用于同种异体疗法的改良的干细胞群的制作方法

本发明涉及用于同种异体干细胞疗法，特别是适于用于预先致敏患者的治疗和用于再次治疗的改良的干细胞群。此外，提供了获得所述干细胞群的方法。另外，本发明涉及包含所述干细胞群的药物组合物及其在同种异体干细胞疗法中的用途。

发明背景

用于研究和医学应用的干细胞可以来源于胚胎、胎儿或成体组织，并且包括胚胎干细胞(ESC)、脐带干细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)和来自不同来源的成体干细胞。当前正在进行或已成功结束了用于治疗以下疾病的多项临床试验：瘘、白血病、淋巴瘤、神经退行性疾病、脑和脊髓损伤、心脏病、失明和视力障碍、胰腺β细胞功能丧失、软骨修复、骨关节炎、肌肉骨骼疾病、创伤、不孕症、自身免疫性疾病和炎性疾病(如炎性肠病)。可以在Mahla RS,International Journal of Cell Biology.2016(7):1–24中找到不同类型干细胞的当前医学应用的综述。

间充质干细胞(MSC)是多能基质细胞，其可以分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。

自体和同种异体MSC用于治疗各种病况的用途已经在几项临床试验中得到评估(Galipeau和Sensebe,(2018),Cell Stem Cell 22,824-833，特别是表S1)，包括专注于治疗受损的胃肠道、败血症和移植物抗宿主病以及几种自身免疫性和炎性疾病的那些临床试验。

成体MSC几乎可以在所有组织中找到，并且主要位于血管周围的小生境中。尽管绝大多数临床试验都是使用骨髓MSC(BM-MSC)进行的，但越来越多的试验使用来自其他来源(如脂肪组织)的MSC。BM-MSC和脂肪来源的间充质干细胞(ASC)共享相似的效价能力和复制比例。然而，ASC赋予培养样品更容易收获和更丰富的优势(与BM组织相比，1克脂肪组织中的丰度要高出100倍)。

标准的免疫学教条认为，任何外来组织都会在生物体中引发免疫反应。这个概念在实体器官和造血移植中很明显，其中积极的免疫抑制是保护同种异体移植物免受排斥的规范。抗体在移植排斥中的作用的最有力证据是主要血管化器官(如肾脏和心脏)的超急性排斥。在出现这些反应的受体中可以显示高滴度的抗供体抗体。这些抗体与内皮细胞上的HLA抗原结合，随后补体固定并积累多形核细胞。然后可能由于从多形核白细胞释放的酶而出现内皮损伤；然后血小板积聚，血栓形成，并且结果是肾皮质坏死或心肌梗塞。为了避免这种抗HLA抗体介导的反应，在临床器官和组织移植中进行HLA分型，以尽可能匹配供体和受体，来避免移植排斥。

随着基于细胞的疗法领域的发展，很明显，各种细胞类型–以间充质干细胞(MSC)为原型–可能具有逃避和/或抑制免疫系统的能力，因此在一些研究中，MSC已得到应用而没有伴随的免疫抑制。

Griffin等人,Immunol.&Cell Biol.(2012),1-12回顾了实验数据，以确定是否存在良好的体内证据来支持异MSC的“免疫赦免”状态。他们考虑了已发表的关于异MSC在通过炎症刺激激活后或在分化后的免疫原性的研究。作者总结发现这些研究中的大多数都记录了在施用非操纵的、IFN-γ激活的和分化的异MSC后针对供体抗原的特异性细胞(T细胞)和体液(B细胞/抗体)免疫应答，对随后的同种异体移植物的排斥加速，以明显促进供体特异性耐受性。在这些研究的一些中，观察到对移植物或施用的MSC的排斥加速(参见Griffin等人的表1和表2)。作者建议重新考虑异MSC的免疫赦免性质的概念，并更精确地研究了异MSC引发的抗供体免疫应答的范围和临床意义。因此，由于人类和动物的同种异体疗法的改良的异MSC清除和/或不利影响，抗供体免疫应答可能对疗效有意义。

鉴于此，需要适于患者的同种异体疗法的方式，其中所述方式展现出对预先致敏的患者和/或用于再次治疗的同种异体疗法的降低的免疫原性和/或增加的适宜性。此外，还应提供获得它们的方法以及它们的医学用途。

发明概述

本发明所基于的技术问题通过提供如权利要求中所限定的主题来解决。

根据第一方面，提供了选择适于同种异体疗法，特别地利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗患者的干细胞(SC)群的体外方法，其包括以下步骤：

a)在能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度存在下培养所述SC群的样品(测试样品)，并在缺乏IFN-γ的情况下单独培养所述SC群的样品(对照样品)；

b)在使得所述HLA-I类抗体与所述测试样品和所述对照样品中表达的HLA-I类结合的条件下，使所述测试样品和所述对照样品与一系列不同浓度的HLA-I类抗体接触；

c)向所述测试样品和所述对照样品中加入补体，使得结合的HLA-I类抗体被补体饱和，并诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)；

d)通过测量在所述测试样品和所述对照样品中诱导的细胞裂解，确定一系列不同浓度的所述HLA-I类抗体的CDC；

e)确定在所述测试样品和所述对照样品中诱导50％的最大CDC(EC50值)的HLA-I类抗体浓度；以及

f1)如果所述对照样品的EC50值与所述测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5；特别优选地小于0.25，则选择所述SC群用于同种异体疗法；或

f2)如果所述测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml的所述HLA-I类抗体，则选择所述SC群用于同种异体疗法。

根据第二方面，提供了适于同种异体疗法，特别地利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗的SC群，其具有以下性质中的任一种：

i)对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5，并且特别优选地小于0.25，其中所述EC50值按根据本发明所述方法中所示确定；

ii)所述测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml HLA-I类抗体，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml HLA-I类抗体，其中所述EC50值按根据本发明所述方法中所示确定；和/或

iii)所述测试样品中CD46的表达与所述对照样品中CD46的表达的比例大于2.0，优选地大于2.5，特别优选地大于3.0，其中所述CD46的表达按根据本发明所述方法中所示确定。

根据第三方面，提供了包含根据本发明所述的SC群和任选地药学上可接受的载体的药物组合物。

根据第四方面，提供了制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：

a)进行根据本发明所述的方法；

b)用至少一种药学上可接受的载体配制所选择的SC群。

根据第五方面，提供了根据本发明所述的SC群在有需要的患者，优选地预先致敏的患者或经历再次治疗的患者的同种异体干细胞疗法中的用途。

根据第六方面，提供了同种异体干细胞疗法，其包括向有需要的患者，优选地向预先致敏的患者或经历再次治疗的患者施用根据本发明所述的SC群。

本发明的发明人已经研究了当向患有克罗恩病和难治性、引流复杂的肛周瘘患者施用ASC群时是否发生同种异体致敏，其中将ASC群病灶内施用于同种异体、非HLA匹配的受体。据观察，虽然在时间0时只有4名患者表现出对HLA-I类分子的抗体反应性，但22名患者在治疗12周后表现出这种抗体反应性。在对照组中，12周后仅观察到反应性从6名患者(在时间0时)增加到9名患者。随后，研究了来自不同供体的ASC细胞群。发现，来自预先致敏的患者和发展出抗HLA I类反应性的患者的血浆样品在其结合行为和其在来自不同供体的IFN-γ诱导ASC群中诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)的能力方面具有显著差异。基于这些发现，本发明的发明人还确定了来自不同供体的SC群在其HLA-I类结合和其由于经典补体途径(抗体/补体复合物形成)的激活而对细胞裂解的敏感性方面存在显著差异，其中对体外同种异体反应性更具抗性的SC群更适合于同种异体疗法的目的。这特别适用于其中患者被HLA-I类抗原预先致敏，例如通过较早的怀孕的预先致敏的情况，或在其中向同一患者多次施用同一供体SC群的再次治疗的情况。本发明的发明人还确定了对同种异体反应性的抗性增加是由CD46表达介导的，并且ASC细胞中CD46表达的抑制与增强的CDC敏感性相关。

附图简述

图1显示了ADMIRE CD1中DSA生成的表征。A.所示访视的Labscreen混合/Labscreen单一抗原(LSM/LSA)的分布(Tait等人(2013),Transplantation 95:19-47)结果：治疗前(基线)，研究的安慰剂(下图)组和Cx601(上图)组中的W12和W52。共有5名(Cx601组)和12名(安慰剂组)患者退出研究，并因此没有可用的LSM/LSA数据。B.示出了抗HLA Ab滴度的动力学曲线，其表示为在所示时间点利用LSM测定测量的来自每个微球的平均荧光强度的总和(ΣMFI)。每张图中的虚线表示用于确定阳性的MFI>3,000阈值。右上图中的圆圈表示患者92(Pat92)。C.代表每名患者和ASC之间的HLA不相容性的图。对于不相容性的相关性，将产生DSA的个体的百分比相对于错配eplets(在基因座中发现的多态性残基的非共有、独特的链)的数量(范围)作图(Duquesnoy(2002)Hum.Immunol.63:339-352)。对于线性回归，应用了Pearson检验(r²)。通过学生t检验确定P值。

图2显示了ASC和体外抗HLA Ab结合中的HLA表达。A.显示MFI增加以及针对未处理的(黑色圆圈)和用IFNγ预激活的(白色方形)ASC的每种浓度的I类HLA(W6/32)Ab和II类HLA(L243)Ab之间的相关性的图。B.代表阴性对照(同种型)、阳性对照(高免疫性的样品，HI库)和患者92(Pat92，产生从头DSA的初始患者)血清的FcTox(通过流式细胞术测定的补体依赖性细胞毒性)的图。左下图显示了使用同种型对照(浅灰色)、高免疫性血清(深灰色)或Pat92血清(中等深灰色)的FACS结合强度定量(IgG 细胞的总数量)。右下图显示了对照条件(无兔补体，浅灰色)高免疫性血清或Pat92血清(中等深灰色)中的FACS细胞死亡定量(7-AAD 细胞的总数量)。通过学生t检验和通过Pearson检验的r²确定P值。

