一种肿瘤组织DNA和RNA保存液的制作方法

一种肿瘤组织dna和rna保存液
技术领域
1.本发明涉及一种生物样本保存液，尤其涉及一种肿瘤组织dna和rna保存液。


背景技术：

2.肿瘤疾病已经成为威胁人类健康的重要疾病之一，恶性肿瘤造成的死亡人数仅次于心脑血管疾病居第二位。随着科技的发展，各种靶向药物的开发及新的治疗手段的出现，肿瘤疾病已经被认为是一种慢性疾病，可以通过现有的治疗做到有效的控制。但是由于人类个体之间的差异及肿瘤异质性的原因，患者对药物的反应不尽相同，造成很多不必要或者无效的治疗，甚至延误治疗时机。分子诊断技术的进步，特别是以qpcr和ngs技术为代表的基因检测技术的发展，使个性化诊疗得以实现，精准用药成为肿瘤治疗的基本要求。
3.基因检测技术是检测人的核酸（dna/rna）信息，从而识别基因变异，指导用药或者辅助临床诊断的技术。对dna和rna质量的要求很高。目前临床上最常用的肿瘤组织保存方法为石蜡包埋技术，但是该方法对核酸有破坏作用，特别是严重破坏rna；而直接低温保存，如：液氮保存，可以很好的保存dna和rna，但是这种方法有较大的限制性：一是采用低温保存成本较高；二是体现在对于特殊设备的需求上，例如液氮罐，不适合医院使用。
4.目前已有技术用于组织的常温保存，例如：中国专利发布号cn201510445725的发明专利，公开了一种用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液，但该专利所述的保存液仅保护dna，且保护的组织为人和除人以外的哺乳动物的神经细胞瘤组织，适用范围有限，具有使用局限性。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种适用于常温下保存肿瘤组织、常温下保护肿瘤组织中dna和rna的完整性、操作简单、适用性较好、可应用于大规模样品检测的肿瘤组织dna和rna保存液。
6.本发明的肿瘤组织dna和rna保存液，其中溶解有0.05
‑
0.15mol/l的乙二胺四乙酸二钠(edta
‑
2na)、0.15
‑
0.30g/l的异硫氰酸胍、氯化钠（nacl）、以及体积分数为9
‑
15%的二甲基亚砜（dmso），并调节ph至6.0
‑
9.0。
7.进一步的，所述保存液中溶解有0.2
‑
0.3mol/l的乙二胺四乙酸二钠（edta
‑
2na）。
8.具体的，所述保存液中溶解有0.25mol/l的乙二胺四乙酸二钠（edta
‑
2na）。
9.进一步的，所述保存液中溶解有0.15
‑
0.25g/l的异硫氰酸胍。
10.具体的，所述保存液中溶解有有0.215g/l的异硫氰酸胍。
11.进一步的，所述保存液中溶解有饱和氯化钠（nacl）。
12.进一步的，所述保存液中溶解有质量分数为10
‑
13%的二甲基亚砜（dmso）。
13.具体的，所述保存液中溶解有质量分数为12%的二甲基亚砜（dmso）。
14.进一步的，所述保存液调节ph至7.0
‑
9.0。
15.具体的，所述保存液调节ph至8.0。
16.借由上述方案，本发明至少具有以下优点：按照以上配方配制保存液，将采集的肿瘤组织直接置于保存液中，无需冻存，即可达到保护其中的dna和rna不发生降解。使用该配方保存肿瘤组织，可以在常温下达到冻存肿瘤组织的效果，从而使采样者在任何时候都可以进行采样和样品的保存，也能够用于肿瘤组织的长途运输。
17.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
18.图1是人非小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的dna和人非小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织冷冻保存3周的组织提取的dna进行琼脂糖凝胶电泳获得的电泳对比图，其中m1道是电泳marker，1道是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的dna，2道是人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的dna，3道是人肝癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的dna，4道是人肝癌组织冷冻保存3周的组织提取的dna，5道是人胃癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的dna，6道是人胃癌组织冷冻保存3周的组织提取的dna，7道是人直肠癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的dna，8道是人直肠癌组织冷冻保存3周的组织提取的dna。
19.图2是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的rna进行agilent2200tapestation毛细管电泳获得的结果图。
20.图3是人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳获得的电泳对比图，其中m1道是电泳marker，进行agilent2200tapestation毛细管电泳获得的结果图。
21.图4是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的rna和人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳获得的电泳对比图，其中m1道是电泳marker，1道是人非小细胞肺癌组织使用实施例1制备得到的dna和rna常温保护液在常温下保存3周后提取的rna，2道是人非小细胞肺癌组织冷冻保存3周的组织提取的rna。
具体实施方式
22.下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
23.实施例一。
24.1.按照表1成分组成配置dna和rna保存液。表1 乙二胺四乙酸二钠(edta
‑
2na)0.25mol/l异硫氰酸胍0.215g/l二甲基亚砜(dmso)12％
饱和氯化钠(nacl)饱和ph7.0
‑
8.0
25.2.配置好的保存液置于高压蒸汽灭菌锅中，压力为103.4kpa（1.05kg/cm2），温度为121.3
°
c条件下，灭菌25分钟。
26.实施例二：1.将手术切除的新鲜非小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织，分成2份，一份立即放入实施例1配置的保存液中，常温下储存3周；一份立即冷冻，然后
‑
80℃冰箱保存3周。
27.2.分别使用步骤1获得的、经过3周保存的小细胞肺癌组织、肝癌组织、胃癌组织、直肠癌组织进行dna提取，并与立即冷冻，然后
