一种基于SERS的体液检测方法及系统与流程

一种基于sers的体液检测方法及系统
技术领域
1.本发明涉及拉曼测量技术领域，特别涉及到一种基于sers的体液检测方法及系统。


背景技术：

2.近年来，我国癌症发病率和死亡率持续上升，且逐渐趋于年轻化，严重威胁着我国人民的生命健康。早期发现、早期治疗、早期诊断是癌症治疗的关键，能够显著提高癌症的治愈率，五年生存率可达90％，而中晚期癌症的五年生存率仅为10
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20％。
3.液体活检是早期癌症筛查的重要方式。液体活检，主要是针对人体体液进行的检测。人体体液包括血清、血浆、尿液、唾液、淋巴液、粪便提取液等，其中蕴含了大量与疾病有关的物质。当发生癌变时，细胞分泌物的成分及浓度会发生变化，还会分泌出特殊的抗原、酶、mirna等；同时癌变组织还会脱落下少量癌细胞，随着血液全身循环。通过血清、血浆等体液标本，取样分析其中与癌症相关的物质，如肿瘤标志物、循环肿瘤细胞、外泌体等，可以实现癌症诊断。与传统组织活检相比，体液活检取样方便、成本低、副作用小，能够满足大面积人群高频普查的需求，可以大量应用于日常体检及病情持续追踪等，在癌症普查、早期诊断、动态监控、精准医疗及药物研发等方面都发挥重要作用。
4.表面增强拉曼光谱法是近年来新兴的生物医学表征方法，在单分子检测领域具有独特优势。拉曼光谱为物质的“指纹谱”，从中可以获得物质的分子结构、含量、官能团等信息，能够从分子水平上鉴别不同物质。但由于体液中与癌症相关的物质含量少，其拉曼散射信号很弱，而体液样品的荧光信号很强，导致无法通过自发拉曼光谱法对这些物质进行精准检测。表面增强拉曼光谱法(sers)可以克服体液样品荧光信号强、拉曼信号弱的问题，从而获得高质量、高信息量的体液拉曼光谱。sers是通过金、银等贵金属纳米级的粗糙结构，实现拉曼散射信号的增强。常见的表面增强方法有两种：一是利用贵金属纳米颗粒，二是利用粗糙的贵金属基底。其中，对于血清、血浆这类液体样品，粗糙金属基底更为适用。
5.目前常用的粗糙金属基底制备方法有化学合成法、模板介导自组装法、光刻法、刻蚀法、膜沉积法、电化学方法等。其中的大部分方法制备工艺复杂、耗时长、价格昂贵，不具备大批量生产应用的价值。而电化学方法操作简单、用时短、表面增强效果好、成本低，适合大批量制备大面积的sers基底。电化学氧化还原法是最常用的电化学制备方法，通过氧化还原电极反应将光滑电极表面粗糙化，从而制备出具有表面增强效果的贵金属基底。
6.然而，体液作为一种混合物，其成分复杂、难以分离，且相关的特殊物质往往含量较低。当利用粗糙金属基底进行拉曼检测时，不同的物质吸附在基底不同区域，均匀性差，而表面增强作用的范围很小。因此选取不同的测试点会获得完全不同的拉曼光谱，普通的单点表面增强拉曼检测信号重复性很差，难以用来进行疾病诊断分析。此外，由于不同的测试点的光谱结果截然不同，很难从中判别出与疾病相关的特殊物质的拉曼光谱，低浓度疾病相关物质的检测存在很大问题。目前也有通过抗体、酶等特异性物质修饰在sers基底上的方法，利用抗原
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抗体等特异性结合手段，进行体液中的特殊物质检测。但这种方法只能
检验单一物质，价格昂贵，且目前尚有许多未知的疾病特异性物质，无法进行多种类疾病筛查，不适合体检普查及病情持续追踪。在分析方面，由于基底并不是完全一致均匀的，不同位置的表面增强因子并不相同，因此不能通过简单地比较峰强变化来判断物质含量的变化，此外体液样品还存在荧光的影响。
7.综上所述，现用的表面增强拉曼液体活检方法的重复性、稳定性和准确性都有所欠缺，且成本高，不适合大面积人群高频普查。因此亟需制备出高质量、低成本的表面增强基底，开发一种快速、稳定、高通量、低成本的表面增强拉曼体液精准检测方法及系统，克服现有表面增强拉曼光谱方法的不均匀性和不可重复性，实现快速、高信息量、精准的检测和结果分析。


技术实现要素：

8.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，提出了一种基于sers的体液检测方法及系统，实现快速、稳定、高通量、低成本的体液活检，进一步实现大面积人群高频疾病普查及相关疾病的分子水平研究。
9.有鉴于此，基于本发明的第一个目的提出了一种基于sers的体液检测方法，包括如下步骤：
10.s1:将待测体液样品滴加在有网格标记的表面增强基底之上；规定样品滴加区域和测量区域；
