一种基于二氧化碳加富诱导马铃薯试管薯的方法与流程

1.本发明涉及马铃薯种植技术领域，特别涉及一种基于二氧化碳加富诱导马铃薯试管薯的方法。


背景技术：

2.马铃薯(solanum tuberosum l.)是茄科(solanaceae)茄属一年生双子叶草本植物，是全球第四大粮食作物。2017年统计数据显示，我国马铃薯的种植面积为576.74万hm2，单产为17.20t/hm2，总产量为9920.56万吨。单产低下是我国马铃薯生产上面临的重要问题。造成单产较低的主要原因是种植过程中种薯的退化，种薯退化所引起的产量方面的损失高达30％以上。马铃薯病毒的世代累积被认为是造成退化的根本原因。良种的应用可以有效提高农作物的产量和品质，对于马铃薯而言，使用脱毒种薯是应用良种的关键，可以从根本上抑制病毒病的传播。为了加强脱毒种薯的应用，必须有较为高效低成本的马铃薯脱毒种薯繁育体系作为保障。
3.目前国际上比较通行的马铃薯脱毒种薯繁育体系为8～12年，而我国因种薯繁育隔离条件有限，通常为3～4年，即需要大量的试管苗和微型薯作为保障。我国目前的微型薯生产技术和水平已处于世界领先水平，2019年实地考察了全国多地的微型薯生产情况，在不计算固定设施投入的前提下繁育成本为3.0万元/667m2，按平均20万粒/667m2计算，每粒成本为0.15元。其中生产微型薯的基质(蛭石)成本为重要的一部分，因生产蛭石受环评影响，生产受限，其生产成本会进一步提高。
4.将通过茎尖分生组织培养获得脱毒试管苗，在培养基中不断切段繁殖，继而诱导试管苗腋芽膨大形成试管薯。相较于试管苗，试管薯具有可贮藏性，可周年生产，便于运输和栽培，且具有出苗率高等优点；相较于微型薯，试管薯可以在组培条件下生产，种薯质量更好更容易控制，并且无需使用蛭石，可以大大降低基质的成本。目前试管薯的生产效率可以达到10万粒/m2/年组培室，形成了成熟的试管薯规模化生产体系。然而，目前试管薯的平均薯重仅为50
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80mg，不足以像微型薯一样直接作大田生产种薯。
5.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于二氧化碳加富诱导马铃薯试管薯的方法，本发明方法可显著提高马铃薯试管苗的叶片数和叶面积，显著提高马铃薯试管薯单薯重和单株结薯数，特别是提高了300mg以上的试管薯数量。
7.本发明提供的技术方案如下：
8.一种基于二氧化碳加富诱导马铃薯试管薯的方法，包括：将经过组织培养后的马铃薯幼苗切段接种于ms固体培养基上，进行光照培养，然后在所述光照培养的过程中，向培养环境中通入含二氧化碳的气体。
9.本发明拟诱导出单薯重很大程度提高的试管薯，寻求试管薯替代微型薯的可能性
和途径，从而减少生产环节，降低成本，保护环境，减少病毒传播世代和提高种薯的质量。本发明通过光照培养同步进行二氧化碳加富，可显著增加马铃薯试管薯的单株结薯数和平均粒重。
10.在本发明中，二氧化碳加富为采用高浓度的二氧化碳。在一个实施方案中，在所述光照培养进行6～8天后通入含二氧化碳的气体，例如含co2的空气或者co2气体。
11.在一个实施方案中，所述马铃薯试管薯的诱导在培养容器中进行，所述培养容器置于培养环境中；
12.优选地，所述培养容器为培养瓶，所述培养环境为培养箱或培养室；更优选地，所述培养瓶的瓶盖具有开孔。在一个实施方案中，培养瓶的瓶口用过滤膜封口。
13.在一个具体的实施方案中，马铃薯试管薯诱导的培养容器为圆柱形透明螺口塑料pve培养瓶，培养瓶高度为110mm，内径为39mm，方便试管苗接种操作和接种后的管理。培养容器的瓶盖开孔，以过滤膜封口避免污染，有利于培养过程中的气体交换，达到二氧化碳加富的作用。进一步地，培养容器的瓶盖在中央开单孔，孔径1cm左右。