图3显示了ADMIRE CD1血浆样品在体外诱导ASC中的低细胞毒性杀伤。A.显示所示时间点(W0治疗前和W12治疗后)，10名预先致敏的(上图)和17名从头DSA 患者(下图)中的HLA-I结合的归一化的百分比值的图。在结合测定前，在正常(基线)条件下或在3ng/mL IFNγ存在下，将DonA(在ADMIRE CD1试验中施用的供体)和DonB ASC培养48小时。B.显示所示时间点，10名预先致敏的(上图)和17名从头DSA 患者(下图)中7-AAD阳性ASC的归一化的百分比值的图。通过学生T检验确定P值。

图4显示了ASC表达高水平的mCRP。A.显示经由FACS分析的7名ASC供体(黑色条)和1名BM-MSC供体(白色条)中CD46、CD55和CD59的MFI值的图。将细胞在3ng/mL(IFNγ)存在下培养48小时，或不进行处理(基础的)。B.显示通过FACS分析确定的7名ASC供体中的CD46、CD55和CD59的不同的MFI值的图。将细胞在3ng/mL IFNγ的存在下培养48小时(IFNγ)，或不进行处理(基础的)。C.显示依赖于用于在基础条件下(左图)和利用IFNγ(右图)培养的来源于供体DonA、DonB、DonC、DonD、DonE、DonF和DonG的ASC的抗体浓度的抗体结合(上图)和细胞死亡(下图)的图。通过学生t检验确定P值。从右下图可以确定EC50值。

图5显示了CD46介导ASC中的补体细胞毒性。A.显示7-AAD阳性亲本和CD46^KO DonB ASC的百分比针对增加的W6/32Ab浓度水平的图。在分析前，使亲本和CD46^KO DonB ASC在3ng/mL IFNγ存在下生长48小时(IFNγ)，或不进行处理(基础的)。B.显示7-AAD阳性亲本和CD46^KO ASC的百分比针对W6/32Ab的浓度(从线性转换为log10)的Sigmoidal曲线。从双因素方差检验确定P值。

图6A-B涉及在3ng/mL IFNγ存在下生长48小时(白色方形)或基础条件(黑色圆圈)的ASC供体的W6/32(A)以及CD46、CD55和CD59(B)的MFI值的相关性。P值显示了来自线性回归的斜率显著性。IFNγ条件下CD46和CD55(B)的斜率显著性的R平方值分别为0.74和0.71。C.显示亲本(白色条)和CD46^KO(黑色和灰色条)ASC中的CD46 MFI值的图。在分析前，使亲本和CD46^KO ASC与3ng/mL IFNγ一起生长48小时(IFNγ)，或不进行处理(基础的)。通过学生t检验确定P值。

发明详述

当在本说明书和权利要求书中使用术语“包含(comprise/comprising)”时，其不排除其他要素或步骤。出于本发明的目的，术语“由…组成(consisting of)”被认为是术语“包含(comprising of)”的任选实施方案。如果在下文中一个组被限定为包含至少一定数量的实施方案，则这也应理解为公开了任选地仅由这些实施方案组成的组。

当在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“一个/种(a/an)”、“所述(the)”时，除非特别说明，否则包括该名词的复数形式。反之亦然，当使用名词的复数形式时，它也指单数形式。

此外，说明书和权利要求中的术语第一、第二、第三或(a)、(b)、(c)等用于区分相似要素，并且不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且在本文中所述的本发明的实施方案能够以除了本文所述或所示之外的其他顺序进行操作。

在本发明的上下文中，所示的任何数值通常与本领域技术人员将理解仍确保所讨论特征的技术效果的准确度区间相关联。如本文所用的，与所示数值的偏差在±10％，并且优选地±5％的范围内。上述与所示数值区间±10％，优选±5％的偏差也由本文使用的关于数值的术语“约”和“大约”表示。

根据第一方面，提供了选择适于同种异体疗法，特别地利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗患者的干细胞(SC)群的体外方法，其包括以下步骤：

a)在能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度存在下培养所述SC群的样品(测试样品)，并在缺乏IFN-γ的情况下单独培养所述SC群的样品(对照样品)；

b)在使得所述HLA-I类抗体与所述测试样品和所述对照样品中表达的HLA-I类结合的条件下，使所述测试样品和所述对照样品与一系列不同浓度的HLA-I类抗体接触；

c)向所述测试样品和所述对照样品中加入补体，使得结合的HLA-I类抗体被补体饱和，并诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)；

d)通过测量在所述测试样品和所述对照样品中诱导的细胞裂解，确定一系列不同浓度的所述HLA-I类抗体的CDC；

e)确定在所述测试样品和所述对照样品中诱导50％的最大CDC(EC50值)的HLA-I类抗体浓度；以及

f1)如果所述对照样品的EC50值与所述测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5；特别优选地小于0.25，则选择所述SC群用于同种异体疗法；或

f2)如果所述测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml的所述HLA-I类抗体，则选择所述SC群用于同种异体疗法。

本文的“干细胞(SC)群”意指任何干细胞，其包括胚胎多能干细胞(ESC)、胎儿干细胞和成体干细胞。所述群可以是原代细胞培养物、细胞系或来源于克隆。

干细胞群可以是多能干细胞群或间充质干细胞(MSC)群，例如骨髓来源的、脐带组织来源的、血液来源的(包括脐带来源的)、月经、牙髓来源的、胎盘来源的或脂肪来源的MSC(Huang等人，J Dent.Res.(2009)88(9):792-806；Carvalho等人，Curr.Stem Cell Res.Ther.(2011)6(3):221-8；Harris et al.,Curr Stem Cell Res Ther.(2013)8(5):394-9；Li等人，Ann.N YAcad.Sci.(2016)1370(1):109-18)。在优选的实施方案中，干细胞是人干细胞(例如人ASC)。在本发明的优选实施方案中，干细胞群是脂肪来源的基质干细胞(ASC)。ASC可以是扩增的ASC群。

产生和培养干细胞群的方法是熟知的。

干细胞群可以是基本上纯的。关于干细胞群(例如MSC群，诸如ASC群)的术语“基本上纯的”是指至少约75％，通常至少约85％，更通常至少约90％，且最通常至少约95％同质性的干细胞群。可以通过形态学和/或细胞表面标志物特征来评估同质性。本文公开了用于评估形态学和细胞表面标志物特征的技术。

干细胞的特征在于它们在未分化的状态下的自我更新能力，以及它们分化成特化细胞类型的能力。从克隆可公开获得ESC。成体干细胞是未分化的细胞，其包括造血干细胞、乳腺干细胞、肠道干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、嗅觉成体干细胞、神经嵴干细胞和睾丸细胞。优选地，SC群是间充质干细胞(MSC)，更优选地人MSC群。

多能干细胞

有两种来源的多能干细胞。首先，胚胎干细胞(ESC)来源于植入前囊胚的内细胞团，并且多能性受核心转录因子、八聚体结合转录因子4(OCT4)、性别决定区Y框2(SOX2)和Nanog同源框(NANOG)的内在调控网络控制。其次，诱导的多能干细胞(iPSC)源自对诱导体细胞的多能性必需的四种转录因子OCT4、SOX2、Kruppel样因子4(KLF4)和MYC原癌基因(C-MYC)的异位或升高的表达。

分离胚胎干细胞(如人胚胎干细胞)的稳定的(未分化的)培养物的技术已经很好地建立起来(例如，US 5,843,780；Thomson等人Science(1998)282:1145-1147；Turksen&Troy(2006)Human Embryonic Stem Cells.Turksen K.(eds)Human Embryonic Stem Cell Protocols.Methods in Molecular Biology,第331卷，Humana Press；Sevilla等人，Stem Cell Research(2017)25:217-220；和Mitalipova&Palmarini(2006)Isolation and Characterization of Human Embryonic Stem Cells.Turksen K.(eds)Human Embryonic Stem Cell Protocols.Methods in Molecular Biology,第331卷，Humana Press)。

从其于2007年由Yamanaka的团队(e.g.Takahashi等人，Cell(2007)131(5):861-72)发现开始，产生iPSC的技术已非常成熟。从那时起，已开发出新的改良的iPSC产生方法，其包括非集成和无饲养层方法以及自动高通量推导(Paull等人，Nature Methods(2015)12(9):885 892)。

iPSC的特征在于表达一连串的多能性标志物：NANOG、SOX2、SSEA4、TRA1-81、TRA1-60，以及缺乏谱系特异性标志物。iPSC的多能性通过它们在胚状体测定中分化为三个胚层的能力得到证明，通过免疫组织化学对来自三个胚层的分化标志物Tuj1(外胚层标志物)、SMA(中胚层标志物)和SOX17(内胚层标志物)进行后验分析(Paull等人，Nature Methods(2015)12(9):885 892。

诱导的多能干细胞(iPSC)源自对诱导体细胞多能性必需的四种转录因子OCT4、SOX2、Kruppel样因子4(KLF4)和MYC原癌基因(C-MYC)的异位或升高的表达。

MSC

“间充质干细胞”(在本文中也被称为“MSC”)是多能基质细胞。它们通常来源于结缔组织，并且是非造血细胞。MSC群(根据Dominici等人(2006),Cytotherapy 8(4):315-317)，可以：(1)在标准培养条件(例如，最小必需培养基加20％胎牛血清)下粘附至塑料；(2)表达(即，大于或等于80％的MSC群)CD105、CD90、CD73和CD44；(3)缺乏表达(例如，小于或等于5％的MSC群)CD45、CD14或CDllb、CD790L或CD19，以及HLA-DR(HLAII类)；(4)能够分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。

可以使用标准方法从例如骨髓、脐带组织和血液、月经、牙髓、脐带血、胎盘和脂肪组织获得MSC。尽管从不同组织获得的MSC相似，但它们在表型和功能特征上存在一些差异。例如，细胞表面标志物CD54和CD106的表达水平可能因MSC的来源/起源而不同。这些可以通过流式细胞术测量。诸如SOX2、ILlα、IL1β、IL6和IL8的一些基因的mRNA水平可能由来自不同组织的MSC差异性地表达，并且可以通过常规方法进行测量。IL6和PGE2分泌也可能在来自不同来源的MSC之间不同，因此细胞可能具有不同的调节能力(参见，例如Yang等人，PLoS ONE(2013)8(3)e59354)。