11.s2:在每个测量区域网格内，采用激光修正大光斑积分测量模式检测体液样品；通过控制光路中的扫描振镜在设定的积分时间内，激光光斑在形状区域内扫描，获取形状区域内的平均拉曼光谱；
12.s3:在s2步骤中同一样品上快速点扫描测量模式进行逐行点扫描，逐行收集处理数据，获取扫描区域内每一点的拉曼光谱特征，并自动寻找差异性光谱。
13.优选的，将待测体液样品滴加在有网格标记的表面增强基底之上的具体步骤为，用滴管吸取少量待测体液样品，置于粗糙sers基底上，可选的，待测体液测量前可进行预处理，预处理可增加或降低体液浓度，并提升体液均匀性，以进一步与表面增强基底匹配，提升检测灵敏度和准确性，预处理方法包括蒸发水分、稀释、超声振荡等；将表面增强基底置于拉曼光谱仪检测装置之下，调节显微镜焦距至可清晰观察到表面增强基底粗糙结构。
14.优选的，其中拉曼光谱特征包括拉曼特征峰；拉曼特征峰信息包括峰位、峰强、峰面积、半高宽，及特征峰信息比值和特征峰信息差值，其中，比值或差值为两个或若干个拉曼特征峰之间的比值或差值。
15.本发明中的激光修正大光斑积分测量模式通过控制光路中的扫描振镜，使得在设定的积分时间内，激光光斑在一定形状区域内不断快速振动扫描，从而直接获取该形状区域范围的平均拉曼光谱。平均光谱能够反映出体液的整体组成成分，通过分析平均拉曼光谱特征峰信息，可以得到液体样品中主要组成成分的浓度变化，反映出不同疾病所带来的代谢水平差异。此外，该平均光谱也可以反映出与疾病相关的特殊物质，因此通过光斑积分法在多区域快速检测可以有效避免漏检、误检。
16.而基于光路中的位移平台进行点扫描，每扫描一行(列)后集中收集处理数据，逐行(列)完成全场扫描，获取相应扫描区域内每一点的拉曼光谱特征，用以捕获吸附在表面
增强基底上的低浓度疾病相关物质。自动寻找扫描结果中的差异性光谱，通过分析扫描数据中的特殊拉曼光谱所对应的具体物质类型，即可进行相应的疾病诊断。激光修正大光斑积分测量模式及快速点扫描模式被应用于每一个测量区域内的网格，以避免体液不均匀扩散引起的检测误差，并通过边缘加权校正修正体液蒸干过程中“咖啡环”效应的影响。
17.低浓度疾病相关物质包括肿瘤标志物、循环肿瘤细胞、外泌体、微生物、癌胚抗原cea、糖类抗原ca19
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9、糖类抗原ca125、丙酮酸激酶、胃蛋白酶源、循环肿瘤细胞、mirna等。
18.进一步的，表面增强基底包括粗糙银基底、粗糙金基底或纳米颗粒以及表面修饰特异性物质的粗糙银基底、粗糙金基底或纳米颗粒。
19.具有表面增强拉曼散射效果的表面增强基底基底包括：粗糙银基底、粗糙金基底或其他可实现的表面增强拉曼散射基底及纳米颗粒；也可以在基底表面进行特异性物质的修饰，从而实现体液样品中特殊物质的靶向测量，修饰的特异性物质包括但不限于抗原、抗体、酶、dna等。
20.进一步的，在表面增强基底形成网格标记的方法为，将表面增强基底区域划分为工作电极加持侧和非工作电极加持侧；在非工作电极加持侧内划分均匀网格，样品滴加在网格中心区域；测量网格范围为体液样品扩散后涉及的所有网格。
21.本发明中采用电化学氧化还原粗糙法制备表面增强基底，将粗糙基底超声震荡清洗、烘干，并划分区域及网格；制备表面增强基底具体步骤为：分别用阴离子表面活性剂、直链烷基苯磺酸钠、稀酸溶液等清洗电化学池，去除其表面残留的杂质和污垢；先后使用砂纸、抛光机等对金属片进行打磨抛光，每次操作后都将金属片放入乙醇和蒸馏水中超声清洗；采用三电极体系，工作电极为表面增强贵金属基底材料，辅助电极为铂丝，参比电极根据贵金属种类选择，电解液为氯化钾溶液，设定电化学氧化还原参数，对金属片进行电化学粗糙化至表面产生均匀的纳米级粗糙结构；用大量蒸馏水清洗，并在烘箱中加热烘干；表面增强效果验证；表面增强基底区域划分；表面增强基底区域划分包括工作电极加持侧和非工作电极加持侧，区域网格形状包括矩形、圆形、三角形等，实现了低成本的表面增强拉曼体液测量。
22.进一步的，体液样品滴加后的扩散区域和扩散形貌，通过边缘加权校正修正体液样品蒸干过程中“咖啡环”效应的影响。
23.进一步的，体液包括血清、血浆、血液、唾液、尿液、细胞内液、细胞间液、组织液、淋巴液或粪便提取液。
24.体液主要组成成分包括：白蛋白、球蛋白、血浆蛋白、胆固醇、多肽、脂肪、酶、微生物等。
25.进一步的，s2具体步骤为：
26.s21：设定光路中扫描振镜的大光斑积分区域的形状和尺寸，扫描振镜在大光斑积分区域内由内向外扫描且激光强度逐渐增强，获得体液样品在该区域内的平均拉曼光谱；调整大光斑积分区域的形状和尺寸，获得体液样品扩散后涉及的每一个网格区域的平均拉曼光谱。
