一种以种子为外植体进行组培扩繁大百合的繁殖方法与流程

1.本发明属于植物组织培养领域，涉及利用植物种子进行组织培养扩繁的方法。


背景技术：

2.大百合为百合科(liliaceae)大百合属(cardiocrinum)，包含大百合(c.giganteum)、荞麦叶大百合(c.cathayanum)、日本大百合(c.cordatum)3个种。大百合属和百合属关系密切，但大百合高大的株型和硕大的网状脉叶片又和百合属有着明显不同(虞泓等,2005)。大百合为多年生种球类草本植物，在我国主要分布在西南各省区，生长在海拔600～3200m的林缘、林下、草地或沟谷边。
3.大百合是集观赏、食材与药材于一身的珍贵植物(秦晶晶等,2019；潘正伟等,2019)。大百合植株高大，花朵硕大且数量多，具有很高的观赏价值，大百合鳞茎具有清肺、平喘、止咳的功效，亦可食用。大百合主产地的少数民族有采集其种球食用的习惯，云南民间用大百合果实入药，俗称“兜铃子”，常用其作为中药马兜铃的代用品，具有清肺、平喘、止咳的功效。日本学者也在日本大百合中发现了5
‑
脂氧酵素活化抑制剂，刘润民(1984)用云南大百合的干燥果实为原料，分离到异海松烷型二萜化合物，这种化合物拥有多种药理活性，具有重要的开发前景。野生大百合被大量采挖，同时随着人们不合理的开发利用森林资源，导致大百合属植物的生长环境发生了变化，其分布面积也日渐缩小并破碎化，部分地区种群数量大大减少，濒危状况日益严重(路艳,2005；汪小飞等,2011)。然而长期以来，大百合一直处于野生状态，未能得到广泛应用以及产业化发展的瓶颈是扩大繁殖难度极大(叶睿超等,2010；汪小飞等,2014)。
4.目前，大百合主要以有性(种子)和无性(种球:分球繁殖；扦插繁殖)两种类型的繁育方法为主，其中无性生殖占优势。
5.有性繁殖：大百合为两性虫媒花，传粉方式以异花授粉为主，一般通过蜜蜂、食蚜蝇、蚂蚁等昆虫传粉(汪小飞等,2014)。研究发现，大百合果实11月初成熟，但成熟后的种子要经历长达17个月的休眠期才可能萌发，种子散布时胚的长度仅1mm左右，为形态生理休眠(mpd)(关文灵等,2010；蔡薇等,2017；李凤荣等,2019)。种子萌发模式为子叶出土型，出土后的幼苗生长十分缓慢，实生苗竞争力弱，成苗率很低，成为大百合有性生殖的瓶颈。
6.分球繁殖：大百合经过5
‑
6年营养生长，母球开花后死亡，每个母球产生2
‑
8个子球，由新的小鳞茎取代原有空间位置，从而完成植株的繁衍和扩展(汪小飞等,2014)，但分株繁殖不仅繁殖系数低，而且会导致鳞茎逐年变小而退化，易造成植株长势和观赏性状的退变(路艳,2005；叶睿超等,2010；)，远远不能满足其商品化生产的需求。
7.扦插繁殖：将大百合鳞片采用埋片法和斜插法放入基质中可诱导出芽及生根，诱导效率受到低温、鳞片重量、鳞片位置、外源激素等因素影响(关文灵等,2003；汪小飞等,2011；易娴等,2020)；但鳞片扦插繁殖过程中病毒积累会影响品质且繁殖的周期长，不能连年扦插生产，满足不了大规模的生产要求。
8.组织培养：由于种子繁殖、分球繁殖与扦插繁殖本身有一定的限制性，因此开展大
百合组织培养研究切实可行。目前采用的外植体有鳞片、子房以及花器官等，其中应用最广泛的是鳞片(路艳,2005；虞泓等,2005；周艳萍等,2007；肖玉菲等,2018)。由于大百合种球存在生理性休眠，因此鳞片的取材季节一般集中在春季；花器官如花被片、子房、花丝等也有研究报道(李守丽等,2007；关文灵等,2009)，但大百合的花期限制了采样量，从而影响组织扩繁。同时由于大百合多糖含量丰富，在组织培养中极易发生褐化现象(周艳萍等,2007；肖玉菲等,2018)。
9.由于不论是分球繁殖，还是扦插繁殖，以及采用鳞片进行组织培养繁殖，都是局限于使用大百合鳞茎，常年的营养繁殖会导致病毒的累积，同时污染率极高，植株生长缓慢(路艳,2005；周艳萍等,2007；汪小飞等,2014；肖玉菲等,2018)，同时采用鳞茎种球种质资源范围狭窄，限制了大百合优质种源的筛选和扩繁。
10.参考文献
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‑
12.