骨髓来源的MSC(BMSC)

骨髓间充质干细胞(BM-MSC)与来自其他组织来源的MSC相似。然而，与来自其他组织来源的MSC(如脐带MSC、胎盘MSC、牙髓MSC和月经MSC)相比，它们在表型和功能特征上具有一些差异。尽管它们的最低表征标准是常见的，包括它们粘附在塑料上的能力、最小的表面特性标志物以及分化成骨骼、软骨、肌腱和脂肪组织的能力，但它们都有一些细微的差异。这些独特性包括不同表达水平的一些表面标志物(如CD105)，涉及它们的免疫调节潜力和再生潜力的不同水平的分泌的可溶性因子，以及一般而言，可能使每种来源或起源更适于特定治疗指征的略微不同的功能性质(Miura等人，Int J Hematology(2016)103(2):122-128；Wuchter等人，Cytotherapy(2015)17(2):128-139；Wright等人，Stem Cells(2011)29(2):169-178)。

脐带来源的和牙髓来源的MSC

Huang等人(J.Dent.Res.(2009)88(9):792-806)讨论了来自牙髓的MSC，并将它们的特性与来自其他来源的MSC进行了比较。Carvalho等人(Curr Stem Cell Res Ther.(2011)6(3):221-228)和Harris等人(Curr Stem Cell Res Ther.(2013)8(5):394-399)讨论了脐带来源的MSC、它们的特性(包括表型和分泌组)，及其应用。

ASC

脂肪来源的MSC(ASC)通常是从皮下脂肪组织中分离出来的，这使得它们可被大量获得。ASC以高细胞活性快速增殖，使其成为获得MSC的理想来源。

“脂肪组织”意指任何脂肪组织。脂肪组织可以是棕色或白色脂肪组织，来源于皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位。通常，脂肪组织是皮下白色脂肪组织。此类细胞可以包括原代细胞培养物或永生化细胞系。脂肪组织可以来自具有脂肪组织的任何生物体。通常，脂肪组织是哺乳动物的脂肪组织，最通常，脂肪组织是人的脂肪组织。脂肪组织的方便来源是来自吸脂手术，然而，脂肪组织的来源或脂肪组织的分离方法对本发明并不是至关重要的。

优选的ASC是产品“Darvadstrocel”(商品名)中授权的人同种异体脂肪来源的干细胞(人eASC)。这些扩增的ASC表达细胞表面标志物CD29、CD73、CD90和CD105。细胞能够表达诸如以下的因子：血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素6(IL-6)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)以及干扰素-γ(IFN-γ)和可诱导的吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。因此，ASC群的特征可能在于至少约50％、至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约85％；至少约90％或至少约95％或更多表达CD29、CD73、CD90和/或CD105中的一种或多种。ASC群的特征可能在于至少约50％、至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约85％；至少约90％或至少约95％的细胞群表达CD29、CD73、CD90和CD105中的全部。通常，ASC群的特征可能在于至少约80％的细胞群表达CD29、CD73、CD90和CD105中的全部。

根据Bourin等人(Cytotherapy(2013)15(6):641-648)，ASC群可以被限定为对CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105的表达呈阳性，并且对CD31和CD45的表达呈阴性。在ASC群中，至少约50％、至少约60％；至少约70％；至少约80％；至少约85％；至少约90％或至少约95％的细胞群可以表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，并且少于约5％、约4％、约3％或约2％的ASC群可以表达CD31和CD45。通常，在ASC群中，至少约80％的细胞群可以表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，并且少于约5％的ASC群可以表达CD31和CD45。

在标准培养条件下，ASC可能会粘附在塑料上。扩增的ASC(eASC)在培养中展现出成纤维细胞样的形态。具体来说，这些细胞很大，并且形态学上的特征在于细胞体浅，长而细的细胞突起很少。细胞核大而圆，核仁突出，使细胞核外观清晰。大多数eASC展示出这种纺锤形形态，但通常一些细胞获得多边形形态(Zuk等人，Tissue Eng(2001)7(2):211-228)。

ASC可能对表面标志物HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105呈阳性。在一些实施方案中，ASC群的特征可能在于至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％；至少约90％或至少约95％的ASC群表达表面标志物HLA-I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105。通常，至少约80％的eASC表达表面标志物HLA1、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105。

ASC可能对表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86呈阴性。在一些实施方案中，ASC群的特征可能在于少于约5％的ASC群表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。更典型地，少于约4％、3％或2％的ASC群表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。在一个实施方案中，少于约1％的ASC群表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。

在一些情况下，在ASC群中，至少约80％的细胞群表达CD29、CD73、CD90和CD105中的全部，并且少于约5％的ASC群表达表面标志物HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80和CD86。

在一些实施方案中，ASC群可以表达HLAI、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或七种)。在一些实施方案中，eASC可以不表达HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或八种)。在一些实施方案中，eASC表达HLA I、CD29、CD44、CD59、CD73、CD90和CD105中的四种或更多种，并且不表达HLAII、CD11b、CD11c、CD14、CD45、CD31、CD80中的四种或更多种。

CD34的表达可以是阴性的或很低，例如由0至约30％的ASC群表达。因此，在一些情况下，如上所述的ASC可以以低水平表达CD34，例如，在约5％至约30％的细胞群中。可替代地，在其他情况下，如同所述的ASC不表达CD34，例如少于约5％的ASC群表达CD34。

在一些实施方案中，ASC群(例如至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％；至少约90％或至少约95％的细胞群)可以表达标志物CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49A、CD51、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90和CD105中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或者十种或更多种(例如，多达13种))。例如，ASC可以表达标志物CD29、CD59、CD90和CD105中的一种或多种(例如两种、三种或全部)，例如CD59和/或CD90。

在一些实施方案中，ASC群可以不表达标志物因子VIII、α-肌动蛋白、肌间线蛋白、S-100、角蛋白、CD11b、CD11c、CD14、CD45、HLAII、CD31、CD45、STRO-l和CD133中的一种或多种(例如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种，或者十种或更多种(例如，多达15种))，例如ASC不表达标志物CD45、CD31和CD14中的一种或多种(例如两种、三种或全部)，例如CD31和/或CD45。

在某些实施方案中，如上所述的ASC(i)不表达抗原呈递细胞(APC)的特异性标志物；(ii)不组成性地表达IDO；和/或(iii)不显著地组成性地表达MHC II。通常，IDO或MHC II的表达可能是通过用IFN-γ刺激诱导的。在某些实施方案中，如上所述的ASC不表达Oct4。

制备ASC群的方法

用于分离和培养ASC以提供本发明的eASC和干细胞群的方法，以及包含本发明的干细胞群的群的组合物是本领域已知的。ASC通常是从脂肪组织的基质级分制备的，并且通过粘附到合适的表面(例如塑料)来进行选择。因此，本文所公开的干细胞冷冻保存的方法可以包括以下初始步骤(在任一种方法的步骤(a)之前)：(i)从获自患者的脂肪组织的基质级分中分离ASC群，以及(ii)培养ASC群。可以在步骤(i)中任选地针对粘附至合适的表面(例如塑料)上对ASC进行选择。任选地，可以在培养步骤(ii)期间和/或随后评估ASC的表型。

制备ASC群的方法

用于分离和培养ASC以提供本发明的eASC和干细胞群的方法，以及包含本发明的干细胞群的群的组合物是本领域已知的。ASC通常是从脂肪组织的基质级分制备的，并且通过粘附到合适的表面(例如塑料)来进行选择。因此，本文公开的干细胞冷冻保存的方法可以包括以下初始步骤(在任一种方法的步骤(a)之前)：(i)从获自患者的脂肪组织的基质级分中分离ASC群，以及(ii)培养ASC群。可以在步骤(i)中任选地针对粘附至合适的表面(例如塑料)上对ASC进行选择。任选地，可以在培养步骤(ii)期间和/或随后评估ASC的表型。

可以通过本领域的任何标准方式获得ASC。通常，从来源组织(例如脂肪抽吸物或脂肪组织)中分离细胞来获得所述细胞，通常通过用消化酶(如胶原酶)处理组织。然后通常通过约20微米至1mm的过滤器来过滤消化后的组织物质。然后分离细胞(通常通过离心)并在粘附表面(通常是组织培养板或烧瓶)上培养。这种方法是本领域已知的，并且例如如第6,777,231号美国专利中所公开的。

根据该方法，从脂肪组织和来源于其的细胞中获得脂肪抽吸物。在此方法的过程中，可以洗涤细胞以去除污染的碎屑和红血细胞，优选地用PBS。用于PBS中的胶原酶消化细胞(例如，在37℃下30分钟，0.075％胶原酶；I型，Invitrogen,Carlsbad,CA)。为了清除剩余的红血细胞，可以对消化的样品进行洗涤(例如用10％胎牛血清)，用160mmol/L NH4Cl处理，并最后悬浮在DMEM完全培养基(含有10％FBS、2mM谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM)中。可以将细胞通过40μm尼龙网过滤。

培养的人ASC被描述于在DelaRosa等人(Tissue Eng Part A.(2009)15(10):2795-806)，Lopez-Santalla等人(Stem clls(2015)33:3493—3503)中。在一实施方案中(如Lopez-Santalla等人(2015)，上文引用中所述的)，将来自健康供体的人脂肪组织抽吸物用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并用0.075％胶原酶(I型；Invitrogen)消化。将消化的样品用10％胎牛血清(FBS)洗涤，用160mM NH4Cl处理以清除剩余的红细胞，并悬浮在培养基(含10％FBS的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM))中。将细胞(2-3×10⁴个细胞/cm²)接种到组织培养瓶中并培养(37℃，5％CO2)，每3-4天更换一次培养基。当它们达到90％汇合时，将细胞转移到新的烧瓶中(10³个细胞/cm²)。将细胞扩增至复制12-14代并冷冻。