27.s22：使用s21中稳定的拉曼光谱数据，并将光斑移到另一位置，重复s21。
28.优选的，光斑形状包括矩形、正方形、圆形、椭圆形、三角形等。
29.在常规大光斑积分过程中，由于激光光斑位置不断变化，相应光斑位置产生的拉
曼散射落入物镜孔径角的比例也不断变化，积分区域边缘位置拉曼散射被物镜收集到的比例将低于积分区域中心位置，进而使得积分区域边缘位置的待测样品对平均光谱的贡献减小，导致组分比例检测出现较大误差。因此，为了修正光斑位置变化引起的拉曼光谱测量强度变化，本发明中的激光修正大光斑积分测量模式将扫描振镜与激光器联动控制，使激光光斑在形状区域内由内至外扫描时，控制激光强度由内至外逐渐增强，以保证大光斑积分区域内不同位置处测量得到的信号对最终得到的拉曼光谱信号贡献一致，进而避免了形状区域边缘处物镜收集角小造成的信号占比减弱造成的测量误差，实现了更准确的体液组分占比分析。
30.进一步的，s3的具体步骤为：
31.s31：设定扫描区域的形状、尺寸、扫描步长和单点积分时间；单点积分时间不超过1s；
32.s32：激光逐行激发扫描待测区域，并逐行搜集光谱数据；直至完成待测区域扫描；自动寻找差异性光谱，并分析出差异性光谱所对应的物质类型；
33.s33：将光斑移动到另一位置，重复s32。
34.进一步的，步骤s32还包括赋予每点的光谱特征信息rgb值生成二维伪色彩拉曼扫描图像，反映出差异性光谱所对应物质的位置以及通过面积比得到其相对含量。
35.差异性光谱所对应物质物质的面积比可以反映出物质的相对含量。通过检测特殊物质面积比变化可以实现疾病分期、病情持续跟踪等功能，克服传统分析方法的不足，有效检测出体液中的低浓度疾病相关物质，实现对疾病的早期诊断。
36.基于本发明的第二个目的提出了一种基于sers的体液检测系统，包括：
37.基线处理模块，基线处理模块用于消除荧光影响、拉平基线；
38.标准化模块，用于归一化光谱数据，以消除激光功率、积分时间、聚焦程度、表面增强效果不均匀所产生的强度差异；
39.自动寻峰模块，用于寻找扫描光谱数据中的差异性特征峰，用以对应体液样品中的特殊物质，并对离散度超过标准的特殊频率区间标记；即为差异性特征峰的频率区间；
40.成像模块，用于将光谱特征反映在一张二维伪色彩图像中；
41.分析模块，与内置的拉曼光谱数据库比对，用于拉曼光谱法的疾病类型诊断、疾病程度诊断、治疗情况的分析以及更新拉曼光谱数据库。
42.基线处理模块的处理方法包括但不限于双波长消除荧光影响、分段线性插值、多项式拟合等；标准化模块标准化处理方法包括但不限于选取光谱中信号最强位置归一化、选取稳定的特征峰峰强归一化等；分析模块通过人工智能方法学习已知的不同生理状态下的体液拉曼光谱特征，积累丰富的拉曼数据库，总结不同疾病的光谱特征判据，并与测量得到的拉曼光谱特征比较，进而判断待测者是否患有疾病，及判断疾病种类、程度的方法。
43.进一步的，拉曼光谱特征包括拉曼特征峰；拉曼特征峰信息包括峰位、峰强、峰面积、半高宽，及特征峰信息比值和特征峰信息差值，其中，比值或差值为两个或若干个拉曼特征峰之间的比值或差值。
44.优通过以上技术方案，本发明提出了一种基于sers的体液检测方法及系统，具有如下技术效果：
45.1、提出了激光修正大光斑积分测量模式，与传统的大光斑积分测量相比，激光修
正大光斑积分测量模式通过简单的激光强度调制，即修正了原有大光斑积分测量方法中积分区域边缘处和积分区域中心处的信号对最终信号贡献不一致的测量误差，克服了表面增强拉曼方法在测量混合物时的不稳定性和不可重复性，显著提高光谱结果的可靠性；且对于非均匀混合物中各组分占比的测量精度更高，结果更可靠，在表面增强拉曼体液快速活检中具有极大的应用价值。
46.2、提出了快速点扫描测量模式，与传统的点扫描相比，该方法节省了大量的数据处理时间，极大程度上提高了扫描速度；与线(块)扫描相比，该方法能够准确获得单点的光谱数据，信息量丰富，该方法可以显著缩短扫描测量时间，在短时间内获得高信息量、高质量的扫描光谱数据，在检测低浓度疾病相关物质中有极大的应用价值。
47.3、本发明对表面增强拉曼散射基底进行区域划分，避免了由于工作电极夹持侧的表面增强效果不佳造成的低质量测量结果；在非夹持侧进行了网格划分，规定了样品滴加位置和测量网格范围，减小由于液体扩散、表面张力等造成的液滴内部组分分布不均的影响，进一步提高了快速点扫描测量方法的准确性和可靠性，有效避免漏检、误检；结合激光修正大光斑积分测量方法，既减小了由于液体扩散等造成的液体组分大空间范围分布不均产生的影响，又减小了由于分子吸附的表面增强位点不同造成的液体分子组分小空间范围分布不均的影响，两者结合的方法在提高表面增强拉曼测量体液等混合物的稳定性、可重复性和可靠性方面具有极大的应用价值。
