用于检测甘丙肽分泌细胞的引物、探针以及试剂盒的制作方法

1.本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种用于检测甘丙肽分泌细胞的引物、探针以及试剂盒。


背景技术：

2.原位杂交技术(in situ hybridization，ish)是分子生物学、组织化学及细胞生物学相结合而产生的一门技术，其基本原理是利用核酸分子单链之间互补的碱基序列，将外源核酸片段(即探针)与待测核酸互补配对，形成核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
3.核糖核酸(rna)原位核酸杂交，是指运用探针检测细胞内rna表达的一种原位杂交技术，其基本原理是：在细胞结构保持不变的条件下，用带有标记的探针，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞中相应的rna片段相结合，形成杂交体，经显色反应后在光学显微镜下观察其细胞内相应的rna分子。rna原位杂交技术应用领域广泛，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mrna(信使rna)表达方面已展示出了重要作用。
4.脑科学的研究越来越受到重视。在脑科学的研究中发现，神经元具有异质性，即大脑中的神经元具有不同的亚型和功能，对神经元进行结构和功能上的划分，并研究不同类型神经元的功能，已经成为神经科学研究的主流和趋势。甘丙肽广泛存在于神经系统中，在脑内其主要分布于弓状核、下丘脑、蓝斑和视前叶中区等区域。研究发现，甘丙肽与摄食、学习记忆、母性行为等有关系，在阿尔茨海默病和癌症等疾病的中也扮演一定的作用，定位甘丙肽分泌细胞，有助于我们研究其功能，对神经科学的基础研究和相关疾病的机制探究都有重要的作用。
5.目前针对甘丙肽分泌细胞的定位主要采用石蜡切片技术，通过抗原抗体的识别效应检测已分泌的甘丙肽分子，再通过显色反应使该抗原
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抗体复合物可在显微镜下观察。然而石蜡切片的操作步骤复杂，需要脱蜡入水、抗原修复等过程，制片程序及环节繁多，检测操作时间长。冰冻切片技术操作简单，与石蜡切片相比，能节省很多时间，而且对抗原的保真性更好，被更多的应用于手术中的快速病理诊断和基础实验研究之中，然而目前市面上用于检测甘丙肽的抗体，因为抗体
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抗原识别效率的问题，并不适合用在冰冻组织切片上。


