一种微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法与流程

1.本发明涉及精子冷冻保存技术领域，尤其涉及一种微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法。


背景技术：

2.环境污染日趋严重、激素滥用等导致男性精子质量和数量不断下降，男性不育比例日益增高，世界范围内由于男性不育问题导致的不育大约占40
‑
50％，而无精子症大约占男性不育问题的10％，影响着全世界1％的男性人群，而且无精子症的发生率会逐渐升高。
3.无精子症患者在以前是无法拥有自己遗传学意义上的孩子，而随着辅助生殖技术的发展，无精子症患者可以通过经皮附睾精子抽吸术(pesa)、睾丸切开取精术(tesa)、显微睾丸切开取精术(mese)等技术来获取少量的精子，再通过卵胞浆内单精子注射(icsi)将精子注射到卵母细胞中，最后将形成的胚胎移植到女性宫腔内获得临床妊娠。但是反复的取精术可能造成睾丸、附睾组织纤维化，导致睾丸萎缩、生精功能退化。因此将少量活动精子冷冻保存起来，既减轻患者因为反复穿刺所带来的痛苦和经济负担，又可以很大程度上避免取卵日因无可用精子而取消受精。
4.与常规精液冷冻相比，微量精子冻存由于精子数量少，复苏后精子活率及回收率低，冷冻难度较大。微量精子冻存首先应选择合适的精子冻融载体。为了有效保存这些微量精子，国内外学者采用各种不同的载体来冷冻微量精子，这些载体包括了常规冷冻管、麦管、透明带、冷冻环和icsi注射针等。精子头部直径4
‑
5μm，尾部长40
‑
50μm，应用常规冷冻管或麦管，冷冻前要用冷冻保护剂稀释，目前所制备的冷冻保护剂大多为简单甘油，导致解冻后精子直线运动及宫颈黏膜穿透试验效果较差，稀释及管壁粘附使得精子密度进一步降低，复苏后回收率低，甚至难以发现，且由于冷冻过程中细胞内冰晶形成等因素会导致复苏后精子细胞膜损伤严重，导致无法用于后续的辅助生殖治疗。另外一些研究利用人类和小鼠的空透明带冷冻微量精子，但人卵透明带较难获得，且可能存在污染的问题，难以推广应用。冷冻环、icsi注射针也有被应用于微量精子冷冻，但精子加载难度较大。
5.因此，有必要提供一种新的微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法解决上述技术问题。


技术实现要素：

6.本发明解决的技术问题是提供一种具有提高复苏回收率、易于发现、降低对复苏后精子细胞膜损伤、避免污染、便于推广应用的微量精子冷冻保存载体、装置及相应的冷冻和解冻方法。
7.为解决上述技术问题，本发明提供的微量精子冷冻保存载体包括：外套管和盖子，所述盖子与所述外套管相适配，所述外套管的上下端面均为贯穿开口；承载斗，所述承载斗固定安装在所述外套管内，所述承载斗的底部为尖端状，所述承载斗的内角为60
°
；张力弧片，所述张力弧片固定安装在所述承载斗内，所述外套管、承载斗和张力弧片均为透明分子
制成。
8.优选的，所述外套管以所述承载斗为界限分为存放区和速冷扩展接触区，所述存放区位于所述速冷扩展接触区的上方，所述存放区的体积小于所述速冷扩展接触区的体积，所述存放区的内壁上开设有内螺纹，所述盖子上开设有外螺纹，所述外螺纹与所述内螺纹相适配。
9.优选的，所述承载斗以所述张力弧片为界限分为液留区和放置区，所述液流区位于所述放置区的上方，所述液流区的体积大于所述放置区的体积，所述液流区与所述存放区相连通。