48.4、使用本发明提出的表面增强拉曼体液数据处理方法，可以实现对大量数据的快速、精准、客观处理，得到差异性特殊物质的拉曼光谱及二维分布图像，进而进行精准、客观的诊断和分子水平研究，同时，此方法所使用的表面增强基底制备简单，极大降低了检测成本，有益于方法的大范围推广应用。
附图说明
49.本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
50.图1是电化学氧化还原的装置示意图；
51.图2是具有表面增强拉曼效果的粗糙基底区域划分与测量区域示意图；
52.图3是表面增强
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激光修正大光斑积分测量和表面增强
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快速点扫描测量的模式示意图；
53.图4是一种表面增强拉曼体液快速活检方法的拉曼测量装置示意图；
54.图5是根据本发明一个实施例的采用传统测量方法和采用激光修正大光斑积分测量方法获得的血清不同测试点的拉曼光谱信号对比图；
55.图6是根据本发明的一个实施例的采用激光修正大光光斑积分测量方法获得的食管癌、胃癌、肠癌各3例血清样品的平均拉曼光谱对比图；
56.图7是根据本发明的一个实施例的采用快速点扫描测量方法获得的方形区域内121个测量点的拉曼光谱汇总图；
57.图8是根据本发明的一个实施例的采用数据处理模块获取的二维伪色彩拉曼扫描图像；
58.图9是根据本发明的一个实施例设计的数据处理模块界面。
59.图1
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9中，a
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辅助电极，b
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工作电极，c
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参比电极，d
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贵金属片，000
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待测样品，010
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位移平台，101
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探测激光器，201
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带通滤光片，202
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扫描振镜，203
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截止滤光片/陷波滤光片，204
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平面反射镜，300
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物镜，400
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光栅，401
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ccd图像传感器，402
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拉曼光谱信号处理模块，500
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同步控制器。
具体实施方式
60.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
