是如实施例4所述，所处理的小鼠的存活曲线(Kaplan-Meier)。表达OSCAR1的T细胞在终点时保持80％的小鼠存活。表达OSCAR3的T细胞的表现优于模拟物(mock)或盐水处理的动物。

图5a描绘了如实施例5所述的肺转移肿瘤模型的治疗方案。

图5b描绘了如实施例5所述，所处理的小鼠中的肿瘤发展。如所示的，与模拟物或媒介物(medium，培养基)处理的小鼠相比，表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞对OSA肿瘤生长的控制时间更长。

图6a表明瞬时表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞对祖代血细胞的集落形成都不具有任何明显作用。

图6b表明稳定表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞都对祖代血细胞的集落形成不具有任何明显作用。集落形成单位(CFU)-红细胞(E)红色，CFU-粒性白细胞巨噬细胞(GM)白色集落，CFU粒性白细胞、红细胞、单核细胞、巨核细胞(GEMM)混合集落。

图7在使用模拟肺转移的OSA细胞的第二实验中证实了表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞的治疗效果。照片在第3、11和20天拍摄。在本文中，可以在对照动物中检测到骨转移(*)。

图8是来自实施例7的Kaplan-Meier曲线。

图9是使用LM-7细胞系的另一种肺转移模型的体内实验。照片在第13、21和28天拍摄。

图10在球形体中显示了表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞的细胞毒性作用，其中，中间的白色斑点表示肿瘤细胞(OHS细胞系)。最上方行代表未转导的T细胞(模拟物)的影响。

图11显示了从N末端至C末端的OSCAR1和OSCAR3的示意性结构。两种CAR包含连接至CD8α铰链的scFv，所述CD8α铰链进而连接至CD8α跨膜域。胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

具体实施方式

如本文所使用的，嵌合抗原受体(CAR)是包含胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号转导域的受体。

如本文所使用的，抗原结合域是能够在生理条件，具体地肿瘤环境中的生理条件下结合胞外靶标表位的蛋白质部分。抗原结合域包含两条序列：来自抗体轻链(VL)的一个可变域和来自抗体重链(VH)的一个可变域。不受理论束缚，本文中的抗原结合域的靶标可以是p80。据信该抗原是OS疗法的适合靶标，因为它似乎通过癌细胞以及与肿瘤有关的出芽性毛细血管(budding capillaries)被表达。

可以通过二硫桥或肽接头连接VH和VL序列。作为另外一种选择，两条序列可以嵌入抗体的Fab-片段中。在一个实施方式中，抗原结合域包含VL-接头-VH或者由其组成。在另一个实施方式中，抗原结合域包含VH-接头-VL或者由其组成。这些抗原结合域通常被称为单链Fv-片段(scFv)。接头必须具有特定长度以使VH和VL形成功能性抗原结合域。在一个实施方式中，接头包含10至30个氨基酸残基。在一个实施方式中，接头包含15至25个甘氨酸和/或丝氨酸残基。在一个实施方式中，接头由序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO 9)表示。

每个VL和VH包含通过框架序列侧接的3个互补决定区(CDR)。可以预期框架序列可以耐受一些改变，而不会破坏对靶标抗原的特异性和亲和力。例如，氨基酸残基的替换可以比氨基酸残基的缺失或添加更耐受。然而，CDR通常更敏感，但是偶尔可以引入保守替换，但不破坏特异性和亲和力。

在一个实施方式中，抗原结合域包含TP1 scFv-片段。TP1 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP1 VL和TP1 VH。在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 1或者与SEQ ID NO 1的序列同一性大于90％的序列；和SEQ ID NO 2或者与SEQ ID NO 2的序列同一性大于90％的序列。

在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 1或者与SEQ ID NO1的序列同一性大于90％的序列；和SEQ ID NO 2或者与SEQ ID NO 2的序列同一性大于90％的序列；但条件是与所述序列的任何差异处于氨基酸残基的保守替换形式。

在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 1或者与SEQ ID NO1的序列同一性大于90％的序列，只要CDR未被修饰；和SEQ ID NO 2或者与SEQ ID NO 2的序列同一性大于90％的序列，只要CDR未被修饰。

