一种基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法。


背景技术：

2.炭疽是由炭疽芽胞杆菌引起的人兽共患传染病。炭疽芽胞杆菌(bacillus anthracis，简称炭疽杆菌)是一种重要的烈性病原体与潜在生物战剂。人类通过接触带菌动物或动物制品而感染，根据不同的感染途径分为皮肤炭疽、肺炭疽和肠炭疽三种类型。炭疽芽胞杆菌具有全球流行性、环境耐受性和感染破坏性等特点。面对常有出现并且涉及区域广泛的炭疽疫情，选择快速、准确的炭疽杆菌鉴定方法是至关重要的。
3.传统的鉴定方法为培养鉴定法，显然已经无法满足现实需求。蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和炭疽杆菌的基因组同源性非常高。研究者认为炭疽芽胞杆菌是在1
‑
2万年前从蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌进化而来，并在进化过程中获得了pxo1和pxo2两个毒力相关质粒，分别指导合成外毒素和多肽荚膜，使其成为烈性病原菌。质粒上特有的序列被用来当作鉴定靶标使用，在遇到非典型菌株(如质粒丢失的菌株)不能够有效进行鉴别。还有一些染色体上的引物用来区分这两种菌，但菌株数目太少，引物特异性有限。
4.测序技术的迅速发展，越来越多菌株获得全基因组序列，但ncbi的炭疽芽胞杆菌基因组数据库中竟然还包含了一些非炭疽芽胞杆菌基因组数据。类炭疽芽胞杆菌的蜡样芽胞杆菌混入炭疽芽胞杆菌基因组数据库容易误导相关人员进行后续分析，一个简单快速高效的区分炭疽芽胞杆菌的方法亟待需要。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法。
6.第一方面，本发明要求保护一种用于鉴定或者辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的探针组。
7.本发明要求保护的用于鉴定或者辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的探针组，可由如下组成：
8.探针1：seq id no.1所示单链dna；
9.探针2：seq id no.2所示单链dna；
10.探针3：seq id no.3所示单链dna；
11.探针4：seq id no.4所示单链dna；
12.探针5：seq id no.5所示单链dna；
13.探针6：seq id no.6所示单链dna；
14.探针7：seq id no.7所示单链dna；
15.探针8：seq id no.8所示单链dna；
16.探针9：seq id no.9所示单链dna；
17.探针10：seq id no.10所示单链dna；
18.探针11：seq id no.11所示单链dna；
19.探针12：seq id no.12所示单链dna；
20.探针13：seq id no.13所示单链dna；
21.探针14：seq id no.14所示单链dna；
22.探针15：seq id no.15所示单链dna；
23.探针16：seq id no.16所示单链dna；
24.探针17：seq id no.17所示单链dna；
25.探针18：seq id no.18所示单链dna；
26.探针19：seq id no.19所示单链dna；
27.探针20：seq id no.20所示单链dna；
28.探针21：seq id no.21所示单链dna；
29.探针22：seq id no.22所示单链dna；
30.探针23：seq id no.23所示单链dna；
31.探针24：seq id no.24所示单链dna；
32.探针25：seq id no.25所示单链dna；
33.探针26：seq id no.26所示单链dna；
34.探针27：seq id no.27所示单链dna；
35.探针28：seq id no.28所示单链dna；
36.探针29：seq id no.29所示单链dna；
37.探针30：seq id no.30所示单链dna；
38.探针31：seq id no.31所示单链dna；
39.探针32：seq id no.32所示单链dna；
40.探针33：seq id no.33所示单链dna；
41.探针34：seq id no.34所示单链dna；
42.探针35：seq id no.35所示单链dna；
43.探针36：seq id no.36所示单链dna；
44.探针37：seq id no.37所示单链dna；
45.探针38：seq id no.38所示单链dna；
46.探针39：seq id no.39所示单链dna；
47.探针40：seq id no.40所示单链dna；
48.探针41：seq id no.41所示单链dna；
49.探针42：seq id no.42所示单链dna；
50.探针43：seq id no.43所示单链dna；
51.探针44：seq id no.44所示单链dna；
52.探针45：seq id no.45所示单链dna；
53.探针46：seq id no.46所示单链dna；
54.探针47：seq id no.47所示单链dna；
55.探针48：seq id no.48所示单链dna；
56.探针49：seq id no.49所示单链dna；
57.探针50：seq id no.50所示单链dna；
58.探针51：seq id no.51所示单链dna。
59.第二方面，本发明要求保护用于鉴定或者辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的探针。
60.本发明要求保护的用于鉴定或者辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的探针，可为前文第一方面中的所述探针1至所述探针51中的任意一个。
61.第三方面，本发明要求保护含有前文第一方面所述探针组或前文第二方面所述探针的试剂盒。