61.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
62.在体液等混合物样品进行表面增强拉曼光谱测量过程中，由于不同的物质吸附在基底不同区域，均匀性差，而表面增强作用的范围很小，选取不同的测试点会获得完全不同的拉曼光谱，普通的单点表面增强拉曼检测信号基本不可重复。现用的测量方法无法进行疾病诊断，无法分析其中的低浓度疾病相关物质。同时针对获取的表面增强拉曼光谱数据，目前尚无成系统的、批量数据的数据处理分析方法。因此，本发明开发的表面增强拉曼体液快速活检方法及分析方法，实现快速、稳定、高通量、低成本的表面增强拉曼体液测量及数据处理分析。
63.实施例1
64.一种基于sers的体液检测方法，包括如下步骤：
65.s1.将待测体液样品滴加在表面增强基底之上，规定体液样品滴加区域和测量区域；
66.主要步骤包括：
67.s11，采用电化学氧化还原粗糙法制备表面增强拉曼(sers)基底，将粗糙基底超声震荡清洗、烘干，并划分区域及网格；具体地，sers基底材料包括但不限于金、银、铜或石墨烯等材料，具有表面增强拉曼散射效果的基底包括但不限于粗糙银基底、粗糙金基底或其他可实现的表面增强拉曼散射基底及纳米颗粒，实施例以金属银为sers基底材料的代表。
68.本实施例必要时，可以在基底表面进行特异性物质的修饰，实现体液样品中特殊物质的靶向测量，从而用于分子水平的研究，修饰的特异性物质包括但不限于抗原、抗体、酶、dna等。
69.具体地，步骤s11可细分为下述步骤：
70.s01，分别用阴离子表面活性剂、直链烷基苯磺酸钠、稀酸溶液等清洗电化学池，去除其表面残留的杂质和污垢；具体地在本实施例中，首先先后使用阴离子表面活性剂、直链烷基苯磺酸钠溶液，用刷子清洗电化学池，此后先后将电化学池置于稀硝酸和蒸馏水中超声清洗10分钟，放入烘干箱烘干。
71.s02，先后使用砂纸、抛光机等对贵金属片(d)进行打磨抛光，每次操作后都将贵金属片(d)放入乙醇和蒸馏水中超声震荡清洗；具体地在本实施例中，首先使用砂纸打磨银片，依次放入乙醇和蒸馏水中超声清洗5分钟，然后通过抛光机，使用由粗到细的三氧化二
铝抛光粉将银片打磨抛光至镜面，再依次放入乙醇和水中超声清洗15分钟。
72.s03，采用三电极体系，工作电极(b)为表面增强贵金属基底材料，辅助电极(a)为铂丝，参比电极(c)根据贵金属种类选择，电解液为氯化钾溶液，设定电化学氧化还原参数，对贵金属片(d)进行电化学粗糙化至表面产生均匀的纳米级粗糙结构。具体地，实施例中采用的电化学池示意图如图1所示，在实施例中，采用的工作电极(b)为银片，银片的固定方式为一侧夹持在电极夹上，辅助电极(a)为铂丝，参比电极(c)为银
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氯化银参比电极(c)，电解液为1mol/l的氯化钾溶液，其氧化还原参数为由
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0.6v以0.5v/s的扫描速度扫描至 0.4v，并在 0.4v静置10s。此后由 0.4v以1v/s的扫描速度扫描至
‑
0.6v，在
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0.6v静置30s，重复循环过程直至银片由光滑银色镜面变为乳白色粗糙表面。
73.s04，用大量蒸馏水清洗，并在烘箱中加热烘干。
74.s05，表面增强效果验证；具体地，在实施例中，将罗丹明水溶液滴至制备好的粗糙银片上，将罗丹明水溶液样品置于拉曼光谱仪检测装置之下，调节显微镜焦距，使用激光激发罗丹明分子的表面增强拉曼光谱，实际测量中，可根据实际需求选取包括但不限于下述激光波长：633nm，635nm，785nm，808nm，980nm，1550nm等。
75.s06，基底区域划分；具体地，实施例中采用的区域划分示意图如图2所示，在实施例中，对粗糙sers基底中非工作电极夹持区域进行均匀的矩形网格划分，实际测量中，根据基底形状和制备状态，区域划分的形状包括圆形、三角形、矩形等。
76.s12，用滴管吸取少许待测体液样品，置于粗糙sers基底上；具体地，实施例以食管癌、胃癌、肠癌患者的血清为体液代表，但检测的体液包括但不限于血清、血浆、血液、唾液、尿液、细胞内液、细胞间液、组织液、淋巴液、粪便提取液等。
77.体液主要组成成分包括但不限于白蛋白、球蛋白、血浆蛋白、胆固醇、多肽、脂肪、酶、微生物等；为了进一步提升检测灵敏度和准确性，待测体液测量前可进行预处理，预处理可增加或降低体液浓度，并提升体液均匀性，以进一步与基底匹配，预处理方法包括蒸发水分、稀释、超声振荡等。