在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 1或者与SEQ ID NO1的序列同一性大于95％的序列；和SEQ ID NO 2或者与SEQ ID NO 2的序列同一性大于95％的序列；但条件是与所述序列的任何差异处于氨基酸残基的保守替换形式。

在一个实施方式中，抗原结合域包含TP3 scFv-片段。TP3 scFv-片段包含通过接头连接的TP3 VL和TP3 VH。在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 3或者与SEQ ID NO 3的序列同一性大于90％的序列；和SEQ ID NO 4或者与SEQ ID NO 4的序列同一性大于90％的序列。

在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 3或者与SEQ ID NO3的序列同一性大于90％的序列；和SEQ ID NO 4或者与SEQ ID NO 4的序列同一性大于90％的序列；但条件是与所述序列的任何差异处于氨基酸残基的保守替换形式。

在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 3或者与SEQ ID NO3的序列同一性大于90％的序列，只要CDR未被修饰；和SEQ ID NO 4或者与SEQ ID NO 4的序列同一性大于90％的序列，只要CDR未被修饰。

在一个实施方式中，抗原结合域包含SEQ ID NO 3或者与SEQ ID NO3的序列同一性大于95％的序列；和SEQ ID NO 4或者与SEQ ID NO 4的序列同一性大于95％的序列；但条件是与所述序列的任何差异处于氨基酸残基的保守替换形式。

如本文所使用的，术语“保守氨基酸替换”是指其中一个氨基酸残基被具有类似侧链的另一个氨基酸残基替换的氨基酸替换。具有类似侧链的氨基酸往往具有类似的性质，并因此可以预期对于多肽结构或功能重要的氨基酸的保守替换对多肽结构/功能的影响小于相同位置的非保守氨基酸替换。在本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以将保守氨基酸替换认为是其中特定氨基酸残基被相同家族中的不同氨基酸残基替换的替换。

提供了新嵌合抗原受体(CAR)。当本文中的CAR在免疫细胞表面上被表达时，则可以在药物中使用这些免疫细胞。具体地，所述免疫细胞可以在骨肉瘤的治疗中使用。在一个实施方式中，所述免疫细胞可以在转移性骨肉瘤的治疗中使用。

本公开中的CAR可以包括如上所述的任何抗原结合域。具体地，本公开中的CAR可以包括连接至CD8α铰链的如上所述的任何抗原结合域。具体地，本公开中的CAR可以包括连接至CD8α铰链的如上所述的任何抗原结合域，其中CAR还包括跨膜域并且其中胞内信号转导域包括选自4-1BB和OX40的一个共刺激域和CD3ζ信号转导域或者由其组成。

在一个具体的实施方式中，CAR包括包含TP1 scFv-片段或TP3 scFv-片段的抗原结合域、连接至抗原结合域的CD8α铰链域、连接至铰链域的跨膜域，和胞内信号转导域，其包含CD3ζ信号转导域和连接至跨膜域的4-1BB共刺激域。

在实例中证实了两种CAR的效力和安全性。一种CAR，称为OSCAR1，从N末端至C末端由SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8组成。另一种CAR，称为OSCAR3，从N末端至C末端由SEQ ID NO 3-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 4-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8组成。图11中显示了OSCAR1和OSCAR3的示意性结构。

抗原结合域可以直接附接至跨膜域。然而，CAR可以包含将抗原结合域连接至跨膜域的铰链域。因此，铰链域可以影响抗原结合域的空间构象。这进而可以影响CAR结合靶标表位的能力并随后触发向免疫细胞的信号转导。如果靶标表位距靶细胞的细胞膜过远或者如果另外靶标表位隐藏，则表达CAR的免疫细胞可能不是有效的。因此，优选地，靶向表位对于表达CAR的免疫细胞是充分可接近的。据发现本文所公开的CAR中由SEQ ID NO 5所表示的CD8α铰链域允许抗原结合域结合靶标表位并且允许表达它的免疫细胞激活。其它CD8α铰链也可以起作用，只要它们允许抗原结合域的类似空间构象。具体地，这些铰链可以包含与SEQ ID NO 5所表示的CD8α铰链大致相同数目的氨基酸残基。具体地，CD8α铰链可以由SEQ ID NO 5或者与其的序列同一性大于90％的序列表示。在一个实施方式中，铰链域不来自CD28。

