一种灵敏的AChE酶活性检测方法与流程

一种灵敏的ache酶活性检测方法
技术领域
1.本发明属于环境检测领域，涉及一种灵敏的ache酶活性检测方法。


背景技术：

2.在过去的几十年中，由化合物质引起的地下水和地表水污染已经成为许多国家和地区严重的环境问题。在水体中，大多数化合物以低浓度存在，但它们对人类和动物产生的不良影响已经引起了人们的广泛关注。据最近的研究发现，一些微量化合污染物代谢过程中的中间副产物甚至比其母体化合物本身的毒性更大(li w,zhao y,x yan,et al.transformation pathway and toxicity assessment of malathion in aqueous solution during uv photolysis and photocatalysis[j].chemosphere,2019,234)。因此，准确识别和量化水中的有毒微量污染物，是目前所化学水质监测工艺面临的巨大的挑战。为了应对这一挑战，体外和体内生物测定法可作为一种补充筛选工具，用来评估水样中化学物质的综合生物学效应。而体内动物试验复杂且昂贵，因此体外试验被认为是在环境水溶液中进行高通量毒性实验更可行、更实用的方法。
[0003]
乙酰胆碱酯酶(ache)的专一性酶促反应作用底物是乙酰胆碱(ach)。ache被认为是评估暴露于神经毒性化学物质的敏感生物标志物，我们可以通过对乙酰胆碱酯酶的抑制作用来反应这种物质的神经毒性。目前，已经开发了许多借助底物或分解产物来测量ache活性的定量体外测定法，主要包括光度测定法(ellman g l,courtney k d,jr.v a,et al.a new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity[j].biochemical pharmacology,1961,7(2):88
‑
90)、电位测定法(cuartero m,ortuo j a,ms garc
í
a,et al.assay of acetylcholinesterase activity by potentiometric monitoring of acetylcholine[j].analytical biochemistry,2012,421(1):208
‑
212)、荧光分析法(wang y j,gu z y,xing g w.continuous fluorometric assay for sialidase activity and inhibition with conjugated polyelectrolytes[j].chemistry
‑
an asian journal,2012,7(3):489
‑
492)、电化学分析法(md carlo,pepe a,sergi m,et al.detection of coumaphos in honey using a screening method based on an electrochemical acetylcholinesterase bioassay[j].talanta,2010,81(1
‑
2):76
‑
81)和放射性分析法(fonnum,f.radiochemical micro assays for the determination of choline acetyltransferase and acetylcholinesterase activities[j].biochemical journal,1975,115(3):465
‑
472)。其中，最著名的技术是ellman方法，该方法是根据乙酰基硫代胆碱(atch)酶促水解后的产物硫代胆碱与dtnb反应生成黄色物质的速率来评测神经毒性。以上传统的测定方法是使用合成底物代替天然底物ach来测量ache活性，这主要是由于天然底物ach缺乏光敏性，使荧光团和电活性基团难以测量。而与合成底物相比，天然底物ach的酶催化反应更为敏感，若以天然底物ach为底物，ache活性分析的灵敏度可相应提高。
[0004]
高效液相色谱
‑
质谱联用技术(uplc
‑
ms)可以直接定量底物ach及其水解产物胆碱
(ch)，最近，有研究者已经开发了几种hplc
‑
ms方法来检测低检测限的ach或ch，如liu等人发布的方法(liu w,yang y,cheng x,et al.rapid and sensitive detection of the inhibitive activities of acetyl
‑
and butyryl
‑
cholinesterases inhibitors by uplc