78.具体地，实施例中待测体液样品的滴加位置示意图如图2所示，在实施例中，待测样品滴加的区域为矩形网格区域的中心，此处的表面增强拉曼散射效果较强，且较为均匀稳定，待测液滴在基底上扩散，最终扩散形成如图2所示意的待测样品区域；根据待测液滴的扩散区域和扩散形貌，通过边缘加权校正修正体液蒸干过程中“咖啡环”效应的影响。
79.s13，将基底置于拉曼光谱仪检测装置之下，调节显微镜焦距至可清晰观察到基底粗糙结构；具体地，采用极小功率激光光斑辅助聚焦更容易实现对液体样品的聚焦，当激光光斑第二次达到极小时，此时激光聚焦在具有表面增强拉曼散射效果的液体层，在实际测量中，为进一步方便聚焦和测量，可以待血清凝固后再聚焦。
80.s2采用激光修正大光斑积分测量模式检测待测样品，主要步骤包括：
81.s21，将扫描振镜置于光路中，设定大光斑积分区域的形状和尺寸，使用控制器控制扫描振镜，使光斑在大光斑积分区域内由内向外扫描，使用激光激发待测体液的拉曼光谱，同时控制激光强度在由内向外的扫描过程中逐渐增强，以保证大光斑积分区域内不同位置处测量得到的信号对最终得到的拉曼光谱信号贡献一致，最终获得该区域内的平均拉曼光谱，此后改变大光斑积分区域的形状和尺寸，确定合适的形状和尺寸，以获取稳定可重复的拉曼光谱数据。具体地，在实施例中，大光斑积分区域的形状包括但不限于矩形、正方
形、圆形、椭圆形、三角形等。
82.具体地，实施例中采用的激光修正大光斑积分测量方法示意图如图3所示，激光光斑在图示阴影范围内不断振动扫描，获取阴影范围内的全部拉曼光谱特征，最终输出阴影范围内的平均拉曼光谱。
83.具体地，在实施例中，红光对生物大分子的刺激、损伤更小，且针对粗糙银基底，选用波长大于400nm的激发光更容易产生表面增强拉曼散射；若选用粗糙金基底，则可选择波长大于600nm的激光器。需要说明的是，在进行体液检测时，激光器波长范围需在相应测量体液对应的光学窗口之内。
84.s22，在合适的光斑参数条件下，使用激光激发待测体液的拉曼光谱，测量得到某一区域的平均光谱后，将光斑移动到另一位置，重复这一步骤，最终获得液滴不同区域的拉曼光谱；具体地，实施例中选择的测量区域范围如图2实线方框所示，在待测体液样品涉及的每一个网格中都进行激光修正大光斑积分测量，获得每一个网格区域的平均拉曼光谱，以减小由于液体扩散、表面张力等造成的液滴内部组分分布不均的影响，同时激光修正大光斑积分测量方法减小由于液滴中不同组分所吸附的表面增强位点不同而导致的测量不均匀性，多网格区域测量与激光修正大光斑积分测量相结合，共同显著提高了表面增强拉曼测量混合物样品时的稳定性和可重复性。
85.图4给出了本实施例需使用的一种表面增强拉曼体液快速活检方法的拉曼测量装置示意图；
86.本实施例的测量装置由待测样品(000)、位移平台(010)、探测激光器(101)、带通滤光片(201)、扫描振镜(202)、截止滤光片/陷波滤光片(203)、平面反射镜(204)、物镜(300)、光栅(400)、ccd图像传感器(401)、拉曼光谱信号处理模块(402)和同步控制器(500)组成；探测激光器(101)用于产生连续探测激光，并且，探测激光器(101)产生的激光波长需与选取的sers基底匹配，以实现表面增强拉曼散射效应。例如：粗糙金基底需选用波长大于600nm的激光器；粗糙银基底需用波长大于400nm的激光器。激光波长大于600nm时，对sers基底刺激较小，波长进一步增长时，刺激进一步减小，但相应信号强度会进一步减少，实际测量中，可根据实际需求选取包括但不限于下述激光波长：633nm，635nm，785nm，808nm，980nm，1550nm等。
87.任选地，在探测激光器(101)单色性较差时，使用带通滤光片(201)提高探测激光的单色性。
88.扫描振镜(202)用于改变探测激光光斑中心位置，实现在光斑范围内的振动扫描；通过调整扫描振镜中反射镜角度和位置，可以改变探测激光进入物镜的位置和角度，进而改变探测激光光斑中心位置，其空间分辨率可达50nm。
89.物镜(300)用于将探测激光聚焦在待测样品(000)上。
90.位移平台(010)用于改变样品位置，在激光光斑中心位置固定不变时，可通过移动位移平台位置，改变激光照射在样品上的位置，实现快速点扫描。
91.根据需求，选取使用截止滤光片或陷波滤光片(203)，可消除探测激光的瑞利散射，进而获得探测激光激发的拉曼光谱。