14.在一个实施方案中，进行通气培养前，进行光照培养，使得幼苗能够适应培养基和生长环境，更有利于幼苗的生长。每天光照培养的时间为8～10h。短日照处理有利于马铃薯试管薯的形成和诱导。
15.在一个实施方案中，所述含二氧化碳的气体的通气时间为90～120天。在光照培养6～8天后开始向试管薯诱导的培养箱环境内通入二氧化碳气体，通入二氧化碳气体能够为幼苗提供碳源，促进幼苗的光合作用，促进其叶片和叶面积增加，增加光合产物。
16.通入二氧化碳气体的时间与光照时间同步，避免黑暗条件下过高的二氧化碳浓度，影响幼苗的光呼吸，同时可以节约二氧化碳的用量；二氧化碳通气培养90
‑
120d时，收获试管薯，并进行分级处理。试管薯的分级和贮藏管理同常规生产程序。
17.在一个实施方案中，通入所述含二氧化碳的气体后，所述培养环境中二氧化碳浓度为600～800μmol/mol，采用上述浓度的二氧化碳能够保障幼苗光合作用的碳源。
18.在一个实施方案中，所述ms培养基中，蔗糖的质量比为5％～8％，琼脂的质量比为0.7％～0.9％。优选地，所述ms固体培养基包含重量百分比6％的蔗糖。由于培养箱内进行二氧化碳通气和培养容器瓶盖开孔处理，均会增加水分的散失，6％的蔗糖浓度有利于诱导试管薯起始结薯和生长。最佳的马铃薯试管薯诱导条件收到培养基条件的影响，6％的蔗糖浓度较适合提高单株结薯数和单粒重，此外，培养基中优选不含有活性炭基质(传统诱导试管薯的过程中都会添加活性炭，主要目的是吸附试管薯诱导过程中的不利气体。本研究通气后，不需要活性炭，添加有不利影响，影响对于培养过程中水分的控制)。
19.在一个实施方案中，所述光照培养的光照强度为2500～3000lx，培养温度为19℃～21℃，空气湿度为70％～80％。在上述条件下，幼苗更好的生根生长，有利于幼苗的繁殖。
20.在一个实施方案中，所述马铃薯幼苗切段为单节段或双节段，优选为单节段；采用单节段接种提高基础母苗的繁殖系数，且不影响成活率。
21.在一个实施方案中，所述切段接种的密度为8～10节段/瓶。本发明方法的接种密度约为传统培养接种密度的1/3，降低试管苗的培养密度有利于大型试管薯的诱导。
22.进一步的，在本发明的诱导之前，将马铃薯脱毒苗进行组织培养扩繁后，将经过组织培养后的幼苗切段接种于ms培养基。组织扩繁培养的方法为采用常规的现有技术的培养
方法即可，本发明不作特别说明。
23.有益效果：
24.(1)本发明方法提高了马铃薯试管薯的单薯重(粒重)，使得单薯重最高可达990mg，并且本发明方法增加了300mg以上的试管薯的数量；
25.(2)本发明方法显著提高了马铃薯试管苗的叶面积和叶片数；
26.(3)本发明方法促进了马铃薯试管薯的单株结薯数；
27.(4)本发明的方法操作简单，具有较高的实际应用价值，适合马铃薯试管薯的工厂化生产。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
29.图1为本发明实施例1提供的培养室环境加富二氧化碳示意图；
30.图2为本发明实施例1提供的二氧化碳加富华1试管苗生长与对照比较图；
31.图3为本发明实施例1提供的二氧化碳加富华1试管薯诱导与对照比较图；
32.图4为本发明实施例2提供的二氧化碳加富中5试管苗生长与对照比较图；
33.图5为本发明实施例2提供的二氧化碳加富中5试管薯诱导情况；
34.图6为本发明实施例2提供的二氧化碳加富中5试管薯诱导与对照比较图；
35.图7为本发明实施例3提供的二氧化碳注入式通气示意图；
36.图8为本发明实施例3提供的二氧化碳注入式通气华9试管薯诱导情况。
具体实施方式
37.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.实施例1：
39.本实施例提供一种基于二氧化碳加富诱导大型马铃薯试管薯的方法，其采用的幼苗为华薯1号(简称华1)脱毒试管苗，幼苗剪切为单节段，接种于含6％蔗糖和0.8％琼脂的ms培养基中，ph为5.8。