在另一实施方案中(如DelaRosa等人(2009),Tissue Eng Part A 15(10):2795-806所述)，将从来自健康成人供体的人脂肪组织获得的脂肪抽吸物用PBS洗涤两次，并在37℃下用于PBS中的18U/mL I型胶原酶消化30分钟。一个单位的胶原酶于37℃、pH 7.5下在5小时内从胶原中释放1mM L-亮氨酸等价物(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将消化的样品用10％的胎牛血清(FBS)洗涤，用160mM NH4Cl处理，悬浮在培养基(含10％FBS的DMEM)中，并通过40-mm尼龙网过滤。将细胞(2-3×10⁴个细胞/cm²)接种到组织培养瓶中，并在37℃和5％CO2下扩增，每7天更换一次培养基。当培养物达到90％汇合时，将细胞转移到新的培养瓶中。细胞的表型特征在于它们分化为软骨、骨和脂肪谱系的能力。

将ASC在合适的组织培养容器中培养，所述容器包括适于ASC粘附的表面(例如塑料)。去除非粘附细胞(例如通过在合适的缓冲液中洗涤)以提供分离的粘附基质细胞群(例如ASC)。可以将以这种方式分离的细胞接种(优选地2-3×10⁴个细胞/cm²)到组织培养瓶上，并在37℃和5％CO2下扩增，每3-4天更换一次培养基。当培养物达到约90％汇合时，优先地将细胞从粘附表面分离(例如通过胰蛋白酶的方式)并转移(“传代”)到新的培养瓶(1,000个细胞/cm²)。

可将ASC培养至少约15天、至少约20天、至少约25天或至少约30天。通常，培养中细胞的扩增提高了群体中细胞表型的同质性，以便获得基本上纯的群体。

在一些实施方案中，ASC在培养中扩增至少三次培养传代或“至少传代三次”。在其他实施方案中，细胞被传代至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。优选将细胞传代多于3次，以提高细胞群中细胞表型的同质性。事实上，只要细胞表型的同质性得到改善并保持分化能力，就可以无限地在培养中扩增细胞。

在一些实施方案中，ASC在培养中增殖至少三次群体倍增，例如，细胞在培养中扩增至少四、五、六、七、八、九、十、15或20次群体倍增。在一些实施方案中，细胞在培养中扩增少于七、八、九、十、15或20次群体倍增。在某些实施方案中，细胞在培养中扩增约5至10次群体倍增。在某些实施方案中，细胞在培养中扩增约10至15次群体倍增。在某些实施方案中，细胞在培养中扩增约15至20次群体倍增，例如约16次群体倍增。ASC分离优选地在无菌或GMP条件下进行。

本文的“同种异体疗法”意指基于细胞的疗法，其中供体是与细胞受体不同的人。优选地，同种异体疗法不涉及供体和受体之间的HLA匹配。在药物制造中，同种异体方法很有前景，因为HLA无匹配的同种异体疗法可以形成“现成”产品的基础。

本文的“预先致敏”意指在实际施用SC群之前，患者对给定的SC群表现出预先存在的免疫力。预先存在的免疫力可能与供体特异性抗体(DSA)(特别是特异性针对HLA-I类分子的DSA)的存在相关。这可以通过本领域已知的方法(如分光光度计、流式细胞术交叉配型(FCXM)、荧光或发光测定(例如ELISA(酶联免疫吸附测定))确定，其中HLA-I类分子与板结合。预先存在的免疫力可能例如是由于较早的输血或在女性中是由于较早的怀孕引起的。

本文的“再次治疗”意指在将第一剂量的来自第一个供体的第一SC群施用于患者后，该患者要么接受另一剂量的来自第一个供体的第一SC群，要么接受一剂来自第二个供体的第二SC群。可能需要再次治疗以相比单次剂量施用增加治疗功效。

“培养SC群的样品”在本文中意指SC群被包含在适于维持SC群活力的细胞培养基中。合适的细胞培养基可能包含SC群必需的营养物质，诸如氨基酸、碳水化合物、维生素和/或盐。通过使用缓冲剂使pH适应合适的条件。优选地，细胞培养基选自RPMI(可从Gibco获得)或DMEM(可从例如Sigma-Aldrich获得)。

“能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度”在本文中意指能够在所述SC群的表面上提供最大量的HLA-I类分子的IFN-γ浓度。可以通过荧光活化的细胞分选(FACS)，或以ELISA测定形式(如以使用直接连接至发色团或荧光团或利用标记的二抗间接连接的HLA-I类抗体的夹心测定形式)，来确定所述SC群表面上的HLA-I类分子的量。如果当用较高的IFN-γ浓度处理细胞时HLA-I类的表达没有进一步增加，则诱导了最大HLA-I类表达。

已知IFN-γ增加HLA-I类分子的表达和呈递。根据优选的实施方案，能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度为约0.5至约30ng/ml，优选地约1至约15ng/ml，更优选地约2至约4ng/ml，并且最优选地其为3ng/ml。优选地，将IFN-γ与SC群一起孵育12至72小时的时间段，优选地24至60小时的时间段，更优选地30至54小时的时间段，并且最优选地48小时的时间段。最优选地，能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度为3ng IFN-γ/ml，并将IFN-γ与SC群一起孵育48小时的时间段。

“HLA-I类抗体”在本文中意指能够特异性地结合HLA-A、HLA-B和/或HLA-C的抗体。在本上下文中，“特异性地”应意指结合不是非特异性的。术语“特异性地”包括与共有允许抗体也与相关的抗原交叉反应的表位的抗原结合。抗体可以是任何亚型，其包括IgG和IgM。抗体可以来自任何来源，优选地抗体是鼠、兔、绵羊或山羊抗体，优选鼠抗体。抗体优选地包括能够与补体系统的蛋白质相互作用的恒定区(Fc区)。

在优选的实施方案中，HLA-I类抗体特异性地结合HLA-A、HLA-B和HLA-C。因此，优选地，抗体是识别在HLA-A、HLA-B和HLA-C重链间保守的表位的泛-HLA-I类抗体。

在更优选的实施方案中，HLA-I类抗体对HLA-A(优选地HLA-A2，最优选地HLA-A*0201)具有与能从ATCC(名称：HB-95)或ECACC(编号：84112003)获得的杂交瘤克隆w6/32所产生的抗体基本上相同的结合亲和力。优选地，通过使用ELISA方法确定结合亲和力。“基本上相同的结合亲和力”意指HLA-I类抗体的结合亲和力与杂交瘤克隆w6/32所产生的抗体的结合亲和力的差异小于10％，优选地小于8％，且更优选地小于5％。

在甚至更优选的实施方案中，抗体由杂交瘤克隆w6/32产生。该杂交瘤克隆能从ATCC(名称：HB-95)或ECACC(编号：84112003)获得。

“一系列不同浓度的HLA-I类抗体”在本文中意指如通过细胞裂解所确定的，用不同浓度的HLA-I类抗体处理测试样品和对照样品，产生不同的CDC值。可以在测试曲线中描绘取决于HLA-I类抗体浓度的不同的CDC值。

在一实施方案中，HLA-I类抗体的不同浓度在约1至约50ng/ml的范围内。在一实施方案中，使用了在约1至约50ng/ml范围内的两种或三种不同浓度的HLA-I类抗体。在一实施方案中，使用了在约1至约50ng/ml范围内的四种或五种不同浓度的HLA-I类抗体。在一实施方案中，使用了在约1至约50ng/ml范围内的六种或七种不同浓度的HLA-I类抗体。在一实施方案中，使用了在约1至约50ng/ml范围内的八种或九种不同浓度的HLA-I类抗体。

在一实施方案中，由杂交瘤克隆w6/32产生的HLA-I类抗体的不同浓度在约1至约50ng/ml的范围内。在一实施方案中，使用了由杂交瘤克隆w6/32产生的在约1至约50ng/ml范围内的两种或三种不同浓度的HLA-I类抗体。在一实施方案中，使用了由杂交瘤克隆w6/32产生的在约1至约50ng/ml范围内的四种或五种不同浓度的HLA-I类抗体。在一实施方案中，使用了由杂交瘤克隆w6/32产生的在约1至约50ng/ml范围内的六种或七种不同浓度的HLA-I类抗体。在一实施方案中，使用了由杂交瘤克隆w6/32产生的在约1至约50ng/ml范围内的八种或九种不同浓度的HLA-I类抗体。

在其他优选的实施方案中，HLA-I类抗体的一系列不同浓度为选自1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml和50ng/ml中的至少两种或三种，优选地四种或五种，更优选地六种或七种，且最优选地七种或八种的浓度。

“在使得HLA-I类抗体与测试样品和对照样品中表达的HLA-I类结合的条件下”在本文中意指测试样品和对照样品的SC群被包含在合适的培养基中，其允许抗体与干细胞结合。因此，培养基具有不会使抗体和/或细胞变性的pH值和盐浓度。优选地，培养基包含合适的缓冲系统以提供与人血液中的生理pH(pH 7.35-7.45)相似的pH。更优选地，培养基是磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液，其pH为7.4并含有137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4。

如本文所用的“补体”意指来源于任何血液来源(包括血浆或血清)的补体。补体也可以被作为纯化或合成的补体蛋白的混合物使用。补体系统由血液中发现的许多小蛋白质组成，这些蛋白质由肝脏合成并作为无活性的前体循环。当被几种触发因素之一刺激时，系统中的蛋白酶会切割特定蛋白质以释放细胞因子并启动进一步切割的放大级联反应。这种补体激活或补体固定级联反应的最终结果是刺激吞噬细胞以清除外来和损坏的物质，刺激炎症以吸引另外的吞噬细胞，以及激活导致被攻击的细胞出现细胞裂解的细胞杀伤膜攻击复合物(MAC)。在同种异体识别过程中，当经典途径的起始介导物C1q与HLAI类抗原结合的抗体的Fc部分结合，导致C1q的激活以及随后的补体级联信号传导时，补体依赖性细胞毒性(CDC)被启动。