92.光栅(400)用于将进入仪器的光线分光，获得样品的拉曼光谱；ccd图像传感器(401)用于测量拉曼光谱信号；拉曼光谱信号处理模块(402)用于分析获得的拉曼光谱信号
得到待测样品拉曼峰峰位及峰强。同步控制器(500)用于同步控制扫描振镜(202)角度及探测激光器(101)功率，在控制扫描振镜使激光光斑在大光斑积分区域内由内向外扫描的同时，控制激光强度在由内向外的扫描过程中逐渐增强，以保证大光斑积分区域内不同位置处测量得到的信号对最终得到的拉曼光谱信号贡献一致。
93.任选地，使用平面反射镜(204)构成光路。
94.通过调整扫描振镜(202)的角度，或移动位移平台(010)的位置，即可实现将激光光斑从一个测量位置移动到另一个测量位置的操作，通过重复步骤s2，最终获得液滴不同区域的拉曼光谱。
95.图5给出了根据本实施例的采用传统测量方法和采用激光修正大光斑积分测量方法获得的血清不同测试点的拉曼光谱信号对比图，可以看出，在相同的积分时间和激光光强下，采用激光修正大光斑积分测量方法得到的拉曼光谱信号稳定性和可重复性显著优于显著测量模式，传统的测量模式针对非均匀混合物可重复性差，组分占比分析不准确，难以进行疾病诊断，激光修正大光斑积分测量方法对提高表面增强拉曼光谱法的稳定性和重复性具有非常重要的意义，该方法在表面增强拉曼体液快速活检中具有极大的应用价值。
96.图6给出了根据本实施例的采用激光修正大光斑积分测量方法获得的食管癌、胃癌、肠癌各3例血清样品的平均拉曼光谱对比图，可以看出，不同癌症患者血清的平均拉曼光谱存在差异性，说明体液拉曼光谱可以作为疾病诊断的一种方法，进一步地，可以提取拉曼光谱中特征信息，总结不同病理的光谱特征判据，实现疾病的诊断、分期等；
97.拉曼光谱特征包括但不限于特征峰峰位、峰强、峰面积、半高宽，及特征峰信息比值：如峰强比、峰面积比，和特征峰信息差值：如峰位差、峰强差，其中，比值或差值可以为两个拉曼特征峰之间的比值或差值，也可以为多个拉曼特征峰之间的比值或差值。
98.光谱特征判据，包括但不限于：基于增加或减少的拉曼特征峰进行疾病诊断，基于拉曼特征峰峰强、半高宽、峰面积进行疾病诊断，基于多组特征峰峰强比、峰面积比进行疾病诊断，基于多组特征峰峰强比及峰位信息的主成分分析进行疾病诊断等。
99.s3在同一样品上采用快速点扫描测量模式进行测量，主要步骤包括：
100.s31，设定扫描区域的形状、尺寸、扫描步长和单点积分时间；
101.具体地，在实施例中，扫描区域形状包括但不限于线段、矩形、圆形、三角形等，一般多选择矩形区域，单点扫描时间不超过1s；
102.s32，使用激光激发待测区域的拉曼光谱，每采集一行(列)收集一次光谱数据，逐行(列)完成全场扫描；
103.需要说明的是，前述对激光修正大光斑积分测量模式的解释说明也适用于快速点扫描测量模式，前述采用的测量区域网格范围也适用于快速点扫描测量模式，此处不再赘述，不同在于，快速点扫描方法通过控制位移平台(010)实现空间区域的扫描，而激光修正大光斑积分测量方法通过扫描振镜(202)不断振动实现光斑形状内的测量；
104.s33，将光斑移动到另一位置，重复s32，最终获得液滴不同区域的拉曼光谱点扫描结果。
105.具体地，通过移动位移平台(010)的位置，即可实现将激光光斑从一个测量位置移动到另一个测量位置的操作，通过重复步骤s32，最终获得液滴不同区域的拉曼光谱点扫描结果。
106.实施例二
107.一种基于sers的体液检测系统，包括：
108.基线处理模块：基线处理模块用于消除荧光影响、拉平基线，处理方法包括但不限于双波长消除荧光影响、分段线性插值、多项式拟合等；
109.具体地，实施例以分段线性插值为基线处理方法的代表，将拉曼光谱横坐标，即拉曼频移等分为多个区间，在各个区间的前后一定波数范围内各寻找一个最低点，以这两个点为基准做区间内的线性插值，拟合得到基线谱线，原光谱数据减去基线数据即可实现拉平基线，在实际数据分析处理中，还可选择双波长双波长消除荧光影响、多项式拟合等方法处理基线；
110.图7给出了根据本实施例采用快速点扫描测量方法获得的方形区域内121个测量点的拉曼光谱汇总图，可以看出，存在少数几条差异性明显的拉曼光谱，说明该拉曼光谱对应点存在低含量的特殊物质，说明快速点扫描方法具有快速检验低浓度标志物的能力，该方法在表面增强拉曼体液快速活检中具有极大的应用价值；
111.标准化模块，标准化模块用于归一化光谱数据，以消除激光功率、积分时间、聚焦程度、表面增强效果不均匀所产生的强度差异，标准化处理方法包括但不限于选取光谱中信号最强位置归一化、选取稳定的特征峰强归一化等；