技术实现要素：

6.鉴于现有技术存在的不足，本发明提供一种用于检测甘丙肽分泌细胞的引物、探针以及试剂盒，以解决如何在冰冻切片的组织上检测甘丙肽分泌细胞的问题。
7.为实现上述发明目的，本发明提供了一种用于检测甘丙肽分泌细胞的引物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物如序列表中seq id no.1所示，所述反向引物如序列表中seq id no.2所示。
8.为实现上述发明目的，本发明的另一方面是提供一种用于检测甘丙肽分泌细胞的探针，其中，所述探针为采用如seq id no.1的正向引物和如seq id no.2的反向引物经聚
合酶链式反应扩增合成并以地高辛进行标记的探针，所述探针如序列表中seq id no.3所示。
9.为实现上述发明目的，本发明的另一方面是提供一种用于检测甘丙肽分泌细胞的试剂盒，其包括如上所述的用于检测甘丙肽分泌细胞的探针。
10.进一步地，所述试剂盒还包括：
11.溶液a：0.05％吐温
‑
20
‑
磷酸盐缓冲液；
12.溶液b：0.3％过氧化氢
‑
磷酸盐缓冲液；
13.溶液c：包含1m tris、0.5m edta、1μg/ml蛋白酶k和水；
14.溶液d：包含15mg酵母rna、7.4ml水、12.5ml20
×
ssc缓冲液、25ml甲酰胺、5mldenhardt's溶液(50
×
)、100μldtt、0.05ml鲱鱼精dna；
15.溶液e：2
×
ssc缓冲液；
16.溶液f：包含0.1m三乙醇胺和0.25％乙酸酐的酸化液；
17.抗地高辛
‑
过氧化物酶抗体。
18.优选地，所述探针的浓度为180mg/ml～220mg/ml。
19.优选地，所述探针的浓度为200mg/ml。
20.本发明实施例提供的用于检测甘丙肽分泌细胞的引物、探针以及试剂盒，通过设计特定序列的核酸引物和探针，利用该探针基于rna原位杂交的方法，能够检测细胞中与分泌甘丙肽相关的mrna的表达，从而能够在冰冻切片的组织上快速检测和定位甘丙肽分泌细胞，为找寻甘丙肽分泌细胞及其功能研究提供了更高效的方法，解决了由于甘丙肽在冰冻切片中组织抗原保护差且容易降解而导致一般的抗体难以识别的问题。
附图说明
21.图1是本发明实施例中甘丙肽分泌细胞检测结果的荧光显微镜图示。
具体实施方式
22.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在附图中进行了例示。附图中所示和根据附图描述的本发明的实施方式仅仅是示例性的，并且本发明并不限于这些实施方式。
23.在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明，在附图中仅仅示出了与根据本发明的方案密切相关的结构和/或处理步骤，而省略了与本发明关系不大的其他细节。
24.本发明实施例首先提供了一种用于检测甘丙肽分泌细胞的引物，所述引物包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物和所述反向引物的序列如下：
25.正向引物：atcctgcactgaccagcc，如序列表中seq id no.1所示；
26.反向引物：ttggcttgaggagttggc，如序列表中seq id no.2所示。
27.本发明实施例还提供了一种用于检测甘丙肽分泌细胞的探针，其中，所述探针为采用如seq id no.1的正向引物和如seq id no.2的反向引物经聚合酶链式反应(pcr)扩增合成并以地高辛进行标记的探针，所述探针的序列如下：
[0028][0028]28.如序列表中seq id no.3所示。
[0029]
需要说明的是，如上实施例所述的引物和探针，利用引物和探针设计软件，根据引物和探针的设计原理进行设计并合成，合成过程所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
[0030]
本发明实施例还提供一种用于检测甘丙肽分泌细胞的试剂盒，其包括如上所述的用于检测甘丙肽分泌细胞的探针，如序列表中seq id no.3所示。进一步地，所述试剂盒还包括：
[0031]
溶液a：0.05％(体积份数)吐温
‑
20
‑
磷酸盐缓冲液。
[0032]
溶液b：0.3％(体积份数)过氧化氢
‑
磷酸盐缓冲液。
[0033]
溶液c：包含1m tris(三羟甲基氨基甲烷)、0.5m edta(乙二胺四乙酸)、1μg/ml蛋白酶k和水。具体地，将tris、edta和蛋白酶k溶于水中，配制获得符合以上各个溶质浓度要求的溶液c。
[0034]
溶液d：包含15mg酵母rna、7.4ml水、12.5ml20
×