本文中的“被补体饱和”意指在根据本发明的方法中添加的补体的量与IFN-γ诱导的SC群(测试的样品)的表面上结合的HLA-I类抗体的量相比摩尔过量。可以通过使用不同浓度的补体进行测定来实验确定被补体饱和。一旦CDC活性达到其最大值并且不能再通过添加更高浓度的补体来增加，即实现了饱和。

在优选的实施方案中，权利要求1的步骤(c)中所使用补体来自血清。优选地，血清未经热处理。热失活可使补体蛋白质变性，使其能够形成MAC复合物。同样优选地，血清不是胎牛血清。更优选地，血清来自兔、山羊或绵羊。最优选地，血清来自兔。此类血清是从One Lambda可获得的。

在优选的实施方案中，导致结合的HLA-I抗体被补体饱和的血清浓度为50％至83.33％(v/v)，优选地导致结合的HLA-I抗体被补体饱和的血清浓度为66.66％至83.33％(v/v)，更优选地导致结合的HLA-I抗体被补体饱和的血清浓度为75％至83,33％(v/v)，并且最优选地，导致结合的HLA-I抗体被补体饱和的血清浓度为83.33％(v/v)。

“补体依赖性细胞毒性(CDC)”是IgG和IgM抗体的效应子功能。当它们与表面抗原结合时，经典的补体途径被触发，导致形成膜攻击复合物(MAC)和靶细胞裂解。在本发明的上下文中，通过HLA-I类抗体与SC群上表达的HLAI类分子的结合，通过测量SC群中诱导的细胞裂解，来确定CDC。

在优选的实施方案中，通过测量活的或裂解的细胞选择性的化学发光或荧光染料，或者从裂解的细胞释放的放射性试剂，来确定细胞裂解。可以通过本领域已知的方法，使用不同类型的试剂，将具有完整细胞膜的活细胞与裂解的细胞区分开来。

作为区分活细胞和死细胞的放射性方法，已经建立了铬释放测定法。作为放射性测定的可替代方法，已经开发了荧光染料。例如，可以使用用于DNA结合的不可固定的活力染料，诸如碘化丙啶、DAPI、7-氨基放线菌素D(7-AAD)、TO-PRO-3。当需要固定样品时，可以将来自Invitrogen的胺活性染料或来自eBioscience的可固定活力染料(Fixable Viability Dyes)(eFluor450、eFluor660、eFluor780)或来自Becton Dickinson的紫罗兰可固定染料(BD Horizon VD450)添加到样品中，以在固定前区分活细胞和死细胞。可以获得适于通过细胞功能评估细胞活力的其他染料，诸如需要酯酶活性的染料(例如，来自eBioscience/Invitrogen的钙黄绿素AM)或在线粒体中积累的染料(JC-1、罗丹明123)。

作为其他的可替代方案，已经开发了基于化学发光的测定或基于生物发光的测定(例如甲萘醌催化的H2O2产生)。所有这些都被本发明预期，用于通过测量细胞裂解来确定CDC。在优选的实施方案中，如实施例中进一步描述的，通过在FACS分析中使用7-氨基放线菌素D作为染料来确定CDC活性。

如权利要求中所限定的“EC50值”是在测试样品和对照样品中诱导50％的最大CDC(EC50值)的HLA-I类抗体的浓度。可以目测或利用商购可获得的进行生物数据分析的软件，使用确定的不同HLA-I类抗体浓度的CDC值，进行“确定EC50值”。可以使用能够进行线性回归分析的软件。合适的软件可以是FCS Express第5版(DeNovo软件)。

在优选的实施方案中，如果对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例为约0.1至约1.25，优选地为约0.1至约1.0，更优选地为约0.1至约0.5，特别优选地为约0.1至约0.25，则根据步骤f1)选择用于同种异体疗法的SC群。

在其他优选的实施方案中，如果测试样品的EC50值为约3.5ng/ml至约30ng/ml，优选地约9ng/ml至约25ng/ml，更优选地约10ng/ml至约20ng/ml的HLA-I类抗体，则根据步骤f2)选择用于同种异体疗法的SC群。

可以通过本领域的标准技术(如RNA印迹和RT-qPCR)，基于核酸水平确定“CD46的表达水平”。CD46 mRNA序列从公共数据库是可获得的(NCBI参考序列：NM_002389.4)。可以通过本领域已知的方法制备合适的引物。也可以基于蛋白质水平确定CD46表达水平。合适的方法包括使用标记的HLA-I类抗体分子进行蛋白质印迹和FACS分析。

根据又一方面，提供了适于同种异体疗法，特别地利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗的SC群，其具有以下性质中的任一种：

i)对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5，并且特别优选地小于0.25，其中所述EC50值根据本发明确定；

ii)所述测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml HLA-I类抗体，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml HLA-I类抗体，其中所述EC50值根据本发明确定；或

iii)所述测试样品中CD46的表达与所述对照样品中CD46的表达的比例大于2.0，优选地大于2.5，特别优选地大于3.0，其中所述CD46的表达根据本发明确定。

在优选的实施方案中，通过根据本发明的方法选择SC群。同样优选地，SC群是间充质干细胞(MSC)群，优选地BM-MSC群或ASC群，优选地人BM-MSC或人ASC。

根据又一方面，提供了包含根据本发明的SC群和任选地药学上可接受的载体的药物组合物。

“药学上可接受的载体”在本文中意指本领域已知的不会对SC细胞群的活力或功效产生不利影响的任何药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是含有氨基酸、盐和维生素的细胞培养基。优选地，细胞培养基为RPMI或DMEM，更优选地，细胞培养基为DMEM。细胞培养基中可补充有浓度为约5％(v/v)至约30％(v/v)的人血清白蛋白(HSA)，更优选地，HSA浓度可以为20％(v/v)。在一实施方案中，药学上可接受的载体为具有20％(v/v)HSA的DMEM。

药物组合物可以是注射用混悬液的形式。悬浮液中SC群的浓度可以在1×10⁵至8×10⁶个细胞/ml，优选地1×10⁶至6×10⁶个细胞/ml的范围内。最优选地，浓度为5×10⁶个细胞/ml。药物组合物可以通过注射施用。

根据又一方面，提供了制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：

a)进行根据本发明的方法；

b)用至少一种药学上可接受的载体配制所选择的SC群。

在又一方面，提供根据本发明的SC群，其用于有需要的患者，优选地预先致敏的患者或经历再次治疗的患者的同种异体干细胞疗法中。在更优选的实施方案中，有需要的患者患有选自以下的疾病：瘘、白血病、淋巴瘤、神经退行性疾病、脑和脊髓损伤、心脏病、失明和视力障碍、胰腺β细胞功能丧失、软骨修复、骨关节炎、肌肉骨骼疾病、创伤、不孕症、自身免疫性疾病和炎性疾病(如炎性肠病)，优选地所述疾病为瘘，更优选地所述疾病为复杂肛周瘘。

根据又一方面，提供了同种异体干细胞疗法方法，其包括向有需要的患者，优选地向预先致敏的患者或经历再次治疗的患者施用根据本发明的SC群。患者可能患有上述疾病中的任一种。

在一实施方案中，本发明涉及选择适于同种异体疗法，特别是适于利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗患者的干细胞(SC)群的体外方法，其包括以下步骤：

a)在能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度的存在下培养SC群的样品(测试样品)，并在缺乏IFN-γ的情况下单独培养SC群的样品(对照样品)，其中SC群是ASC群，并且施加48小时的IFN-γ浓度为3ng/ml；

b)在使得HLA-I类抗体与测试样品和对照样品中表达的HLA-I类结合的条件下，使测试样品和对照样品与一系列不同浓度的HLA-I类抗体接触，其中HLA-I类抗体是w6/32，并且其中抗体浓度为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml和50ng/ml；

c)向测试样品和对照样品中加入补体，使得结合的HLA-I类抗体被补体饱和，并诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，其中补体以兔血清的形式加入；

d)通过测量测试样品和对照样品中诱导的细胞裂解，确定所述一系列不同浓度的HLA-I类抗体的CDC；

e)确定在测试样品和对照样品中诱导50％最大CDC(EC50值)的HLA-I类抗体的浓度；以及

f1)如果对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5；特别优选地小于0.25，则选择SC群用于同种异体疗法；或

f2)如果测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml的HLA-I类抗体，则选择SC群用于同种异体疗法。

在一实施方案中，本发明涉及选择适于同种异体疗法，特别是适于利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗患者的干细胞(SC)群的体外方法，其包括以下步骤：

a)在能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度存在下培养SC群的样品(测试样品)，并在缺乏IFN-γ的情况下单独培养SC群样品(对照样品)，其中SC群是ASC群，并且施加48小时的IFN-γ浓度为3ng/ml；

b)在使得HLA-I类抗体与测试样品和对照样品中表达的HLA-I类结合的条件下，使测试样品和对照样品与一系列不同浓度的HLA-I类抗体接触，其中HLA-I类抗体是w6/32，并且其中抗体浓度为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml和50ng/ml；

c)向测试样品和对照样品中加入补体，使得结合的HLA-I类抗体被补体饱和，并诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)，其中补体以兔血清的形式加入；

d)通过测量测试样品和对照样品中诱导的细胞裂解，确定所述一系列的不同浓度的HLA-I类抗体的CDC；

e)确定在测试样品和对照样品中诱导50％最大CDC(EC50值)的HLA-I类抗体的浓度；以及

f1)如果对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例为约0.1至约1.25，优选地为约0.1至约1.0，更优选地为约0.1至约0.5，特别优选地为约0.1至约0.25，则选择SC群用于同种异体疗法；或

f2)如果测试样品的EC50值为约3.5ng/ml至约30ng/ml，优选地约9ng/ml至约25ng/ml，更优选地约10ng/ml至约20ng/ml的HLA-I类抗体，则选择SC群用于同种异体疗法。