如本文所使用的，“X％的序列同一性”是指当使用blastp算法，通过比对和比较时，两条序列之间X％的氨基酸残基是相同的。

跨膜域将胞外域连接至胞内信号转导域。抗原结合域和铰链域两者是胞外域，即当在免疫细胞的细胞膜中被表达时，它们通常面向胞外环境。如本文所使用的，“跨膜域”表示CAR部分，当通过免疫效应细胞被表达时，其往往嵌入细胞膜中。适合的跨膜域对于技术人员是熟知的。具体地，可以使用来自CD8α、CD28或ICOS的跨膜域。在一个实施方式中，跨膜域不来自CD28。据信一旦抗原结合域结合靶标，则跨膜域将信号传递到免疫细胞中。据发现一旦靶标结合，则由SEQ ID NO 6所表示的CD8α跨膜域允许信号转导至免疫细胞。

“胞内信号转导域”是指当CAR在细胞膜中被表达时，位于免疫细胞内部的CAR部分。一旦靶标结合，则这些域参与传递信号。已知多种信号转导域，并且它们可以组合并调节以匹配免疫细胞中的内源信号转导机制。

在一个实施方式中，胞内信号转导域包含“信号1”域，如从CD3ζ、FcR-γ、CD3ε等可获得的信号转导域。通常，据信一旦抗原结合，则“信号1”域(例如，由SEQ ID NO 8所表示的CD3ζ信号转导域)传递信号。

在另一个实施方式中，胞内信号转导域包含共刺激域。这些域是熟知的，并且通常称为“信号2”域，并且据信它们在“信号1”域之后，通过共刺激分子表达信号。“信号2”对于信号的维持和细胞的存活是重要的。如果缺少，如在第一代CAR中一样，重定向细胞可以在杀死以及在早期细胞因子释放中有效，但是通常将随时间变得枯竭。这些常用的“信号2”域的实例包括4-1BB信号转导域、CD28信号转导域、4-1BB信号转导域和ICOS信号转导域。

具体地，据发现当胞内信号转导域包含CD3ζ信号转导域(SEQ ID NO 8)和4-1BB共刺激域(SEQ ID NO 7)或者由其组成时，本文中表达CAR的细胞毒性免疫细胞在OS模型中提供了体内作用。

本文中表达CAR的免疫细胞可以通过白细胞除去法或者其它适合的方法分离自患者或相容供体。这些原代细胞可以是例如T细胞或NK细胞。具体地，可以在将包含所述细胞的药物组合物施用回患者之前，用编码CAR的核酸转导自体同源T细胞(两种细胞毒性T细胞、T辅助细胞或者这些的混合物)。表达CAR的免疫细胞还可以是适合于临床使用的细胞系，如NK-92细胞。当然，当预期患者是人类时，优选的细胞是人类的。然而，由于OS也影响狗，因此可以在狗中OS治疗中使用本文中表达CAR的犬科细胞。

本文中的药物组合物可以是适合于治疗性细胞向患者施用的任何组合物。CAR T细胞的最常见的施用途经是静脉内施用。因此，所述药物组合物可以是例如具有中性pH的无菌水溶液。例如，可以通过标准白细胞除去程序获得患者的周围血单核细胞。在用慢病毒载体或编码CAR的mRNA转导它们之前，单核细胞可以对T细胞富集。然后，可以用抗-CD3/CD28抗体涂覆珠激活所述细胞。转导的T细胞可以在细胞培养物中扩增，清洗并配制成无菌混悬液，其可以冷冻保存。如果这样，在施用前融化产物。

与CAR T细胞在骨肉瘤靶标位点的有效接近有关的一个问题是绕过实体瘤的防御。与血液学恶性肿瘤相反，实体瘤的识别需要从血液流出至肿瘤位点，并且发展出多个恶性肿瘤，从而主动阻碍T细胞浸润。在其中肿瘤定位的情况下，不同的施用方法可以用于改善效力。例如，CAR T细胞的局部，而不是全身施用可以提高效力。