技术实现要素：

[0029]
为了解决上述现有技术的不足之处，提供了一种以种子为外植体进行组培扩繁大百合的繁殖方法。采用大百合种子与组织培养相结合技术，为解决大百合产业化发展的瓶颈提供新策略。
[0030]
本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0031]
一种以种子为外植体进行组培扩繁大百合的繁殖方法，包括以下步骤：
[0032]
1)获取无菌实生苗；
[0033]
2)愈伤组织和不定芽诱导：把无菌实生苗接种于诱导培养基上诱导出愈伤组织和不定芽；
[0034]
3)不定芽增殖：把诱导出带有小芽点的愈伤组织接种到增殖培养基中进行增殖培养；
[0035]
4)不定芽生根培养：待不定芽长至1～2cm时，接种至生根培养基进行生根培养。
[0036]
优选的是，步骤1)所述的无菌实生苗由已发芽的大百合种子依次经过酒精消毒和次氯酸钠消毒制得。
[0037]
优选的是，步骤2)所述的诱导培养基配方为：
[0038]
ms 1.0mg/l 6
‑
ba 2.0mg/l 2,4
‑
d 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40。
[0039]
优选的是，步骤2)所述培养条件为：黑暗培养，温度22～25℃，培养时间50～60天。
[0040]
优选的是，步骤3)所述的增殖培养基配方为：
[0041]
ms 2.0mg/l 6
‑
ba 1.0mg/l tdz 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40 100g/l椰汁。
[0042]
优选的是，步骤3)所述的增殖培养基ph为5.8，溶剂为去离子水。
[0043]
优选的是，步骤3)所述培养条件为：温度22～25℃，光照时间12～14h
·
d
‑1，光照强度为2000～30001x，培养时间40～60天。
[0044]
优选的是，步骤4)所述的生根培养基选配方为：
[0045]
1/2ms 0.5mg/l iba 0.05mg/l 6
‑
ba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/l pvp
‑
40。
[0046]
优选的是，步骤4)所述的的生根培养基ph为5.8，溶剂为去离子水。
[0047]
优选的是，步骤4)所述的培养条件为：温度22～25℃，光照时间10～12h
·
d
‑1，光照强度为1000～2000lx，培养时间30～40天。
[0048]
该方法诱导分化率高，不定芽根毛丰富，利于后续利用。该方法采用有性生殖与组织培养技术相结合的方法，既可以良好地保存百合的种质资源，有效地保证遗传的稳定性，
又可以使繁殖速度大大增加，为解决大百合产业化发展的瓶颈提供新策略。
附图说明
[0049]
图1为大百合种子培育的小苗；
[0050]
图2为利用大百合幼苗作为外植体诱导产生不定芽；
[0051]
图3为大百合不定芽诱导产生不定根；
[0052]
图4为大百合不定芽诱导产生富含根毛的不定根，其中a为富含根毛的不定根，b不定根大量根毛放大示意图。
具体实施方式
[0053]
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。此外，在阅读本发明的内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种修改，这些等价变化同样落于本发明所附权利要求书所限定的范围。
[0054]
实验用的培养基
[0055]
本发明中所用材料为：ms培养基(购于美国phytotechnology laboratories公司)；6
‑
ba(6
‑
苄基腺嘌呤)、naa(萘乙酸)、tdz(噻苯隆)、2,4
‑
d(2,4
‑
二氯苯氧乙酸)、琼脂(购于北京拜尔迪生物技术有限公司)。
[0056]
实施例1
[0057]
以种子为外植体进行组培扩繁大百合的繁殖方法，包括如下步骤：
[0058]
1、无菌实生苗：将经过处理发芽的大百合种子(图1)用75％(v/v)酒精(无菌水配制，100ml加入1滴吐温
‑
20)浸泡30s，无菌水清洗3次；再用有效氯2％次氯酸钠naclo(无菌水配制，100ml加入1滴吐温
‑
20)消毒5min，无菌水冲洗3次，获得无菌实生苗。
[0059]
2、愈伤组织和不定芽诱导：
[0060]
把无菌实生苗接种于诱导培养基中，配方如下1
‑
10所示，其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0061]
培养条件：黑暗培养，温度25℃，培养60天，观察统计(结果详见表1和图2)。
[0062]
(1)ms 4.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0063]
(2)ms 4.0mg/lkt 2.0mg/l2,4
‑
d 1.0mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0064]
(3)ms 4.0mg/ltdz 1.0mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0065]
(4)ms 1.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/l2,4
‑
d 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0066]
(5)ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/ltdz 1.0mg/liba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂
[0067]