本发明的一些实施方案涉及：

1.选择适于同种异体疗法，特别是适于利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗患者的干细胞(SC)群的体外方法，其包括以下步骤：

a)在能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度存在下培养SC群样品(测试样品)，并在缺乏IFN-γ的情况下单独培养SC群样品(对照样品)；

b)在使得HLA-I类抗体与测试样品和对照样品中表达的HLA-I类结合的条件下，使测试样品和对照样品与一系列不同浓度的HLA-I类抗体接触；

c)向测试样品和对照样品中加入补体，使得结合的HLA-I类抗体被补体饱和，并诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)；

d)通过测量测试样品和对照样品中诱导的细胞裂解，确定所述一系列不同浓度的HLA-I类抗体的CDC；

e)确定在测试样品和对照样品中诱导50％最大CDC(EC50值)的HLA-I类抗体的浓度；和

f1)如果对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5；特别优选地小于0.25，则选择SC群用于同种异体疗法；或

f2)如果测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml的HLA-I类抗体，则选择SC群用于同种异体疗法。

2.如第1项所述的体外方法，其中所述方法还包括以下步骤：确定所述测试样品和所述对照样品中CD46的表达水平；以及如果所述测试样品中CD46的表达与所述对照样品中CD46的表达的比例大于2.0，优选地大于2.5，特别优选地大于3.0，则选择所述SC群用于同种异体疗法。

3.如第1或2项所述的体外方法，其中所述SC群是间充质干细胞(MSC)群，优选地人MSC群。

4.如第3项所述的体外方法，其中所述间充质干细胞群是骨髓来源的干细胞(BM-MSC)群。

5.如第3项所述的体外方法，其中所述间充质干细胞群是脂肪组织来源的干细胞(ASC)群。

6.如第5项所述的体外方法，其中所述ASC群表达CD29、CD73、CD90和/或CD105。

7.如第1至6项中任一项所述的体外方法，其中能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度为约0.5至约30ng/ml，优选地为约1至约15ng/ml，更优选地为约2至约4ng/ml。

8.如第7项所述的体外方法，其中能够在所述SC群中诱导最大HLA-I类表达的IFN-γ浓度为3ng IFN-γ/ml，优选地施加48小时的时间段。

9.如第1至8项中任一项所述的体外方法，其中所述HLAI类抗体与HLA-A、HLA-B和/或HLA-C特异性地结合。

10.如第9项所述的体外方法，其中所述HLAI类抗体与HLA-A、HLA-B和HLA-C特异性地结合，优选地所述HLAI类抗体是鼠单克隆抗体。

11.如第9或10项所述的体外方法，其中所述HLA-I类抗体与由能从ATCC(名称：HB-95)或ECACC(编号：84112003)获得的杂交瘤克隆w6/32产生的抗体对HLA-A具有基本上相同的结合亲和力。

12.如第9至11项中任一项所述的体外方法，其中所述抗体由能从ATCC(名称：HB-95)或ECACC(编号：84112003)获得的杂交瘤克隆w6/32产生。

13.如第1至12项中任一项所述的体外方法，其中使用了在约1至约50ng/ml范围内的两种或三种不同浓度的HLA-I类抗体，优选地使用了在约1至约50ng/ml范围内的四种或五种不同浓度的HLA-I类抗体，更优选地使用了在约1至约50ng/ml范围内的六种或七种不同浓度的HLA-I类抗体，并且甚至更优选地使用了在约1至约50ng/ml范围内的八种或九种不同浓度的HLA-I类抗体。

14.如第13项所述的体外方法，其中HLA-I类抗体的所述范围的不同浓度为1ng/ml、3ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml和50ng/ml。

15.如第1至14项中任一项所述的体外方法，其中权利要求1的步骤(c)中所用的补体来自血清。

16.如权利要求15所述的体外方法，其中所述血清未经热处理。

17.如权利要求15或16所述的体外方法，其中所述血清来自兔、山羊或绵羊，优选地来自兔。

18.如权利要求15至17中任一项所述的体外方法，其中所述血清浓度为50％至83.33％(v/v)，优选地所述血清浓度为66.66％至83.33％(v/v)。

19.如第1至18项中任一项所述的体外方法，其中通过测量活的或裂解的细胞的选择性化学发光或荧光染料，或者从裂解的细胞释放的放射性试剂来确定细胞裂解。

20.适于同种异体疗法，特别是适于利用同种异体疗法治疗预先致敏的患者或再次治疗的SC群，其具有以下性质中的任一种：

i)对照样品的EC50值与测试样品的EC50值的比例小于1.25，优选地小于1.0，更优选地小于0.5，并且特别优选地小于0.25，其中所述EC50值按第1项中所示确定；

ii)所述测试样品的EC50值为至少3.5ng/ml HLA-I类抗体，优选地至少9ng/ml，更优选地至少15ng/ml，特别优选地至少20ng/ml HLA-I类抗体，其中所述EC50值按第1项中所示确定；和/或

iii)所述测试样品中CD46的表达与所述对照样品中CD46的表达的比例大于2.0，优选地大于2.5，特别优选地大于3.0，其中所述CD46表达按第2相中所示确定。

21.如第20项所述的SC群，其中通过第1-19项中任一项所述的方法选择SC群。

22.如第21或22项所述的SC群，其中所述SC群是间充质干细胞(MSC)群，优选地BM-MSC群或ASC群，优选地人BM-MSC或人ASC。

23.药物组合物，其包含第20至22项中任一项所述的SC群和任选地药学上可接受的载体。

24.制备药物组合物的方法，其包括以下步骤：

a)进行第1-19项中任一项所述的方法；

b)用至少一种药学上可接受的载体配制所选择的SC群。

25.如第20至22项中任一项所述的SC群，其用于有需要的患者，优选地预先致敏的患者或经历再次治疗的患者的同种异体干细胞疗法中。

26.如第25项所述用途的SC群，其中所述有需要的患者患有选自以下的疾病：瘘、白血病、淋巴瘤、神经退行性疾病、脑和脊髓损伤、心脏病、失明和视力障碍、胰腺β细胞功能丧失、软骨修复、骨关节炎、肌肉骨骼疾病、创伤、不孕症、自身免疫性疾病和炎性疾病(如炎性肠病)，优选地所述疾病是瘘，更优选地所述疾病是复杂肛周瘘。

27.同种异体干细胞疗法，其包括向有需要的患者，优选地向预先致敏的患者或经历再次治疗的患者施用第20至22项中任一项所述的SC群。

28.如第27项所述的同种异体干细胞疗法，其中所述有需要的患者患有选自以下的疾病：白血病、淋巴瘤、神经退行性疾病、脑和脊髓损伤、心脏病、失明和视力障碍、胰腺β细胞功能丧失、软骨修复、骨关节炎、肌肉骨骼疾病、创伤、不孕症、自身免疫性疾病和炎性疾病(如炎性肠病)，优选地所述疾病是瘘，更优选地所述疾病是复杂肛周瘘。

在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例仅用于说明本发明的具体实施方案的目的，并且也不解释为以任何方式限制本发明的范围。

实施例

材料和方法

监测ADMIRE CD1中的DSA生成

患者

来自随机、双盲、平行组、安慰剂对照研究ADMIRE CD1(Panes等人(2016),Lancet 388,1281-1290)的123名患者的亚组。简而言之，所有人都是患有CD和难治性引流、复杂肛周瘘的成年患者(≥18岁)，并且被选择接受单次病灶内注射1.2亿个ASC或24mL盐水溶液(安慰剂)。共有60名和63名患者分别接受了安慰剂或ASC输注，其中105名(58名ASC，47名安慰剂)在施用后成功随访了长达52周。

ASC供体

按照其他地方描述的对来自健康供体的人脂肪组织抽吸物进行处理(Lopez-Santalla等人，2015,上文引用的)。本研究使用了来自七个不同供体的ASC；DonA是用于ADMIRE CD1临床试验的供体。DonA和DonB来自ADMIRE CD2临床试验(NCT03279081)(其利用了两个不同的供体)。另外，分析了来自供体DonC、DonD、DonE、DonF和DonG的ASC。所有ASC供体均符合国际脂肪治疗联合会(International Federation for Adipose Therapeutics)和国际细胞治疗学会(International Society for Cellular Therapy)设定的特性和纯度标准(Bourin等人(2013),Cytotherapy(2013)15(6):641-648)。ASC培养已在其他地方进行了描述(DelaRosa等人2009,上文引用的)。

抗HLA检测

通过离心具有乙二胺四乙酸的外周血管(spry涂覆的K2EDTA管，BD)，获得在基线和安慰剂或ASC施用后12和52周从所有患者采集的血浆样品。根据制造商的说明，使用LabscreenMixed^TM试剂盒(One Lambda Inc.Canoga Park,CA,US)在Luminex平台中检测抗HLA抗体。信号>800个单位的荧光强度(MFI)中值的所有样品都被认为是阳性的，并使用Labscreen单一抗原^TM试剂盒(Labscreen Single Antigen^TMkit，One Lambda Inc.Canoga Park,CA,US)确定了HLA抗体的特异性。所有信号都根据Quantiplex^TM珠荧光进行了归一化，其中>20,000标准荧光强度单位被认为是相关的。定性地，HLA抗体滴度被限定为所得的来自Labscreen混合试剂盒中包括的HLAI类分子的所有决定珠的MFI总和。这允许比较产生的体液应答水平，而独立于所呈现的抗HLA特异性。

HLA分型

从来自使用chemagic DNA血液250试剂盒(chemagic DNA Blood250 kit,PerkinElmer)的外周血样品获得的DNA样品确定每名患者中表达的HLA等位基因的分配。在经由检查A260/280吸光度比检测纯度后，根据制造商的说明，使用HLA的基因座A、B和C特异性的SSO测定(One Lambda,Canoga Park,CA)进行测试所有样品DNA浓度为20ng/μL或更高。使用算法HLA匹配器将患者和供体ASC之间不相容性的特性被限定为非共有的、独特的多态性残基链，在下文中被称为eplets(Duquesnoy(2002),Hum Immunol 63,339-352)。