10.优选的，所述张力弧片的内槽形成张力形成区，所述张力形成区的底部内壁上开设有张力形成口，所述张力形成区与所述液流区相连通，所述张力形成口与所述放置区相连通。
11.本发明还提供一种微量精子冷冻保存载体的冷冻方法，包括以下步骤：
12.冷冻存放时：待精液液化后进行镜检，根据精子的密度确定混合时精液与冷冻保护剂的体积比，精子密度为60
×
106/ml时精液与冷冻保护剂1：1混合；(20～60)
×
106/ml时精液与冷冻保护剂2：1混合：20
×
106/ml时精液与冷冻保护剂4：1混合；
13.之后缓慢逐滴加入冷冻保护剂，混匀，重新测定每毫升混合液中活动精子的数目，10
×
106/ml或以上是较为理想的，随后将数支外套管置于液氮罐中的铝支架中进行熏冻，使外套管的高度距离液氮液面15～20cm，随后在外套管的存放区和承载斗内注入足量的冷冻保护剂，用以提高精子存活率，冷冻保护剂的注液高度需高于承载斗的高度，但不得高于存放区的一半，注入冷冻保护剂后迅速使用移液枪或巴斯德枪吸取混合液，之后使枪头贯穿张力形成口置于放置区内，使混合液置于放置区内即可缓慢抽出并迅速盖上盖子，在熏冻时，液氮气体通过外套管底部的速冻扩展接触区进入，增大了液氮与外套管和承载斗的接触面，有利于提高冷冻效率，熏冻时温度以10℃/min下降，待熏蒸30min后将本装置迅速置于液氮罐中即可完成操作。
14.优选的，所述冷冻保护剂选用不含蛋黄的冷冻保护剂，所述冷冻保护剂选用不含蛋黄的冷冻保护剂，所述不含蛋黄的冷冻保护剂的成分和制备方法如下：蒸馏水850ml、甘油150ml、氯化钠5.8g、氯化钾0.4g、乳酸钙0.76g、硫酸镁0.12g、磷酸二氢钠0.05g、碳酸氢钠2.6g、hepes4.77g、葡萄糖8.59g、果糖8.59g、甘氨酸10.00g、链霉素0.05g、青霉素0.05g和人血清白蛋白4.00g，制备时将上述除甘油和人血清白蛋白之外的其余物质加在一起，摇动使之充分溶解，然后加入人血清白蛋白溶解，最后加入甘油充分混匀，过滤，即可在
‑
20℃下保存。
15.本发明还提供一种微量精子冷冻保存载体的解冻方法，包括如下步骤：
16.解冻复苏时，将外套管由液氮罐中取出后，将其放置在37℃的水中采用水浴法进行解冻，解冻后将其置于显微镜处，由于外套管、承载斗和张力弧片均为透明分子制成，因此可观察和控制精子的位置，避免精子丢失，取出的精子迅速放置在培养液中进行培养。
17.与相关技术相比较，本发明提供的微量精子冷冻保存载体、装置及相应的冷冻和解冻方法具有如下有益效果：
18.本发明提供一种微量精子冷冻保存载体、装置及相应的冷冻和解冻方法：
19.1、通过贯穿式的外套管便于放置精子和提高冷冻效率，承载斗便于形成隔离区，
底部的锥形不但利于限制精子的放置空间，能够避免精子窜流，同时增大了接触面，提高了冷冻效率，张力弧片形成的张力形成口和张力形成区能够对精子进行保护，利于人们放置和寻找，由于外套管、承载斗和张力弧片均为透明分子制成，因此可观察和控制精子的位置，避免精子丢失，取出的精子迅速放置在培养液中进行培养；
20.2、通过不含卵黄的冷冻保护液避免发生由卵黄导致的病毒感染和过敏反应；无卵黄冻融后而致的大量颗粒和碎片；可以随时配制，并且可以贮存长达个月；使用过程中易于分离提纯精子，特别适用于严重少精症精子的冷冻；不含非人体蛋白质，所以可以施行间隔时间短的多次授精；可以先将精子分离后再冷冻保存精子悬液。
附图说明
21.图1为本发明提供的微量精子冷冻保存载体、装置。