(6)ms 1.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/lkt 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 100mg/lvc
[0068]
(7)ms 2.0mg/ltdz 1.0mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 100mg/lvc
[0069]
(8)ms 2.0mg/lkt 1.0mg/l2,4
‑
d 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 100mg/lvc
[0070]
(9)ms 2.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/l2,4
‑
d 1.0mg/liba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂
[0071]
(10)ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/liba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 100mg/lvc
[0072]
通过对培养基组分进行调整，大百合带有芽生长点的愈伤组织生长速率大大加快(图2b)。在第(3)、(4)、(7)组培养基愈伤组织诱导过程中生长较快，其中，第(4)组培养基愈伤组织诱导生长最快，褐化率相对较低。因此诱导培养基的配方优选为ms 1.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/l2,4
‑
d 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40。
[0073]
3、不定芽增殖：
[0074]
把诱导的带有小芽点的愈伤组织接种到增殖培养基中，培养基配方如下1
‑
6所示，其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0075]
培养条件：温度25℃，光照14h
·
d
‑1，光照强度为30001x，培养60天，观察统计(结果详见表2和图2c)。
[0076]
(1)ms 4.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0077]
(2)ms 4.0mg/lkt 1.0mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0078]
(3)ms 2.0mg/ltdz 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40 100g/l椰汁
[0079]
(4)ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/ltdz 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40 100g/l椰汁
[0080]
(5)ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/liba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 100g/l椰汁
[0081]
(6)ms 1.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/lkt 0.5mg/liba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0082]
考察不定芽不同增殖培养基组分下的大百合不定芽增殖率，结果表明，在第(1)、(4)组中培养基的不定芽增殖较多，其中，第(4)组培养基不定芽增殖数量最多，褐化程度较轻。因此增殖培养基的配方优选为ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/ltdz 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40 100g/l椰汁。
[0083]
4、不定芽生根：
[0084]
当不定芽高2cm时，将芽从愈伤组织块上切下，进行生根培养。生根培养基配方如下1
‑
6所示，其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0085]
培养条件：温度25℃，光照
‑
12h
·
d
‑1，光照强度为20001x，培养40天左右，观察统计(结果详见表3和图3
‑
4)。
[0086]
(1)1/2ms 0.2mg/lnaa 20g/l蔗糖 7.0g/l琼脂
[0087]
(2)1/2ms 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0088]
(3)1/2ms 0.5mg/liba 0.05mg/l6
‑
ba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0089]
(4)ms 0.2mg/lnaa 20g/l蔗糖 7.0g/l琼脂
[0090]
(5)ms 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0091]
(6)ms 0.5mg/liba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40
[0092]