与重组抗HLA抗体(rHLA)流式细胞术交叉配型(FCXM)结合的标准化标准曲线

在基础条件下确定来自DonA和DonB(I类)以及DonA(II类)的ASC中的I类和II类HLA表达水平，并使用干扰素IFNγ将ASC预激活(3ng/mL，48小时)。将50,000个ASC用递增浓度(对于克隆W6/32为0至15ng/mL，并且对于克隆L243为0至3ng/mL)的PE(藻红蛋白)标记的抗人I类HLA Ab(克隆W6/32)和PerCP(多甲藻素-叶绿素-蛋白)标记的抗人II类HLA Ab(克隆L243)(Becton Dickinson,Franklin Lakes,新泽西州,US)染色，并在黑暗中于室温下孵育30分钟。

血浆样品的FCXM结合强度

测试了来自施用了先前在56℃下去补体30分钟并用磁激活细胞分选(MACS)缓冲液洗涤一次的ASC的所有患者的治疗前第12周(W12)和第52周(W52)血浆样品。将50μL去补体血浆与50,000个ASC(终体积为100μL)一起在室温下孵育30分钟。将FACS-Fortessa X20细胞分析仪用于通过每个样品在P1门(总ASC群)中获取10,000个事件来确定HLA-I类和HLA-II类的MFI。使用BD FacsDiva^TM软件(BD)进行分析。

血浆样品的CDC测定

对于细胞毒性测量，将作为补体抗人I类HLA(CABC-1D,One LambdaCanoga Park,CA,US)来源的250μL兔血清加入细胞中1小时。然后将细胞洗涤两次并在20分钟内与20μL FITC抗人IgG一起孵育。最后，在洗涤后，在加入5μL 7-氨基放线菌素D(7-AAD)活力染料后，通过在LSR Fortessa流式细胞仪(BD)中采集来确定细胞毒性。

经由FACS进行mCRP定量

将ASC在正常或3ng/mL IFNγ条件下培养48小时。然后对ASC进行胰蛋白酶消化并计数。将总共50,000个细胞重悬于100μL MACS缓冲液中。对于染色，我们使用了CD46(分类号564253,BD)、CD55(MCA1614PE,Serotec)和CD59(BRA-10G,Novus Biologicals)Ab及其分别的同种型作为对照(来自BD的IgG2a-APC、IgG1-PE和IgG2b-PE)。冰孵育20分钟后，将ASC用MACS洗涤，并在1,500rpm下离心4分钟。最后，将ASC重悬于100μL MACS中，转移到细胞计数管中，并在LSR Fortessa流式细胞仪(BD)中采集，并使用BD FacsDiva^TM(BD)进行分析。

CD46敲除细胞系的产生

使用以下公共基因组工具设计靶向CD46外显子3的向导RNA：www.genome.ucsc.edu和www.www.ncbi.nlm.nih.gov/gene。对于CRISPR RNA(crRNA)递送，根据制造商的说明使用CRISPR-Cas9系统(IDT Integrated DNA Technologies)。简而言之，将ASC解冻并放置过夜。在此之后，使用Lipofectamine^TMRNAiMAX(Thermo-Fisher)制备和递送核糖核蛋白复合物混合物。将crRNA和反式激活crRNA(tracrRNA)在无菌微量离心管内以等摩尔浓度混合，最终寡聚物双链工作浓度为1μM。将混合物在室温下孵育20分钟。在此之后，在加入ASC悬浮液之前将转染复合物加入培养板中。24小时后，更换ASC培养基并在显微镜下使用荧光tracrRNA-ATTO⁵⁵⁰检查脂质转染功效。

结果

ADMIRE CD1治疗患者中长期的DSA存在

在基线和治疗施用后12周，从Panes,J.等人(2016),Lancet 388,1281-1290报道的ADMIRE CD1试验的123名患者中收集了血液样品，其中63名ASC和60名安慰剂。在治疗施用后52周，105名患者(58名ASC和47名安慰剂)提供了血液样品(图1A)。使用Luminex技术通过固相测定进行的分析揭示，23名患者在治疗后12周产生了DSA。正如预期的那样，接受安慰剂的患者没有产生具有DSA的样品(图1A，右图)。另外，结果表明16％(10/63)的ASC患者和15％(9/60)的安慰剂患者在基线时被预先致敏。在53名初治患者中，17名在W12产生了ASC DSA，并且10名预先致敏的患者中有6名在W12产生了ASC DSA(图1A，左图)。在所有情况下，仅针对HLA I类分子检测到DSA的特异性，而未针对HLA II类分子检测到DSA的特异性。长期随访揭示，在W52没有检测到另外的DSA产生；30％(7/23)的患者此时已清除DSA。有趣的是，在W12产生DSA的初治患者显示35％的清除率(6/17)，而在W12产生DSA的预先致敏患者在W52具有17％的清除率(1/6)。有趣的是，预先致敏的患者在W52时容易出现持续的体液应答。相反，初治的产生DSA的患者显示出返回到其基础DSA水平的趋势。总而言之，上述观察表明这些ADMIRE CD1患者对ASC的应答遵循初级免疫应答动力学。

如方法(抗HLA检测部分)中所述，对给定样品呈阳性的DSA水平是使用单一抗原结果的最严格的阈值，即根据分类值(是否超过给定截止点)来选择的。然而，相对于存在于纯化的HLA包被的珠(技术中使用的微球)上的总抗原的结合的抗体量，也可以被量化为MFI HLAI类LSM(最小二乘法平均值)微球的总和。计算了测量整个时间(治疗前和治疗后12–52周)血浆DSA滴度的时程曲线；说明响应动力学并确定降低DSA水平的可能性(图1B)。基于DSA的存在，将患者分为以下几组：未产生DSA的初始患者(使用其基线水平进行比较)；在同种异体ASC施用后产生DSA的初始患者；具有所施用的供体ASC的特异性的预先致敏的患者；和对所使用的供体细胞没有特异性的预先致敏的患者。正如预期的那样，未产生DSA的初始患者在整个研究过程中没有展现出HLAI类抗体(图1B，左上图)。相比之下，产生DSA的初始患者展现出增加的抗体滴度。此外，MFI从基线到W12的修改在所有患者中并不相似，事实上，在某些患者中，应答似乎比其他人更强；患者92(Pat92)是同种异体反应性最强的(图1B，圆圈)。然而，很明显，在W52，MFI在所有情况下都降低，这与经典初级应答的抗体特征一致，其中在加强效应后抗体滴度的增加降低。在与ASC共有特异性的预先致敏患者组中，发现了与第二或记忆应答一致的特征；抗体滴度在W12和W52均超过了基线水平(图1B，左下图)。这些患者具有增强应答的特征，在这种情况下，倾向于在持续时间和强度方面受到限制。有趣的是，在初治患者组和在基线时未显示ASC特异性的预先致敏患者中也观察到类似的动力学(图1B，右下图)，表明无应答特征。

检查了供体–患者HLA匹配等级与产生DSA的可能性之间的可能联系。其目的是通过鉴定在患者中不存在的在ASC供体HLA类型(eplets)中存在的多态性残基来鉴定同种异体识别的前体。将每名患者的eplet与ASC供体HLA等位基因比对以进行错配量化。在本研究中，同种异体致敏的出现主要针对HLA I类；因此，它专注于表征HLAI类的基因座A和B。将eplets的总数与患者对产生DSA的易感性相关联(图1C)。线性回归分析显示，在eplets错配与施用后12周的患者DSA产生之间没有显著相关性。

抗HLA抗体与ASC的体外结合

尽管在不同组织中发现的MSC具有共同的特征，其包括免疫调节性质或身份标志物，但在体内模型中已经报道了不同的免疫原性应答。使用FACS分析来表征ASC的免疫原性应答，旨在量化ASC上HLA-I类和HLA-II类分子的表达及其与患者的抗HLA Ab结合的能力(图2A)。将ASC与IFNγ一起孵育、预刺激或不刺激，对染色后用递增浓度的荧光标记的HLA-I类(第6周和第32周)或HLA-II类(L243)重组Ab和MFI进行定量。正如预期的那样，ASC在基础水平上表达了HLA-I类，在IFNγ刺激后表现出强烈的过表达(图2A)。相反，HLA-II类水平在基线时为阴性，在IFNγ刺激后有适度增加。

血浆样品Pat92(图1B，圆圈)在治疗后具有最大的DSA滴度。在基础条件下，未检测到DSA结合强度或补体依赖性毒性测定中的显著增加。然而，当用IFNγ刺激ASC时，观察到阳性对照(超免疫样品库，HI库)和Pat92样品中ASC结合强度的显著上调(图2B，左下图)。结合的增加伴随着Pat92中高百分比的细胞毒性杀伤(34％)(图2B，浅灰色)。该百分比显著高于测试的其他22名患者中量化的杀伤百分比(范围为3.3％–9.3％)，证实了Pat92是最具同种异体反应性的样品。有趣的是，Pat92是与施用的ASC显示最高错配水平的一个样品，但它在W52确实展现出抗体清除。了解同种异体ASC疗法的安全性和免疫原性毒性将有助于评估再治疗的可行性。另外，这将有助于确定它们在预先致敏的患者和/或在具有恶化的从头DSA产生的患者(例如Pat92)中的潜在影响。