112.具体地，在实施例中，选择信号最强位置归一化的方法，首先自动识别扣除可能出现的宇宙射线，寻找到光谱中强度最高的数据点，所有光谱数据以该点强度为基准归一化，在实际测量中，还常选择稳定特征峰强归一化方法进行数据标准化，所选的稳定特征峰为稳定出现在每条光谱中的特征峰，包括但不限于位于1004cm
‑1、2800～3000cm
‑1的特征峰，通过选取某一稳定特征峰峰位附近一段数据进行高斯
‑
洛伦兹拟合，得到特征峰峰强，所有光谱数据以该峰强数据为基准归一化；
113.自动寻峰模块，自动寻峰模块用于寻找扫描光谱数据中的差异性特征峰，用以对应体液样品中低浓度的与疾病相关的特殊物质，对离散度超过一定标准的特殊频率区间进行标记，即为差异性特征峰的频率区间；
114.低浓度的与疾病相关物质包括但不限于肿瘤标志物、循环肿瘤细胞、外泌体、微生物、癌胚抗原cea、糖类抗原ca19
‑
9、糖类抗原ca125、丙酮酸激酶、胃蛋白酶源、循环肿瘤细胞、mirna等。
115.具体地，在实施例中，计算所有谱线在每个频率上的均值和方差，扣除宇宙射线的可能，对离散度超过5个标准差的特殊频率区间进行标记，即为差异性特征峰的频率区间；
116.成像模块，成像模块用于将拉曼光谱特征反映在一张二维伪色彩图像中，拉曼光谱特征包括但不限于拉曼特征峰峰位、峰强、峰面积、半高宽、峰强比、峰面积比等；
117.具体地，实施例以特征峰峰强进行拉曼扫描成像为代表，所选取的特征峰为自动寻峰模块所寻找的差异性特征峰的频率区间，赋予该特征峰峰强某一颜色值，生成该特征峰所对应的特殊物质的二维分布图像，该特征峰可反映的信息包括但不限于疾病识别判据、疾病标志物浓度、疾病发展预测指标等；
118.分析模块，分析模块用于拉曼光谱法的疾病类型诊断、疾病程度诊断、治疗情况等分析，通过人工智能方法学习已知的不同生理状态下的体液拉曼光谱特征，积累丰富的拉曼数据库，总结不同疾病的光谱特征判据，并与测量得到的拉曼光谱特征比较，进而判断待
测者是否患有疾病，及判断疾病种类、程度的方法；
119.具体地，不同的生理状态包括但不限于健康、早期癌症、进展期癌症、良性炎症；
120.具体地，在实际应用中，体液拉曼光谱数据库信息包括但不限于体液提供者性别、年龄、居住地、既往病史、体液拉曼光谱特征；
121.具体地，在实际应用中，拉曼光谱特征判据，包括但不限于：基于增加或减少的拉曼特征峰进行疾病分析，基于拉曼特征峰峰强、半高宽、峰面积进行疾病分析，基于多组特征峰峰强比、峰面积比进行病理分析，基于多组特征峰峰强比及峰位信息的主成分分析进行疾病分析等；
122.图8给出了根据本实施例采用数据处理模块获取的二维伪色彩拉曼扫描图像。
123.图9给出了根据本实施例的数据处理模块界面，具体地，包括如下功能：数据读入功能可以输入原始拉曼光谱数据，点击数据标准化即可对原始拉曼光谱数据进行基线处理和归一化处理，点击差异峰寻找可以寻找出差异性特征峰的频率区间，并可选择该峰的峰强、峰面积，生成拉曼光谱图像；此外还可以手动输入频率区间的上界、下届，实现这一区间内峰强、峰面积的拉曼光谱成像；进一步地，还可以对峰的峰强比和峰面积比进行拉曼光谱成像；此外，在实际应用中，该界面具有分析界面，基于积累的数据库和人工智能学习的光谱判据，对输入的光谱数据进行分析，进行疾病类型、程度、治疗效果等的诊断。
124.根据本实施例提出的表面增强拉曼体液快速检测方法及分析方法，通过激光修正大光斑积分测量模式，显著提高了表面增强拉曼光谱法测量混合物样品时的稳定性和可重复性；通过快速点扫描测量模式，显著缩短了扫描测量时间，并实现了低浓度疾病相关物质的快速检测；对表面增强拉曼散射基底进行了区域网格划分，规定了样品位置和测量范围，结合上述两种测量方法，进一步提高了测量结果的稳定性、可重复性和准确性，有效避免漏诊误诊；进一步地，针对快速、客观、批量数据处理的问题，提出了数据分析处理方法，实现了大量拉曼光谱数据同时进行拉平基线、标准化、自动寻找差异性特征峰及拉曼扫描成像处理，显著提高了数据分析速度；上述测量方法及数据分析方法在医疗检测领域有广泛的应用前景。
125.此外，术语“首先”、“其次”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“首先”、“其次”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
126.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
127.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。