22.图中标号：1、外套管；101、存放区；102、速冷扩展接触区；2、盖子；3、承载斗；301、液留区；302、放置区；4、张力弧片；401、张力形成区；402、张力形成口。
具体实施方式
23.下面结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。
24.请结合参阅图1，其中，图1为本发明提供的微量精子冷冻保存载体。微量精子冷冻保存载体包括：外套管1和盖子2，所述盖子2与所述外套管1相适配，所述外套管1的上下端面均为贯穿开口；承载斗3，所述承载斗3固定安装在所述外套管1内，所述承载斗3的底部为尖端状，所述承载斗3的内角为42
‑
60
°
；张力弧片4，所述张力弧片4固定安装在所述承载斗3内，所述外套管1、承载斗3和张力弧片4均为透明分子制成。
25.所述外套管1以所述承载斗3为界限分为存放区101和速冷扩展接触区102，所述存放区101位于所述速冷扩展接触区102的上方，所述存放区101的体积小于所述速冷扩展接触区102的体积，所述存放区101的内壁上开设有内螺纹，所述盖子2上开设有外螺纹，所述外螺纹与所述内螺纹相适配。
26.所述承载斗3以所述张力弧片4为界限分为液留区301和放置区302，所述液流区301位于所述放置区302的上方，所述液流区301的体积大于所述放置区302的体积，所述液流区301与所述存放区101相连通。
27.所述张力弧片4的内槽形成张力形成区401，所述张力形成区401的底部内壁上开设有张力形成口402，所述张力形成区401与所述液流区301相连通，所述张力形成口402与所述放置区302相连通，通过贯穿式的外套管1便于放置精子和提高冷冻效率，承载斗3便于形成隔离区，底部的锥形不但利于限制精子的放置空间，能够避免精子窜流，同时增大了接触面，提高了冷冻效率，张力弧片4形成的张力形成口402和张力形成区401能够对精子进行保护，利于人们放置和寻找，由于外套管1、承载斗3和张力弧片4均为透明分子制成，因此可观察和控制精子的位置，避免精子丢失，取出的精子迅速放置在培养液中进行培养。
28.本发明还提供一种微量精子冷冻保存载体的冷冻方法，包括以下步骤：
29.冷冻存放时：待精液液化后进行镜检，根据精子的密度确定混合时精液与冷冻保护剂的体积比，精子密度为60
×
106/ml时精液与冷冻保护剂1：1混合；(20～60)
×
106/ml时精液与冷冻保护剂2：1混合：20
×
106/ml时精液与冷冻保护剂4：1混合；
30.之后缓慢逐滴加入冷冻保护剂，混匀，重新测定每毫升混合液中活动精子的数目，10
×
106/ml或以上是较为理想的，随后将数支外套管1置于液氮罐中的铝支架中进行熏冻，使外套管1的高度距离液氮液面15～20cm，随后在外套管1的存放区101和承载斗3内注入足量的冷冻保护剂，用以提高精子存活率，冷冻保护剂的注液高度需高于承载斗3的高度，但不得高于存放区101的一半，注入冷冻保护剂后迅速使用移液枪或巴斯德枪吸取混合液，之后使枪头贯穿张力形成口402置于放置区302内，使混合液置于放置区302内即可缓慢抽出并迅速盖上盖子2，在熏冻时，液氮气体通过外套管1底部的速冻扩展接触区102进入，增大了液氮与外套管1和承载斗3的接触面，有利于提高冷冻效率，熏冻时温度以10℃/min下降，待熏蒸30min后将本装置迅速置于液氮罐中即可完成操作。