血浆DSA结合诱导体外中度杀伤的ASC

上面的结果表明，在63名ADMIRE CD1患者的队列中，10名具有预先存在的HLA-I类Ab，且17名产生了从头DSA。还表明ASC表达HLA-I类抗原并结合rHLA-I类Ab；然而，尚不清楚患者的DSA是否具有结合并随后诱导ASC的细胞毒性杀伤的能力。为了测试这一点，旨在量化预先致敏和从头DSA阳性(DSA )组在体外结合HLA I类抗原至ASC的不同亲合力。除了原始供体DonA(在ADMIRE CD1试验中施用)之外，还包括另一种供体DonB，用作DSA特异性的对照，因为它未施用至患者(图3A)。基线和W12样品经由FCXM，并测量了HLA-I与在基础条件下培养的或用IFNγ预刺激的ASC的结合强度(图3A，上图)。在基础条件下，未在来自供体ASC中预先致敏或从头DSA 患者的样品中观察到高结合能力。当用IFNγ预刺激ASC时，在第0周(W0)和第12周(W12)访视时观察到预先致敏的患者具有高且与仅DonA相当的结合亲和力(图3A，上图)。因此，基础条件以及ASC供体的膜中低HLA-I抗原表达，与DonA和DonB两者中的低结合亲和力相关(图3A，下图)。值得注意的是，在来源于W12的DonA的患者样品相对于从头DSA 样品中的基线的比较中观察到结合亲和力的显著增加(图3A，下图)。上述数据表明，基础ASC中HLA的浓度不足以显示体外DSA的显著结合。另外，大多数患者中DSA的浓度似乎不足以显示出显著的结合强度，无论是在未激活还是激活的ASC中。这些结果与来自器官移植研究的实体移植流式细胞术交叉配型观察结果一致，其中只有具有高DSA水平且与供体共有免疫特异性的患者才会产生显著的HLA-I类结合。

接下来旨在了解预先存在的HLA-I抗体和同种异体施用后产生的DSA是否能够固定补体，从而触发体外CDC。经由流式细胞术分析(FCtox)的CDC测定得到优化，其中7-AAD掺入被确立为细胞死亡读出。在基础条件下或在IFNγ刺激之前在兔C3补体存在下，孵育来自用DonA和DonB ASC预先致敏和从头DSA 患者(来自基线和W12)的血浆样品。在预先致敏的患者队列中，W12样品在基础和IFNγ条件下均在DonB(0–5％7-ADD 细胞)中诱导了适度的细胞毒性杀伤。如在DonA ASC中所见，相同样品的孵育在基础(两名患者)和IFNγ(三名患者)条件下诱导了更高的细胞毒性杀伤(图3B)。从头DSA W12样品还能够在基础条件下固定补体并诱导细胞毒性杀伤。正如预期的那样，当用IFNγ刺激时，仅在DonAASC中获得更高百分比的细胞死亡(图3B)。这些数据表明，预先存在的HLA-I类Ab和DSA能够结合ASC并特异性地在DonAASC中诱导适度的CDC。有趣的是，尽管DonB没有诱导显著的细胞毒性百分比，但是无论是在预先致敏还是从头DSA 队列中，都观察到了W12中相对于基线的细胞死亡增加的趋势。对此的一种可能解释可能是本研究中使用的两个供体之间存在共有的HLA多态性等位基因。进行了HLA分型，且发现DonB与DonA共有一个共同的等位基因。

纯化来自DonA和DonB的DNA并通过测定进行测试，用于HLA等位基因表征。粗体显示了DonA和DonB共有的HLA-A等位基因(参见表1)。

表1：

这种共有的HLA等位基因可能是DonB中W12样品中细胞毒性水平增加趋势的原因。

ASC中mCRP的高表达

为了了解DSA对ASC的适度杀伤，旨在确定可能使ASC能够应对和/或逃避细胞毒性杀伤的补体抑制策略。补体信号传导抑制的一种经典机制是诱导mCRP CD46、CD55和CD59(Gancz和Fishelson,2009；Ricklin等人,2010；Tegla等人，2011)。虽然一些作者已经表明MSC表达低水平的CD46和CD55，以及高水平的CD59，但其他人认为MSC表达中等水平的所有mCRP。为了解决这一争议，分析了一组用IFNγ刺激或未刺激的ASC中的CD46、CD55和CD59表达水平，并将表达水平与商业BM-MSC进行了比较(图4A)。据观察，与BM-MSC相比，ASC中CD46、CD55和CD59的基础水平更高。为了重复这个生理相关的情景，在IFNγ(促炎环境)的存在下测试了mCRP水平；IFNγ为ASC免疫调节应答的关键介导物。未观察到BM-MSC中mCRP的显著调节，而ASC似乎在IFNγ刺激后有效地诱导了mCRP。CD46诱导在ASC中特别显著，与BM-MSC相比增加了约2.14倍。上述结果表明ASC在基础条件下强烈表达mCRP，并且在IFNγ的存在下表达进一步增强。这将表明mCRP在CDC的负调节中的突出作用，并暗示ASC中的细胞保护机制以应对DSA诱导的细胞毒性。这可以解释DSA施加的中等杀伤水平。

虽然不同ASC供体中mCRP的表达模式具有可比性，但一些供体展现出特定mCRP的特定表达(图4B)。具体地，与其他供体相比，DonC展现出更高的CD46和CD55水平；DonE和DonF优先过表达CD55。进一步研究了mCRP的差异表达是否能够影响对CDC的不同敏感性。为了回答这个问题，研究了HLA-I抗原表达的动力学及其在这组ASC供体中的结合亲和力。为了测试这一点，ASC供体接受了增加浓度的rHLA-I类W6/32。接下来，经由FACS测量它们的结合亲和力(图4C)。注意到基础条件下供体之间的不同结合亲和力(即，当利用10ng/mL的W6/32将DonC与DonG进行比较时，差异为12倍)。在IFNγ刺激后，如通过增加的W6/32结合所示的，在ASC供体中诱导了HLA-I抗原(图4C)。再次地，观察到供体之间不同的结合亲和力(当比较DonB和DonG时，10ng/mL下的差异为6.25倍)。同时，测试了不同ASC供体对CDC测定的敏感性。在基础条件下，DonE在最高W6/32浓度下展现出～25％的细胞死亡，在其余供体中，这约为～15％，除了DonD和DonG展现出较低的百分比外(图4C)。正如预测的那样，在IFNγ刺激后，所有ASC供体的CDC敏感性水平均显著增加，但在对CDC介导的细胞死亡仍然具有相对抗性的DonB和DonC中的程度较小(图4C)。

接下来，旨在确定高W/32结合亲和力是否与增强的CDC敏感性相关。为了进行这种相关性分析，将W6/32浓度设置为10ng/mL，因为这是驱动曲线过渡阶段(指数之后和平台之前)的Ab量。在基础条件和IFNγ刺激情形下未观察到显著的相关性(图6A)。值得注意的是，我们确定了一组ASC供体，尽管表达了相对较低的W6/32Ab MFI水平(低结合)，但它们对CDC展现出很高的敏感性。这表明W6/32Ab结合与对CDC的敏感性之间没有绝对的相关性。为了确定三种mCRP中的哪一种是对ASC的CDC抑制的贡献者，我们将在基础和IFNγ条件下达到10ng/mL的W6/32的细胞死亡水平与MFI表达水平相关联(图6B)。在基础条件下，未观察到与任何测试的mCRP分子的正相关。然而，注意到在IFNγ刺激后，较低的CD46和CD55水平与较高的细胞死亡水平显著相关。最后，CD46斜率显著性略高于CD55。

CD46耗尽增加了体外ASC的CDC敏感性

与CD55或CD59相比，IFNγ刺激后CD46的强烈诱导，以及细胞毒性相关性的更高显著性连同CD46相对于CD55降低的供体间变异性，促使我们对CD46及其在ASC中的CDC敏感性中的潜在影响进行深入分析。使用公共基因组浏览器确定了敲低CD46的最相关gRNA序列(ncbi.nlm.nih.gov/gene and crispr.mit.edu)。最优的向导RNA(gRNA)序列是基于两个参数选择的：高特异性和低脱靶得分。选择靶向外显子3的两个最佳crRNA(crRNA 1和crRNA2)用于功效筛选。在显微镜下检查crRNA:tracrRNA-ATTO⁵⁵⁰:Cas9复合物的递送。据观察，在脂转染24小时后，绝大多数ASC已掺入与高Cas9介导的双链断裂事件相关的核糖核蛋白复合物中(图6C)。为了检查CRISPR介导的敲低功效，在存在或缺乏IFNγ下培养ASC，并经由FACS分析CD46表达。在正常和IFNγ条件下crRNA1的功效都与crRNA2相当，因此我们选择crRNA1用于产生ASC-CD46^KO克隆(图6D)。

在确认敲低特异性后，选择一个具有低CDC敏感性的供体以测试CD46的选择性耗尽是否能够使其对细胞毒性杀伤敏感。选择DonB并在基础和IFNγ条件下进行W6/32介导的细胞毒性测定(图5A)。CD46敲低在基础条件下诱导细胞毒性杀伤的适度增加(图5A，左图)，这可能是由于低HLA-I结合和随后的补体固定。在IFNγ刺激后，观察到亲本ASC中细胞毒性杀伤百分比的显著提高，这在CD46^KO ASC中进一步增强(图5A，右图)。在10ng/mL W6/32的生理剂量下，在亲本ASC中观察到～50％7-AAD阳性细胞，并且CD46敲低将杀伤百分比增加至高达～95％，这表明CD46在防止细胞毒性杀伤，至少在DonB中发挥重要功能。

为了测试CD46细胞毒性抑制功能是否在其他ASC供体中有效，在七名供体的小组中进行了细胞毒性分析，并绘制了基础条件(图5B，左图)和ASC IFNγ刺激之前(图5B，右图)的平均曲线。在两种测试条件下，与亲本对照相比，CD46^KO ASC供体对CDC展现出增强的敏感性。半最大有效浓度(EC50)曲线向左移动意味着需要降低W6/32Ab的浓度以诱导CDC，这与对CDC的敏感性增强有关。接下来，为了量化曲线的变化，我们计算了W6/32Ab的EC50(图5C)。

下表2显示了在基础和IFNγ条件下7个亲本和相应的CD46^KO ASC的W6/32Ab的半最大有效浓度(ng/mL)。在第4和第7列中，计算了倍数变化差异(CD46^KO EC50/亲本EC50)。

在基础条件下，CD46^KO供体展现出与亲本供体相比降低的EC50，这表明对W6/32更高的敏感性(图5C，第四列)。在IFNγ条件下观察到类似的效应(图5C，第七列)，这证实了CD46表达在体外赋予CDC对ASC的抗性。该数据证实了CD46介导CDC，并且其在ASC中的耗尽与增强的CDC敏感性相关。