40.包括以下步骤：
41.每瓶接种9株，在光照培养室内培养，每天光照8小时，光照强度为2500～3000lx，培养室内温度为19℃～21℃，培养箱内的空气湿度为70％～80％。图1为培养室环境加富二氧化碳示意图。
42.光照培养7d后，培养室内开始增施二氧化碳，使培养室内的二氧化碳含量保持在680μmol/mol左右，二氧化碳加富时间与光照时间同步。
43.设置了“培养室环境加富co2 培养瓶开孔(t1)”、“培养室环境加富co2 培养瓶不开
孔(t2)”两个处理，以“不补co2气体 培养瓶不开孔(ck)”为对照。10瓶为一个重复，设置了4次重复，随机区组排列。
44.培养20d后，每个处理随机选择3瓶作为样品，对马铃薯试管苗的生长情况进行测量，测量指标为试管苗总长、株高、根长、茎粗(基部以上2cm左右)、节间数(去除顶芽和原始节段)、由下往上前三节的节间长度、叶片数、单叶面积、植株鲜重、去根重和根重。测量数据进行方差分析，利用邓肯式新复极差进行多重比较。
45.培养90d后收获，测定每株的试管薯的薯数和薯重，并对试管薯的大小进行分级处理，测量数据进行方差分析，利用邓肯式新复极差进行多重比较。
46.二氧化碳加富条件下华1试管苗生长情况与对照对比结果见图2和表1；
47.结果显示：从壮苗的指标看，“加富二氧化碳 培养瓶开孔(t1)”处理在茎粗、节间数，叶片数、单叶面积等指标显著好于对照处理，即使在加富二氧化碳条件下，培养瓶不开孔的t2处理也大部分指标显著优于对照处理。
48.表1.二氧化碳加富条件下华1试管苗生长情况比较
[0049][0050]
注：表中同行数据后的不同字母表示差异显著(p＜0.05)
[0051]
二氧化碳加富条件下华1试管薯诱导情况与对照对比结果见图3；结果显示：加富二氧化碳条件下单株结薯数与对照没有显著差异，但单粒薯重显著高于对照，t1处理的平均薯重达277.9mg，最大薯重达990mg；t2处理的平均薯重达221.0mg，最大薯重达554mg；显著高于对照处理平均薯重达149.3mg，最大薯重达361mg。同时显著增加300mg以上试管薯的比例，t1处理为34.2％，t2处理为28.4％显著高于对照处理的2.3％。
[0052]
实施例2：
[0053]
按照实施例1提供的方法诱导马铃薯试管薯，区别在于采用的品种为中薯5号(简称中5)，其他培养条件与实施例1相同。
[0054]
二氧化碳加富条件下中5试管苗生长情况与对照对比结果见图4和表2；
[0055]
结果显示：从壮苗的指标看，与华1试管苗的生长情况稍有差异，但总体还是加富二氧化碳的试管苗生长情况更好，特别是显著增加了试管苗的叶片数和单叶面积。
[0056]
表2.二氧化碳加富条件下中5试管苗生长情况比较
[0057][0058]
注：表中同行数据后的不同字母表示差异显著(p＜0.05)
[0059]
二氧化碳加富条件下中5试管薯诱导情况与对照对比结果见图5和图6；结果显示：加富二氧化碳条件下单株结薯数显著高于对照处理，t1处理的单株结薯数1.02粒，t2处理的单株结薯数1.08粒，显著高于对照处理的0.65粒。单粒试管薯的薯重也显著高于对照处理，t1处理的平均薯重达306.8mg，最大薯重达797mg；t2处理的平均薯重达332.1mg，最大薯重达849mg；显著高于对照处理平均薯重达110.2mg，最大薯重381mg。同时显著增加300mg以上试管薯的占比，t1处理为51.1％，t2处理为57.8％，显著高于对照处理的2.3％。
[0060]
实施例3：
[0061]
本实施例提供一种基于二氧化碳加富诱导大型马铃薯试管薯的方法，其采用的幼苗为华薯1号(简称华1)脱毒试管苗，幼苗剪切为单节段，接种于ms附加0.8％琼脂的培养基中，ph为5.8。
[0062]
包括以下步骤：
[0063]