药物组合物可以包含药学上有效剂量的本文的免疫细胞。药学上有效剂量可以例如在1×10⁶至1×10⁹个表达CAR的免疫细胞的范围内。药学上有效剂量可以例如在1×10⁷至5×10⁸个表达CAR的T细胞的范围内。

对于所主张的CAR在免疫细胞中的有效表达，可以将常规前导肽(即信号肽或L-链)引入N-末端以有利于在细胞膜中的定位。据信将修剪掉前导肽并且它将可能不存在于细胞膜中的功能性CAR中。据发现当通过SEQ ID NO 10表示前导肽时，本文中编码CAR的核酸被成功转录并且CAR成功移位至细胞膜。这在图1中显示。编码所主张的CAR的核酸可以处于熟知的RNA的形式，例如，mRNA或DNA表达载体，例如，逆转录病毒载体。然而，据发现在用编码它们的mRNA转导的T细胞中，包含TP3 scFv的CAR(例如，OSCAR3)的表达比包含TP1 scFv(例如，OSCAR1)的其它相同的CAR的表达更好。因此，在通过mRNA转导的免疫细胞中，包含TP3 scFv的CAR将对于瞬时表达是优选的。具体地，编码OSCAR3的mRNA可以对于T细胞中的瞬时表达是优选的。与逆转录病毒CAR表达系统相比，通过mRNA转导的CAR的瞬时表达具有安全性优势。

还发现在侵袭性转移性OS模型中，包含TP1 scFv的CAR(例如，OSCAR1)提供了改善的长期存活。因此，在免疫细胞中，包含TP1 scFv的CAR可以对于逆转录病毒表达是优选的。具体地，在T细胞中编码OSCAR1的逆转录病毒载体可以对于长期表达是优选的。

在一个实施方式中，核酸编码L-链-VL-接头-VH-CD8α铰链域-CD8α跨膜域-4-1BB共刺激域-CD3ζ信号转导域。在一个实施方式中，核酸编码L-链-VH-接头-VL-CD8α铰链域-CD8α跨膜域-4-1BB共刺激域-CD3ζ信号转导域。在一个实施方式中，提供了用于治疗骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中如本文所述，抗原结合域是TP1scFv-片段。在一个实施方式中，TP1 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP1 VL和TP1 VH。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中抗原结合域包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个实施方式中，提供了用于治疗骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中如本文所述，抗原结合域是TP3 scFv-片段。在一个实施方式中，TP3 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP3 VL和TP3 VH。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中抗原结合域是包含SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的scFv，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个实施方式中，提供了用于治疗转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中如本文所述，抗原结合域是TP1 scFv-片段。在一个实施方式中，TP1 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP1 VL和TP1 VH。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中抗原结合域是包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的scFv，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个实施方式中，提供了用于治疗转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中如本文所述，抗原结合域是TP3 scFv-片段。在一个实施方式中，TP3 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP3 VL和TP3 VH。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞；其中抗原结合域是包含SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的scFv，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞；其中抗原结合域是包含SEQ ID NO 3或与其具有大于80％的序列同一性的序列和SEQ ID NO 4或与其具有大于80％的序列同一性的序列的scFv，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个实施方式中，提供了用于治疗微转移骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中如本文所述，抗原结合域包含TP1 scFv-片段。在一个实施方式中，TP1 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP1 VL和TP1 VH。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗微转移骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中抗原结合域是包含SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的scFv，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个实施方式中，提供了用于治疗微转移骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞，其中如本文所述，抗原结合域包含TP3 scFv-片段。在一个实施方式中，TP3 scFv-片段包含通过肽接头连接的TP3 VL和TP3 VH。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗微转移骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的T细胞或NK细胞；其中抗原结合域是包含SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的scFv，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗人类患者中转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的人类T细胞或NK细胞，其中抗原结合域包含SEQ ID NO 1或与SEQ ID NO 1具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰；和SEQ ID NO 2或与SEQ ID NO 2具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗人类患者中转移性骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的人类T细胞或NK细胞，其中抗原结合域包含SEQ ID NO 3或与SEQ ID NO 3具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰；和SEQ ID NO 4或与SEQ ID NO 4具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗狗中骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的犬科(canine，狗)T细胞或NK细胞，其中抗原结合域包含SEQ ID NO 1或与SEQ ID NO 1具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰；和SEQ ID NO 2或与SEQ ID NO 2具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