62.第四方面，本发明要求保护前文第一方面所述探针组或前文第二方面所述探针或前文第三方面所述试剂盒在如下任一中的应用：
63.p1、鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌；
64.p2、制备用于鉴定或辅助鉴定炭疽芽胞杆菌的产品；
65.p3、检测或者辅助检测待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌；
66.p4、制备用于检测或者辅助检测待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌的产品；
67.p5、检测或者辅助检测目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌；
68.p6、制备用于检测或者辅助检测目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌的产品。
69.第五方面，本发明要求保护一种检测或者辅助检测待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌的方法。
70.本发明要求保护的检测或者辅助检测待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌的方法，可为方法a
71.或方法b。
72.所述方法a可包括如下步骤：
73.(a1)对待测菌株进行全基因组测序；
74.(a2)用生物信息学软件将测序结果与前文第一方面所述探针组中的每个探针的序列进行比对；
75.(a3)根据(a2)比对结果按照如下确定所述待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌：如果测序结果中存在所述探针组中的任何一条探针序列，则所述待测菌株为或候选为炭疽芽胞杆菌；如果测序结果中不存在所述探针组中的任何一条探针序列，则所述待测菌株不为或候选不为炭疽芽胞杆菌。
76.所述方法b可包括如下步骤：
77.(b1)采用前文第一方面所述探针组中每个探针分别与所述待测菌株的基因组进行杂交；
78.(b2)根据(b1)所得结果按照如下确定所述待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌：若所述探针组中任何一条探针与所述待测菌株的基因组杂交后有阳性信号，则所述待测菌株为或候选为炭疽芽胞杆菌；若所述探针组中任何一条探针与所述待测菌株的基因组杂交后都没有产生阳性信号，则所述待测菌株不为炭疽芽胞杆菌。
79.在该方法中，检测出的探针越多，则结果越可靠，多条探针能够避免由于测序质量较差，或人工修饰细菌导致错误鉴定。
80.所述方法可为非疾病诊断治疗方法，如用于单纯的检测待测菌株是否为炭疽芽胞杆菌，而不涉及任何疾病诊断目的。
81.第六方面，本发明要求保护一种检测或者辅助检测目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌的方法。
82.本发明要求保护的检测或者辅助检测目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌的方法，可为方法c或方法d。
83.所述方法c可包括如下步骤：
84.(c1)对目标个体的供试样本进行细菌全基因组提取，然后进行测序；
85.(c2)用生物信息学软件将测序结果与前文第一方面所述探针组中的每个探针进行序列比对；
86.(c3)根据(c2)序列比对结果按照如下确定所述目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌：如果测序结果中存在所述探针组中的任何一条探针序列，则所述目标个体携带或候选携带炭疽芽胞杆菌；如果测序结果中不存在所述探针组中的任何一条探针序列，则所述目标个体不携带或候选不携带炭疽芽胞杆菌。
87.所述方法d可包括如下步骤：
88.(d1)对目标个体的供试样本进行细菌全基因组提取，然后采用前文第一方面所述探针组中每个探针分别与提取的基因组进行杂交；
89.(d2)根据(d1)所得结果按照如下确定所述目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌：若所述探针组中任何一条探针与步骤(d1)提取的基因组杂交后有阳性信号，则所述目标个体携带或候选携带炭疽芽胞杆菌；若所述探针组中任何一条探针与步骤(d1)提取的基因组杂交后都没有产生阳性信号，则所述目标个体不携带或候选不携带炭疽芽胞杆菌。
90.在该方法中，检测出的探针越多，则结果越可靠，多条探针能够避免由于测序质量较差，或人工修饰细菌导致错误鉴定。
91.所述方法可为非疾病诊断治疗方法，如用于单纯的检测目标个体是否携带炭疽芽胞杆菌(如用于海关检验检疫)，而不涉及任何疾病诊断目的。
92.在上述各方面中，所述待测菌株可为任意菌株，包括但不限于蜡样芽胞杆菌家族菌株。
93.进一步地，所述蜡样芽胞杆菌家族菌株具体可为炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌或苏云金芽胞杆菌。
94.本发明人经过对ncbi数据库中炭疽和非炭疽杆菌芽胞杆菌属菌株的全基因组序列深入的研究，借助本地blast，编写python程序，进行大量的筛选比对，确定了炭疽杆菌基因组序列中保守的dna区域。筛选出特异探针序列，，这些探针涉及医用检查检验仪器及服务中的体外诊断用试剂，可用于对于未知样品的测序结果(包括二代或三代)进行检测，由于本发明采用多达51条特异探针，只要有任何一条探针检测出来，就可以判定为阳性，检测出来的探针越多，可信度越高，从而保证了即使测序质量差及覆盖度不高的基因组序列，也可以用这些电子探针进行查询，快速简便高效地鉴定出该样品是否携带有炭疽杆菌。
附图说明
95.图1为本发明特异性标签截取思路。
96.图2为炭疽杆菌与蜡样杆菌、苏云金杆菌全基因组的聚类树。炭疽芽胞杆菌统一采用baxxx，蜡样芽胞杆菌采用bcxxxx，苏云金芽胞杆菌采用btxxx。
97.图3为baf_1探针(seq id no.1)在ncbi库中blast测试结果。
