一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法与流程

1.本发明涉及干细胞冻存技术领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法。


背景技术：

2.脂肪间充质干细胞来源于人体脂肪组织，是一种特殊的具有多向分化潜能的成体干细胞；在特定的条件下，可分化成为多种功能细胞(如成骨细胞、心肌细胞、内皮细胞等)；与此同时，能够释放出大量细胞因子，激化体内细胞。由于其修复替代功能，可有效的运用到美容塑形、保健抗衰、疾病治疗三大方面。
3.因为，脂肪间充质干细胞的体外培养周期较长，达到实验所需细胞数量需要3～4周，要实现随时为临床和基础研究提供足量细胞，需要冻存。
4.目前的冻存液中，添加有二甲基亚砜(dmso)；二甲基亚砜是一种有毒试剂,与蛋白质的疏水集团发生作用,可导致蛋白质变性；使用其他冻存保护剂,比如乙二醇、甲醇、聚合物羟乙基淀粉等,也不可避免地引起细胞损伤。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提出一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法；以无毒的成分组成，保证细胞存活，不损伤细胞；且，成分不包含动物血清，不引入杂质，不产生污染；以解决现有技术中存在的问题。
6.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
7.一种脂肪间充质干细胞冻存液，包含如下重量份数的组分：
8.自体血清，10
‑
40份；
9.羟乙基淀粉，50
‑
80份；
10.6％葡聚糖，5
‑
10份；
11.甘油，2
‑
5份。
12.优选的，还包含如下浓度的组分：
13.100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
14.优选的，包含如下重量份数的组合：
15.自体血清，20份；
16.羟乙基淀粉，70份；
17.6％葡聚糖，7份；
18.甘油，3份。
19.优选的，包含如下重量份数的组合：
20.自体血清，10份；
21.羟乙基淀粉，80份；
22.6％葡聚糖，7份；
23.甘油，3份。
24.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
25.s01，向冻存管中依次加入冻存液、脂肪间充质干细胞，放入预冷过的程序降温盒中；
26.s02，将程序降温盒以3
‑
5℃/min降温至
‑
85℃；
27.s03，在
‑
85℃保存12
‑
16小时，之后转移至液氮中保存。
28.优选的，在步骤s01中，将程序降温盒预冷至4
‑
6℃。
29.优选的，在步骤s01中，脂肪间充质干细胞含量为1.0
‑
2.0
×
106/ml。
30.与现有技术相比，本发明提供了一种脂肪间充质干细胞冻存液及冻存方法，具备以下有益效果：
31.1、本发明，使用自体血清替代胎牛血清，有效避免外源蛋白污染，不会对细胞产生毒害作用；同时，可补给细胞营养、增殖细胞因子，进一步有效的保护细胞。
32.2、本发明，羟乙基淀粉(hes)、葡聚糖为非渗透性保护剂，甘油为渗透性保护剂；三者相结合，作为冷冻保护剂成分，来实现在细胞冻存过程中保护细胞的作用。
33.3、本发明，通过预冷设置，避免直接降温造成的细胞死亡；结合考虑在冷冻保存过程中减轻细胞损伤，设置降温速度为3
‑
5℃/min；保证冻存质量以及解冻后的细胞活力。
34.该装置中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现，本发明，不对细胞产生毒害作用，有效的保护细胞；羟乙基淀粉(hes)、葡聚糖、甘油相结合，充分保护冻存中的细胞；调整冻存方法设置，保证冻存质量以及解冻后的细胞活力。
具体实施方式
35.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
36.实施例一：
37.一种脂肪间充质干细胞冻存液，包含如下重量份数的组分：
38.自体血清，10
‑
40份；
39.羟乙基淀粉，50
‑
80份；
40.6％葡聚糖，5
‑
10份；
41.甘油，2
‑
5份。
42.其中，使用自体血清替代胎牛血清，有效避免外源蛋白污染，不会对细胞产生毒害作用；同时，可补给细胞营养、增殖细胞因子，进一步有效的保护细胞。
43.羟乙基淀粉(hes)、葡聚糖为非渗透性保护剂，甘油为渗透性保护剂；三者相结合，作为冷冻保护剂成分，来实现在细胞冻存过程中保护细胞的作用。
44.进一步的，还包含如下浓度的组分：
45.100u/ml青霉素、100ug/ml链霉素。
46.以在冻存及解冻过程中，避免细胞污染。
47.实施例二：
48.一种脂肪间充质干细胞冻存液，包含如下重量份数的组合：
49.自体血清，20份；
50.羟乙基淀粉，70份；
51.6％葡聚糖，7份；
52.甘油，3份。
53.实施例三：
54.一种脂肪间充质干细胞冻存液，包含如下重量份数的组合：
55.自体血清，10份；
56.羟乙基淀粉，80份；
57.6％葡聚糖，7份；
58.甘油，3份。
59.一种脂肪间充质干细胞的冻存方法，包括以下步骤：
60.s01，向冻存管中依次加入冻存液、脂肪间充质干细胞，放入预冷过的程序降温盒中；
61.s02，将程序降温盒以3
‑
5℃/min降温至
‑
85℃；
62.s03，在
‑
85℃保存12
‑
16小时，之后转移至液氮中保存。
63.进一步的，在步骤s01中，将程序降温盒预冷至4
‑
6℃。
64.进一步的，在步骤s01中，脂肪间充质干细胞含量为1.0
‑
2.0
×
106/ml。
65.通过预冷设置，避免直接降温造成的细胞死亡；调整细胞含量，保证细胞冷冻存活所需成分支持；结合考虑在冷冻保存过程中减轻细胞的损伤，设置降温速度为3
‑
5℃/min，保证冻存质量以及解冻后的细胞活力。
66.本发明中，使用自体血清替代胎牛血清，有效避免外源蛋白污染，不会对细胞产生毒害作用；同时，可补给细胞营养、增殖细胞因子，进一步有效的保护细胞；羟乙基淀粉(hes)、葡聚糖为非渗透性保护剂，甘油为渗透性保护剂；三者相结合，作为冷冻保护剂成分，来实现在细胞冻存过程中保护细胞的作用；冻存方法设置，保证冻存质量以及解冻后的细胞活力。
67.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。