在一个具体的实施方式中，提供了用于治疗狗中骨肉瘤的药物组合物，其包含药学上有效剂量的表达CAR的犬科T细胞或NK细胞，其中抗原结合域包含SEQ ID NO 3或与SEQ ID NO 3具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰；和SEQ ID NO 4或与SEQ ID NO 4具有大于90％的序列同一性的序列，只要CDR未被修饰，并且其中所述CAR包含CD8α铰链域、CD8α跨膜域，并且其中胞内信号转导域包含4-1BB共刺激域和CD3ζ信号转导域。

被诊断患有局部OS的多位患者出现OS转移。转移性OS是从初始受影响的骨扩散至远离原始位点的体内一个或多个位点的骨肉瘤。在初步诊断时，可检测的OS转移存在于大部分患者中。尽管这些检测的肺转移能够手术切除，但是任何残留的微转移可以引起后续复发，并最终导致死亡。据信在检测的肺转移手术切除之后，OS微转移存在于大部分患者中。由于它们尺寸小，因此微转移肿瘤几乎通过当前程序是不可检测的，并由此得名微转移OS。然而，通过静脉内输注，本文中表达CAR的免疫细胞可以迁移至肺并浸润这些微转移肿瘤。具体地，当CAR T细胞成功结合OS微转移肿瘤中的它们的靶标并且成功激活T细胞时，可以触发细胞毒性作用。因此，本文所公开的药物组合物可以提供转移性OS和/或微转移OS的替代疗法。

在一个具体的实施方式中，提供了骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码包含TP1 scFv-片段的CAR的病毒载体转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向诊断患有骨肉瘤的患者施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物。

在一个具体的实施方式中，提供了骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码OSCAR1的病毒载体转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向诊断患有骨肉瘤的患者静脉内施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物。

在一个具体的实施方式中，提供了转移性骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码OSCAR1的病毒载体转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向诊断患有转移性骨肉瘤的患者静脉内施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物。

在一个具体的实施方式中，提供了微转移骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码OSCAR1的病毒载体转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向先前诊断患有转移性骨肉瘤的患者施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物，其中目前未检测到可检测的转移。

在一个具体的实施方式中，提供了骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码包含TP3 scFv-片段的CAR的mRNA转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向诊断患有骨肉瘤的患者施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物。

在一个具体的实施方式中，提供了骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码OSCAR3的mRNA转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向诊断患有骨肉瘤的患者施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物。

在一个具体的实施方式中，提供了转移性骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码OSCAR3的mRNA转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向诊断患有转移性骨肉瘤的患者施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物。

在一个具体的实施方式中，提供了微转移骨肉瘤的治疗方法，其包括以下步骤：

a)用编码OSCAR3的mRNA转导NK细胞和/或T细胞群体，

b)向先前诊断患有转移性骨肉瘤的患者施用包含来自步骤a)的细胞的药物组合物，其中目前未检测到可检测的转移。

序列：

SEQ ID NO 1(TP1 VL，其中CDR用方框表示)

SEQ ID NO 2(TP1 VH，其中CDR用方框表示)

SEQ ID NO 3(TP3 VL，其中CDR用方框表示)

SEQ ID NO 4(TP3 VH，其中CDR用方框表示)

SEQ ID NO 5CD8α铰链域

SEQ ID NO 6CD8α跨膜域

SEQ ID NO 7 4-1BB共刺激域

SEQ ID NO 8CD3ζ信号转导域

SEQ ID NO 9接头

GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO 10L-链

METDTLLLWVLLLWVPGSTG

实施例

实施例1

CAR设计

将两种新型第二代CAR克隆至pENTR载体(Invitrogen)中并通过重组进一步亚克隆至Gateway系统相容性表达载体，逆转录病毒构建体pMP71和mRNA合成构建体pCIpA102按照我们之前的出版物进行(等人,PLoS One.2011；6(11):e27930和Inderberg E.M.,S.(2019)Chimeric Antigen Receptor preparation from hybridoma to T-cell expression.Antibody Therapeutics,第2卷,第2期,2019年4月,第56–63页)。