98.图4为baf_1探针(seq id no.1)在单个菌株中blast具体结果示例，图中方框标注的即为被剔除的可疑炭疽杆菌。该图中标注a和b的部分对应的菌株分别为图3中标注的a和b对应的菌株。
具体实施方式
99.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
100.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
101.实施例1、基于染色体特异探针的炭疽芽胞杆菌鉴定方法的建立
102.本文所描述的炭疽杆菌基因组序列是炭疽芽胞杆菌标准株bacillus anthracis ames ancestor染色体序列(genbank：nc_007530，25
‑
oct
‑
2020)，所述的核酸序列位置也是以bacillus anthracis amesancestor染色体(genbank：nc_007530，25
‑
oct
‑
2020)为标准计算的。
103.1、从ncbi基因组数据库下载炭疽杆菌(共252株，表1)基因组和芽胞杆菌属中非炭疽杆菌的菌种(包括83个种细菌共4695株菌，表1)基因组(为了方便叙述，在下文中分别简称为：炭疽杆菌和非炭疽杆菌)。
104.表1、芽胞杆菌菌种名称及菌种数目信息表(4947株)
105.[0106][0107]
注：bacillus anthracis*表示可疑的炭疽芽胞杆菌。
[0108]
2、截取bacillus anthracis ames ancestor染色体序列(genbank：nc_007530，25
‑
oct
‑
2020)片段(步长1bp step；长度100bp)，共截取5227320个100bp长的片段，如图1所示。
[0109]
3、通过本地blast(blast
‑
2.7.1 )，去除出现在芽胞杆菌属非炭疽杆菌中的4665794个标签，剩余561526个标签。
[0110]
4、编写python程序，查询这561526个标签中在所有炭疽杆菌(bacillus anthracis共252株菌，与公开数据库中对应的命名见表2)中都出现的标签，在此过程中发现在12株菌中，这些标签的检出率仅为0.07％
‑
2.02％，而其它的240株炭疽菌，这些标签的检出率为59.28％
‑
100％。后经全基因组聚类树分析，片段检出率非常低的这12株菌，都不是炭疽杆菌(图2)。故将它们从基因组训练集剔除。结果我们获得了95823个在所有炭疽杆菌(240株)中都出现的标签。
[0111]
表2、炭疽芽胞杆菌assembly id及重命名对应表
[0112]
[0113]
[0114]
[0115][0116]
5、根据片段之间的重叠合并这95823标签，得到1355个特异片段，这些片段长度在101bp
‑
915bp之间。
[0117]
6、用这1355个片段与蜡样芽胞杆菌(1118株)和苏云金芽胞杆菌(622株)进行本地blast，并根据blast结果截取每一株菌对应的dna序列，并做成fasta格式。
[0118]
7、采用megax软件对步骤6获得的文件进行比对，寻找能够区分炭疽杆菌与其它所有近源菌的snp位点，结果发现共有610个片段含有snp位点。
[0119]
8、为了方便应用及提高检测的特异性，我们从这610个片段中选取含有至少2个(包含2个)以上snp位点的51个序列，并截取含这些snp位点的100
‑
200bp长度的序列作为电子标签(表3)，用于炭疽杆菌的快速鉴定。
[0120]
表3、特异电子探针序列
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125][0126]
注：表中开始和结束位置是以炭疽芽胞杆菌标准株bacillus anthracis ames ancestor染色体序列(genbank：nc_007530，25
‑
oct
‑
2020)为标准计算的。探针序列对应的是在炭疽芽胞杆菌基因组中的序列。
[0127]
9、为了测试这51条电子探针在更大的数据库中的特异性，将这51个电子探针进行在线blast查询(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，结果显示这51个电子探针均只能在bacillus anthracis中达到query cover和per.ident(percentage of identity)值均100％，序列完全一致，在其它菌株中均不能查到，不能满足query cover和per.ident值均100％，序列不完全一致。
[0128]
以ba_f1(seq id no.1)为例测试结果如图3，结果显示该电子探针只能在bacillus anthracis中达到query cover和per.ident(percentage of identity)值均100％，具体展示如图4中a，序列完全一致，在其它菌株中不能查到，如图4中b显示，不能满足query cover和per.ident值均100％，序列不完全一致。
[0129]
10、综上所述，可见：利用本发明的51条炭疽杆菌特异性电子探针和方法，可以简单快速鉴定待测菌株是否为炭疽杆菌，以及目标个体是否携带有炭疽杆菌。
[0130]
步骤：
[0131]
(1)收集待测菌株或来自目标个体的样本，提取其基因组，细菌全基因组提取按照bacterial genomic dna extraction kit试剂盒步骤进行。
[0132]
(2)基因组样本使用测序仪进行测序，二代测序或三代测序皆可。
[0133]
(3)用生物信息学软件将测序结果与探针序列进行比对和分析。
[0134]
(4)如果测序结果与其中任何一条探针100％吻合(即序列完全一致)，则检测结果为阳性，该样本携带有炭疽杆菌，检测出的探针越多，则结果越可靠，多条电子探针能够避免由于测序质量较差，或人工修饰细菌导致错误鉴定，如果所有的探针都未检测到(未检测到即序列不完全一致)就是阴性。
[0135]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。