考察生根不同培养基组分下的大百合生根生长速率，结果表明，在第(3)、(6)组中培养基的生根数较多，其中，第(3)组培养基根系生长好，根毛多。因此生根培养基的配方优选为1/2ms 0.5mg/liba 0.05mg/l6
‑
ba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40。
[0093]
观察结果显示，生根数为3
‑
4个根毛丰富(图4)，添加0.2g/lpvp
‑
40有利于根的生长，防止褐化。
[0094]
依此，大百组培试管苗的移栽成活率可达90％以上。
[0095]
表1 1
‑
10号不同诱导培养基对大百合愈伤组织和不定芽诱导效果
[0096][0097]
表2 1
‑
6号不同增殖培养基对不定芽增殖效果
[0098][0099]
表3 1
‑
6号不同生根培养基对大百合生根效果
[0100] 1号2号3号4号5号6号生根率(％)303030303030生根数(个)1
‑
22
‑
33
‑
41
‑
22
‑
33
‑
4根部状态根毛少根毛少根毛多根毛少根毛少根毛较多
[0101]
实施例2
[0102]
以种子为外植体进行组培扩繁大百合的繁殖方法，包括如下步骤：
[0103]
1、无菌实生苗：将经过处理发芽的大百合种子用75％(v/v)酒精(无菌水配制，100ml加入2滴吐温
‑
20)浸泡30s，无菌水清洗3次；再用有效氯2.5％naclo(无菌水配制，100ml加入2滴吐温
‑
20)消毒15min，无菌水冲洗5次，获得无菌实生苗。
[0104]
2、愈伤组织和不定芽诱导：
[0105]
把无菌实生苗接种于诱导培养基中，配方如下所示：ms 1.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/l2,4
‑
d 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40，其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0106]
培养条件：黑暗培养，温度22℃，培养50天，观察统计。
[0107]
3、不定芽增殖：
[0108]
把诱导的带有小芽点的愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，培养基配方如下所示：ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/ltdz 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40 100g/l椰汁，其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0109]
培养条件：温度22℃，光照12h
·
d
‑1，光照强度为20001x，培养40天，观察统计。
[0110]
4、不定芽生根：
[0111]
当不定芽高1cm时，将芽从愈伤组织块上切下，进行生根培养。生根培养基配方如下所示：1/2ms 0.5mg/liba 0.05mg/l6
‑
ba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40；其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0112]
培养条件：温度22℃，光照10h
·
d
‑1，光照强度为10001x，培养30天，观察统计。
[0113]
观察结果显示，生根数为3
‑
4个根毛丰富，添加0.2g/lpvp
‑
40有利于根的生长，防止褐化。
[0114]
依此，大百组培试管苗的移栽成活率可达90％以上。
[0115]
实施例3
[0116]
以种子为外植体进行组培扩繁大百合的繁殖方法，包括如下步骤：
[0117]
1、无菌实生苗：将经过处理发芽的大百合种子用75％(v/v)酒精(无菌水配制，100ml加入1滴吐温
‑
20)浸泡30s，无菌水清洗3次；再用有效氯2％naclo(无菌水配制，100ml加入1滴吐温
‑
20)消毒10min，无菌水冲洗4次，获得无菌实生苗。
[0118]
2、愈伤组织和不定芽诱导：
[0119]
把无菌实生苗接种于诱导培养基中，配方如下所示：ms 1.0mg/l6
‑
ba 2.0mg/l2,4
‑
d 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40；其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0120]
培养条件：黑暗培养，温度23℃，培养55天，观察统计。
[0121]
3、不定芽增殖：
[0122]
把诱导的带有小芽点的愈伤组织接种到不定芽增殖培养基中，培养基配方如下所示：ms 2.0mg/l6
‑
ba 1.0mg/ltdz 0.5mg/lnaa 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40 100g/l椰汁；其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0123]
培养条件：温度23℃，光照13h
·
d
‑1，光照强度为25001x，培养50天。
[0124]
4、不定芽生根：
[0125]
当不定芽高2cm时，将芽从愈伤组织块上切下，进行生根培养。生根培养基配方如下所示：1/2ms 0.5mg/liba 0.05mg/l6
‑
ba 30g/l蔗糖 7.0g/l琼脂 0.2g/lpvp
‑
40；其中，酸碱度为ph5.8；溶剂为去离子水。
[0126]
培养条件：温度23℃，光照11h
·
d
‑1，光照强度为15001x，培养35天。
[0127]
观察结果显示，生根数为3
‑
4个根毛丰富，添加0.2g/lpvp
‑
40有利于根的生长，防止褐化。
[0128]
依此，大百组培试管苗的移栽成活率可达90％以上。