载体所编码的CAR序列为L-链-VL-链-接头-VH-链-CD8α铰链域-CD8α跨膜域-4-1BB共刺激域-CD3ζ信号转导域。

因此，表达OSCAR1的载体编码SEQ ID NO 10-SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO8。

表达OSCAR3的载体编码SEQ ID NO 10-SEQ ID NO 3-SEQ ID NO9-SEQ ID NO 4-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8。

实施例2：

CAR表达

制备来自实施例1的OSCAR1和OSCAR3的逆转录病毒颗粒并通过熟知的方法转导分离自健康供体周围血单核细胞(PBMC)的原代T细胞(等人,PLoS One.2011；6(11):e27930)。48小时后，使用抗-小鼠Fab抗体(抗-CAR)通过流式细胞术分析CAR的存在。图1中包括了结果。

在以下实施例中，将表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞与未转导的T细胞(模拟物)相比较。在一些图中，T细胞缩写为Tc。因此，“OSCAR1Tc”和“Tc OSCAR-1”两者表示表达OSCAR1的T细胞。因此，“OSCAR3Tc”和“Tc OSCAR-3”两者表示表达OSCAR3的T细胞。

实施例3

CAR体外功能(杀死和细胞因子释放)

将单独的T细胞(模拟物)、表达OSCAR1的T细胞和表达OSCAR3的T细胞与指定的靶细胞培育24小时。然后收获上清液，并通过BioPlex检测细胞因子的存在。如所示的，通过特异性刺激，对于TNFα和IFNγ释放，OSCAR重定向细胞被强烈激活。

靶细胞系的体外杀死：

通过将表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞与骨肉瘤细胞系(OHS、SAOS-2、OSA)培育20小时证实了靶细胞系的体外杀死。所有靶细胞组成性表达融合至GFP的荧光素酶基因，并且通过已知的方法，通过添加荧光素酶底物，将荧光素酶的存在用于检测细胞杀死(Walseng等人,Sci Rep.2017年9月6日；7(1):10713)。通过测量靶细胞中荧光素酶信号的变化监测T细胞杀死(BLI测定)。图3a、3b和3c显示了结果。

实施例4

CAR体内功能(异种移植模型)

为了评价CAR效力，使用了动物模型，其中在小鼠中植入了人骨肉瘤细胞系。通过腹膜内注射10⁶个表达荧光素酶基因的OHS细胞来实施移植。当肿瘤变得明显时，将小鼠随机分组并使用OSCAR1或OSCAR3重定向或未重定向的T细胞处理或不处理小鼠。实施3次10X10⁶个T细胞注射，并且通过IVIS监测肿瘤生长(荧光素酶信号检测)。另外，还研究了小鼠的存活。条件：每组5只小鼠，N＝2。

图4a显示了治疗方案和时间线。图4b是如左侧所指示的，所处理的小鼠的IVIS照片的实例(在本文中第20天)。如所示的，在第20天，OSCAR1和OSCAR3处理的动物显示出极低至不可检测的肿瘤负荷。图4c是每只动物的荧光素酶信号的蜘蛛图，其显示OSCAR构建体可以控制肿瘤发展。这与图4d中的存活曲线(Kaplan-Meier)一致，其显示80％OSCAR1处理的动物在终点时存活。OSCAR3处理的动物的表现比模拟物和盐水处理的动物更好，并且在存活曲线上与OSCAR1动物无统计学差异。

实施例5

CAR体内功能(异种移植模型)

我们还使用了肺转移肿瘤模型，其中nod-scid小鼠静脉内(iv)注射了OSA(荧光素酶 )细胞系，如图5a所示。该细胞系定殖在肺中并且建立了侵袭性肿瘤，其导致动物在大约25-30天后死亡。4天后，肿瘤负荷在肺中是可检测的，并且将小鼠随机分组并用OSCAR T细胞处理。对小鼠静脉内注射四次10⁶个OSCAR-重定向T细胞，并通过IVIS分析肿瘤发展。如所示的，与模拟物或媒介物处理的动物相比，OSCAR1或OSCAR3对肿瘤生长的控制时间更长，但动物最终出现肿瘤。Kaplan Meier曲线在统计学上确认了这种保护作用，尽管在该侵袭性模型中，动物无法救活。