每瓶接种9株，在光照培养室内培养，每天光照8小时，光照强度为2500～3000lx，培养室内温度为19℃～21℃，培养室内的空气湿度为70
‑
80％。
[0064]
设置了4％、6％和8％三个蔗糖浓度、培养基有无添加活性炭的两因素试验，添加活性炭的量为2.2g/l，共6个处理组合，每个处理20盒作为一次重复，3次重复，完全随机排列。
[0065]
培养90d时收获试管薯，测定每株的试管薯的薯数和薯重，统计每盒结薯数、总薯重、平均粒重、单株结薯数及<50mg的薯个数，测量数据进行方差分析，利用邓肯式新复极差进行多重比较。
[0066]
各研究因素和效应对华1试管薯诱导影响情况见表3；
[0067]
结果显示：蔗糖浓度和活性炭有无均显著影响华薯1号试管薯形成的主要测量指标，且两因素在所有测量指标上均存在显著或极显著的互作效应。
[0068]
表3.研究因素和效应对华薯1号试管薯诱导影响的f值
[0069][0070]
注：*表示0.05水平显著；**表示0.01水平显著。
[0071]
各研究因素和效应对华1试管薯诱导情况见表4；结果显示：在每盒接种9根试管苗的情况下，最佳的处理组合为“6％蔗糖 无活性炭”，华1试管薯的单株结薯数和单粒重均显著高于其他处理组合，说明不同马铃薯新品种均需要筛选最佳的试管薯诱导条件，同时适当降低每盒的试管苗接种数量，也可以提高试管薯的粒重，在最佳处理组合条件下，单粒重达139.5mg，高于传统培养条件下试管薯粒重的50mg
‑
80mg。
[0072]
表4.不同处理对华薯1号试管薯诱导情况
[0073][0074][0075]
注：小写字母代表0.05显著水平。
[0076]
对比例1：
[0077]
本实施例提供一种基于二氧化碳加富诱导大型马铃薯试管薯的方法，其采用的幼苗为华薯9号(简称华9)脱毒试管苗，幼苗剪切为单节段，接种于含6％蔗糖和0.8％琼脂的ms培养基中，ph为5.8。
[0078]
包括以下步骤：
[0079]
每瓶接种9株，在光照培养室内培养，每天光照8小时，光照强度为2500～3000lx，培养室内温度为19℃～21℃，培养室内的空气湿度为70％～80％。
[0080]
采用电子气泵
‑
过滤器
‑
分流器
‑
螺口培养瓶的顺序进行连接方式进行注入式通气，如图7所示，第一个螺口瓶中放置100g无菌蒸馏水，为后续的培养瓶保持培养基湿度条件，气体流量为370ml/min，通气时间与光照时间同步。
[0081]
设置了试管苗接种后第25d、第40d、第55d等不同时间点开始通气的处理，以不通气的正常培养为对照。16瓶为一个重复，设置了3次重复，完全随机排列。
[0082]
自接种后培养90d时收获试管薯，测定每株的试管薯的薯数和薯重，并对试管薯的大小按200～250mg、250.01～300mg、＞300.01mg进行分级，测量数据进行方差分析，利用邓肯式新复极差进行多重比较。
[0083]
二氧化碳注入式不同时间点开始通气条件下华9试管薯诱导情况见图8；
[0084]
结果显示：二氧化碳注入式通气条件下华9试管薯的粒数和均粒重并没有达预期目的，相较与对照，250mg以上的试管薯数量并没有显著降低，而200.01mg
‑
250mg级别的试
管薯数量显著降低。
[0085]
综合分析，二氧化碳注入式通气并不适合马铃薯试管薯的诱导，主要原因是注入式通气直接降低了培养基的湿度，使马铃薯幼苗处于逆境胁迫的环境下生长。
[0086]
综上实施例和对比例所知，本发明通过与光照培养同步进行二氧化碳加富(尤其是在培养环境例如培养室中进行加富)，使试管薯诱导的培养箱内二氧化碳浓度达600
‑
800μmol/mol，使得马铃薯试管薯的单薯重有较为明显的增加，并且使得300mg以上试管薯的占比增加。
[0087]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。