‑
80℃冰箱保存3周提取的dna进行对比。dna提取均按照如下方案进行：(1)取组织20mg；(2)加入180μl buffer atl ,使用tissuelyser进行组织匀浆后再加入20ul蛋白酶k，混匀，56℃消化1
‑
3h或直至消化完全；(3)向步骤(2)所得消化后的样本中加入4μl rnase a(takara ,10mg/ml)，上下颠倒混匀后，常温消化2mins；(4)向步骤(3)所得的消化后的样本加入200μl buffer al，用移液枪吸打混匀，再加入200μl乙醇(96％
‑
100％)混匀，用移液枪吸打混匀后得混合液；(5)转移混合液到过滤柱spin column，采用2ml收集管，8000rpm离1min，弃滤液，换一新2ml收集管；(6)加500μlbuffer aw1到过滤柱中，8000rpm离1min，弃滤液，换一新2ml收集管；(7)加500μlbuffer aw2到过滤柱中，涡旋混匀15s，14000rpm离3min，弃滤液及旧收集管；(8)将过滤柱转移至新1 .5ml离心管，100μlbuffer ae温室孵育1min，14000rpm离心1min洗脱；(9)进行gdna定量。
28.3.结果：(1)冷冻保存3周的小细胞肺癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .95，a260与a230的比值为2 .21；浓度[nanodrop]320 .5ng/ul；总量30ug。保存液常温保存3周的非小细胞肺癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .82，a260与a230的比值为2 .42；浓度[nanodrop] 295 .1ng/ul；总量29ug。
[0029]
(2)冷冻保存3周的肝癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .85，a260与a230的比值为2 .32；浓度[nanodrop]430 .5ng/ul；总量40ug。保存液常温保存3周的肝癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .82，a260与a230的比值为2 .61；浓度[nanodrop] 345 .1ng/ul；总量35ug。
[0030]
(3)冷冻保存3周的胃癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .89，a260与a230的比值为2 .51；浓度[nanodrop]370 .5ng/ul；总量37ug。保存液常温保存3周的胃癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .75，a260与a230的比值为2 .53；浓度[nanodrop] 336 .1ng/ul；总量33ug。冷冻保存3周的直肠癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .77，
a260与a230的比值为2 .41；浓度[nanodrop] 240 .5ng/ul；总量24ug。保存液常温保存3周的直肠癌组织所提取dna的a260与a280的比值为1 .78，a260与a230的比值为2 .53；浓度[nanodrop] 234 .1ng/ul；总量23ug.(4)将冷冻保存3周的肿瘤组织和保存液常温保存3周的肿瘤组织所提取的dna进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果请见图1。
[0031]
实施例三：1.将手术切除的新鲜小细胞肺癌组织分成2份，一份立即放入实施例1配置的保存液中，常温下储存3周；一份立即冷冻，然后
‑
80℃冰箱保存3周。
[0032]
2.分别使用步骤1获得的、经过3周保存的小细胞肺癌组织进行rna提取，并与立即冷冻，然后
‑
80℃冰箱保存3周提取的rna进行对比。rna提取均按照如下方案进行：(1)取组织20mg；(2)匀浆处理： 向20 mg组织加300 μl裂解液rl，用研磨杵将组织彻底研磨；(3)随后向匀浆液 中加入590 μl rnase
‑
free ddh2o和10 μl proteinase k，混匀后56℃处理10
‑
20 min；(4)12,000 rpm离心5 min，取上清进行以下操作；(5)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中12,000 rpm离心60 sec，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中；(6)向吸附柱cr3中加入350 μl 去蛋白液rw1，12,000 rpm离心60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；(7)向吸附柱cr3中央加入80 μl的dnase i工作液，室温放置15 min；(8)向吸附柱cr3中加入350 μl去蛋白液rw1，12,000 rpm离心60 sec，弃废液，将吸附柱放回收集管中；(9)向吸附柱cr3中加入500 μl漂洗液rw，室温静置2 min，12,000 rpm离心60sec，弃废液，将吸附柱cr3放回收集管中；(10)重复步骤8；(11)12,000 rpm离心2 min，倒掉废液，将吸附柱cr3置于室温放置5分钟；(12)将吸附柱cr3转入一个新的rnase
‑
free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30
‑ꢀ
100 μl rnase
‑
free ddh2o，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min，得到 rna溶液；(13)进行rna定量。
[0033]
3.结果：(1)将冷冻保存3周的肿瘤组织和保存液常温保存3周的肿瘤组织所提取的rna进行agilent 2200tapestation毛细管电泳，结果见图2
‑
图3。
[0034]
(2)将冷冻保存3周的肿瘤组织和保存液常温保存3周的肿瘤组织所提取的rna进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果请见图4。
[0035]
本技术中无需保证组织样品中的细胞存活，只需保证经过保存后的组织样品中能提取出稳定、质量有保障的核酸即可。
[0036]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和
变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。