实施例6

CAR安全性

CAR疗法可以被认为是危险的疗法。这主要是由于对给定构建体的不可预测的靶向可以针对健康组织。为了测试OSCAR1和OSCAR3的特异性，对造血细胞进行了一系列测试。该测定在于作为干细胞源从供体分离骨髓。从相同供体采集血液，并在与干细胞共培育之前，分离T细胞并用所关注的CAR修饰。然后，使集落在不同培养基中生长以扩增每种类型的血液祖代。当集落变得明显时，对其计数并与对照相比。

用所指明的CAR构建体的mRNA对来自两种供体的T细胞电穿孔或模拟电穿孔。如图6a所示，OSCAR1或OSCAR3均对集落形成无任何作用，表明它们的靶标不存在于祖细胞血细胞上。当使用稳定表达OSCAR1或OSCAR3的自体同源T细胞时，我们确认了这些数据，在本文中再次未检测到统计学影响(参见图6b)，表明OSCAR不杀死造血干细胞。

实施例7

与其中显示照片的实施例5相同的实验(参见图7)证实在对照动物中存在骨转移(*)，然而OSCAR处理的动物控制肿瘤发展。

实施例8

基于实施例7的Kaplan-Meier存活曲线证实OSCAR1和OSCAR3两者能够控制肺中的肿瘤生长，因此延长了动物的存活(参见图8)。注意，OSA是强侵袭性细胞系(Lauvrak等人Br J Cancer.2013年10月15日；109(8):2228–2236)，并且该实验可能首次证实了CAR T细胞在这种模型中的效力。

实施例9

我们使用了替代且低侵袭性肺转移肿瘤模型。对Nod-scid小鼠静脉内(iv)注射LM-7(荧光素酶 )细胞系，其也被OSCAR1和OSCAR3体外识别并且比OSA更缓慢地形成肺转移。在静脉内注射后，该细胞系定殖在肺中并且建立了侵蚀性肿瘤，其导致动物在大约40-50天后死亡。处理后5天，将小鼠随机分组并用OSCAR T细胞处理。对小鼠静脉内注射四次10⁶个OSCAR-重定向T细胞，并通过IVIS分析肿瘤发展。如图9所示，与模拟物相比，OSCAR控制肿瘤生长，这支持了转导细胞的优良效力。

实施例10

使五千个骨肉瘤细胞(OHS细胞系)来源的肿瘤球形体生长7天并通过荧光活细胞显微镜监测(GFP＝白色)。添加T细胞(模拟物或表达OSCAR)，并在规律的时间点采集照片来分析GFP信号。如图10所示，表达OSCAR1或OSCAR3的T细胞能够杀死球形体内部的肿瘤细胞。

序列表

<110> 奥斯陆大学医院HF（Oslo Universitetssykehus HF）

<120> 新CAR以及它们在药物中的用途

<130> P26318PC00

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> TP1免疫球蛋白轻链可变区

<400> 1

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Gly Ser Ala

20 25 30

Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Trp Ala Ser Ile Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> TP1免疫球蛋白重链可变区

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu

65 70 75 80

His Leu Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ser Ala Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Gly Asn Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Ala Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 111

<212> PRT

<213> TP3免疫球蛋白轻链可变区

<400> 3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Gly

20 25 30

Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro

65 70 75 80

Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu

85 90 95

Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105 110

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> TP3免疫球蛋白重链可变区

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Tyr Gly His Asp Tyr Ala Met

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 55

<212> PRT

<213> CD8α铰链域

<400> 5

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

50 55

<210> 6

<211> 21

<212> PRT

<213> CD8α跨膜域

<400> 6

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr

20

<210> 7

<211> 47

<212> PRT

<213> 7 4-1BB共刺激域

<400> 7

Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

1 5 10 15

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

20 25 30

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40 45

<210> 8

<211> 113

<212> PRT

<213> CD3ζ信号转导域

<400> 8

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

50 55 60

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

65 70 75 80

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

85 90 95

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

100 105 110

Arg

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 接头

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 10

<211> 20

<212> PRT

<213> L-链

<400> 10

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20