31.所述冷冻保护剂选用不含蛋黄的冷冻保护剂，所述不含蛋黄的冷冻保护剂的成分和制备方法如下：蒸馏水850ml、甘油150ml、氯化钠5.8g、氯化钾0.4g、乳酸钙0.76g、硫酸镁0.12g、磷酸二氢钠0.05g、碳酸氢钠2.6g、hepes4.77g、葡萄糖8.59g、果糖8.59g、甘氨酸10.00g、链霉素0.05g、青霉素0.05g和人血清白蛋白4.00g，制备时将上述除甘油和人血清白蛋白之外的其余物质加在一起，摇动使之充分溶解，然后加入人血清白蛋白溶解，最后加入甘油充分混匀，过滤，即可在
‑
20℃下保存，通过不含卵黄的冷冻保护液避免发生由卵黄导致的病毒感染和过敏反应；无卵黄冻融后而致的大量颗粒和碎片；可以随时配制，并且可以贮存长达3个月；使用过程中易于分离提纯精子，特别适用于严重少精症精子的冷冻；不含非人体蛋白质，所以可以施行间隔时间短的多次授精；可以先将精子分离后再冷冻保存精子悬液。
32.本发明还提供一种微量精子冷冻保存载体的解冻方法，包括如下步骤：
33.解冻复苏时，将外套管1由液氮罐中取出后，将其放置在37℃的水中采用水浴法进行解冻，解冻后将其置于显微镜处，由于外套管1、承载斗3和张力弧片4均为透明分子制成，因此可观察和控制精子的位置，避免精子丢失，取出的精子迅速放置在培养液中进行培养。
34.本发明提供的微量精子冷冻保存载体、装置的工作原理如下：
35.使用时，将数支外套管1置于液氮罐中的铝支架中进行熏冻，使外套管1的高度距离液氮液面15～20cm，随后在外套管1的存放区101和承载斗3内注入足量的冷冻保护剂，用以提高精子存活率，冷冻保护剂的注液高度需高于承载斗3的高度，但不得高于存放区101的一半，注入冷冻保护剂后迅速使用移液枪或巴斯德枪吸取混合液，之后使枪头贯穿张力形成口402置于放置区302内，使混合液置于放置区302内即可缓慢抽出并迅速盖上盖子2，在熏冻时，液氮气体通过外套管1底部的速冻扩展接触区102进入，增大了液氮与外套管1和承载斗3的接触面，有利于提高冷冻效率，熏冻时温度以10℃/min下降，待熏蒸30min后将本装置迅速置于液氮罐中即可完成操作，在冷冻时冷冻保护剂由张力形成区401和张力形成口402处凝结，在凝结前由于张力和压力作用能够避免精子窜流。
36.与相关技术相比较，本发明提供的微量精子冷冻保存载体、装置及相应的冷冻和解冻方法具有如下有益效果：
37.本发明提供一种微量精子冷冻保存载体及相应的冷冻和解冻方法，通过贯穿式的外套管1便于放置精子和提高冷冻效率，承载斗3便于形成隔离区，底部的锥形不但利于限制精子的放置空间，能够避免精子窜流，同时增大了接触面，提高了冷冻效率，张力弧片4形成的张力形成口402和张力形成区401能够对精子进行保护，利于人们放置和寻找，由于外
套管1、承载斗3和张力弧片4均为透明分子制成，因此可观察和控制精子的位置，避免精子丢失，取出的精子迅速放置在培养液中进行培养，通过不含卵黄的冷冻保护液避免发生由卵黄导致的病毒感染和过敏反应；无卵黄冻融后而致的大量颗粒和碎片；可以随时配制，并且可以贮存长达3个月；使用过程中易于分离提纯精子，特别适用于严重少精症精子的冷冻；不含非人体蛋白质，所以可以施行间隔时间短的多次授精；可以先将精子分离后再冷冻保存精子悬液。
38.需要说明的是，本发明的设备结构和附图主要对本发明的原理进行描述，在该设计原理的技术上，装置的动力机构、供电系统及控制系统等的设置并没有完全描述清楚，而在本领域技术人员理解上述发明的原理的前提下，可清楚获知其动力机构、供电系统及控制系统的具体。
39.以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。