ssc缓冲液、25ml甲酰胺、5mldenhardt's溶液(50
×
)、100μldtt(二硫苏糖醇)和0.05ml鲱鱼精dna(浓度为11mg/ml)。具体地，将以上用量的各个组份相互混合溶解，于100℃煮沸5分钟，冷却后在
‑
80℃保存。
[0035]
溶液e：2
×
ssc缓冲液。
[0036]
溶液f：包含0.1m三乙醇胺和0.25％乙酸酐的酸化液。
[0037]
更进一步地，所述试剂盒还包括抗地高辛
‑
过氧化物酶抗体。
[0038]
在优选的方案中，所述探针的浓度为180mg/ml～220mg/ml。更为优选的，所述探针的浓度为200mg/ml。
[0039]
本发明实施例还提供了采用如上所述的用于检测甘丙肽分泌细胞的试剂盒对甘丙肽进行检测的方法，该方法包括以下步骤：
[0040]
(1)、利用引物和探针设计软件，根据引物和探针的设计原理进行设计并合成如序列表中seq id no.1所示的正向引物、如序列表中seq id no.2所示的反向引物以及如序列表中seq id no.3所示的探针。其中，合成过程所用的材料、试剂等，均从商业途径得到。
[0041]
(2)、配制试剂盒中所需的各类试剂溶液，具体是如前所述的溶液a至溶液f，并配备抗地高辛
‑
过氧化物酶抗体。
[0042]
(3)、使用含4％多聚甲醛磷酸缓冲液灌注取相应的组织，放于灌注液中后固定12
小时，再放入含30％蔗糖磷酸缓冲液中脱水36小时。
[0043]
(4)、将步骤(3)处理后的组织浸入组织包埋液中，
‑
20℃冰冻至完全凝固。使用冰冻切片机将组织切为20μm～30μm的切片，将切片贴于正离子吸附载玻片上，将组织贴片放置于
‑
80℃冰冻4小时。
[0044]
(5)、将步骤(4)处理后的组织贴片取出，放置于67℃的烘箱中烘烤20min以上至水分蒸发完全，然后浸泡在溶液a中3min，再使用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤3min，使组织细胞的细胞膜出现小孔可供后续试剂通过。
[0045]
(6)、将步骤(5)处理后的组织贴片放入溶液b中30min，以封闭内源性过氧化物酶对后续步骤的影响，再使用磷酸缓冲液洗涤2次，每次3min。
[0046]
(7)、将步骤(6)处理后的组织贴片浸泡在溶液c中10min，以消化组蛋白并释放出核酸，再使用含0.2％甘氨酸的pbs缓冲液洗涤终止作用3min。
[0047]
(8)、将步骤(7)处理后的组织贴片浸泡在溶液f中，慢慢搅拌15min，以将组织贴片的反应环境酸化使反应处于最佳的酸碱度，再使用磷酸缓冲液洗涤2次，每次3min。
[0048]
(9)、将步骤(8)处理后的组织贴片与步骤(1)的探针杂交：将探针用溶液d稀释至浓度为200ng/ml，滴加到所述组织贴片上，盖上保护膜后放入56℃的温箱中温育12小时以上。
[0049]
(10)、将步骤(9)处理后的组织贴片取出，在65℃的环境下使用溶液e洗涤1次(每次5min)，再用10倍稀释的溶液e洗涤2次(每次20min)，接着转到室温再使用溶液e洗涤1次(每次5min)。
[0050]
(11)、将步骤(10)处理后的组织贴片与抗地高辛
‑
过氧化物酶抗体反应，以使得抗原抗体反应标记目标底物，再使用溶液a洗涤3次，每次5min。其中抗地高辛
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过氧化物酶抗体的推荐工作浓度为50mu/ml～150mu/ml。
[0051]
(12)、将步骤(11)处理后的组织贴片，于室温下加入dba显色液染色10min，再使用溶液a洗涤3次，每次5min，然后将以上处理后的组织贴片在荧光显微镜下观察甘丙肽神经元细胞荧光。
[0052]
图1是如上实施例中甘丙肽分泌细胞检测结果的荧光显微镜图示。图1中高亮神经元为使用本发明实施例的试剂盒检测出的甘丙肽阳性神经元，图1中虚线所包围的范围为甘丙肽的主要表达区域蓝斑核，其70％以上神经元为甘丙肽神经元，周围其他脑区不表达甘丙肽，因此该试剂盒能够准确地识别甘丙肽分泌神经元。
[0053]
综上所述，本发明实施例提供的用于检测甘丙肽分泌细胞的引物、探针以及试剂盒，通过设计特定序列的核酸引物和探针，利用该探针基于rna原位杂交的方法，能够检测细胞中与分泌甘丙肽相关的mrna的表达，从而能够在冰冻切片的组织上快速检测和定位甘丙肽分泌细胞，为找寻甘丙肽分泌细胞及其功能研究提供了更高效的方法，解决了由于甘丙肽在冰冻切片中组织抗原保护差且容易降解而导致一般的抗体难以识别的问题。
[0054]
以上所述仅是本技术的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。