‑
esi
‑
ms/ms[j].journal of pharmaceutical&biomedical analysis,2014,94:215
‑
220.)，以及schebb n h等人发布的方法(schebb n h,d fischer,hein e m,et al.fast sample preparation and liquid chromatography
‑
tandem mass spectrometry method for assaying cell lysate acetylcholine[j].journal of chromatography a,2008,1183(1
‑
2):100
‑
107.)。但是，他们的方法是单独降低ach或者ch的检测限，相比较而言，降低生化反应速度检测限可以使得对于ache活性测定的灵敏度更高。因此，优化酶促水解参数对于提高ache活性分析的灵敏度同样重要。以前发布的hplc
‑
ms/ms方法主要侧重于样品预处理和仪器参数优化，却忽略了一些重要影响因素的优化，例如底物浓度，酶与底物比例以及观察时间。此外，在这些方法中，都是在水样中添加较大比例的乙腈(最高50％)以终止ache反应，但是它们的检测灵敏度同样也会因为稀释作用而被进一步降低。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于克服上述现有技术中，ache活性的检测方法灵敏度较低的缺点，提供一种灵敏的ache活性检测方法。
[0006]
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
[0007]
一种灵敏的ache酶活性检测方法，包括如下步骤：
[0008]
步骤1)配制流动相；之后采用梯度洗脱法对乙酰胆碱进行分离；
[0009]
步骤2)将ache加入处理好的待测样品中反应，待测样品中含有抑制剂，之后向反应体系中加入ach进行酶促反应，得到混合溶液，分别对酶促反应前后的混合溶液，进行淬灭反应，然后检测酶促反应前后混合溶液中的ach含量。
[0010]
优选地，步骤2)的混合溶液中，ach的浓度为90～110μg/l，ache的浓度为6.5
×
10
‑4u/ml～7.5
×
10
‑4u/ml；抑制剂的浓度至少为0.3ug/l。
[0011]
优选地，酶促反应时混合溶液的ph为7.8～8。
[0012]
优选地，酶促反应时还添加有磷酸盐缓冲液；
[0013]
混合溶液中，磷酸盐缓冲液的浓度为2～2.5mm。
[0014]
优选地，酶促反应后，添加ach的同时调节混合溶液的ph为2.3～2.7。
[0015]
优选地，淬灭反应时混合溶液中的ph是采用硫酸调节的。
[0016]
优选地，酶促反应时的温度为34～36℃；
[0017]
酶促反应的时间为20～30min；
[0018]
淬灭反应的时间为0.5～1min。
[0019]
优选地，流动相由甲醇和超纯水组成。
[0020]
优选地，步骤2)中，酶促反应前后ache的抑制作用为
[0021][0022]
式中，h
ache
为测试样品对ache的抑制作用；s0为在没有抑制剂的情况下获得的反应
动力学方程的斜率，为ln(ach1/ach0)；s为与待测样品反应得到的反应动力学方程式的斜率，为ln(ach2/ach0)；ach0为酶促反应前ach的量，ach1为没有抑制剂的情况下酶促反应后ach的量，ach2为有抑制剂的情况下酶促反应后ach的量。
[0023]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0024]
本发明公开了一种灵敏的ache活性检测方法，选择最合适的ach与ache的投加比例，以使得在没有抑制剂的情况下酶促反应结束后，能够水解掉百分之九十左右的ach。酶促反应进行时，向待测样品溶液加入磷酸缓冲盐溶液使样品溶液中缓冲盐的最终浓度达到2mm，将溶液的ph调至7.8～8，以保证最佳的酶反应条件，酶促反应后，将待测试样的ph值调至2.3～2.7，以终止酶促反应并获得良好的ach出峰条件。酶促反应的终止是通过淬灭ache进行的，原因是ach作为底物，将ache淬灭后，ach的量不再改变，淬灭ache即可终止酶促反应。本发明方法能够用于低浓度农药和水质检测。
[0025]
进一步地，所选用的ach的浓度为100μg/l，ache的使用量为6.5
×
10
‑4u/ml至7.5
×
10
‑4u/ml，以使得在没有抑制剂的情况下酶促反应结束后ach的降解量为百分之九十左右。是为了使用uplc
‑
ms/ms对ach定量时，将ach的量降解掉一个数量级，需要保证酶促反应结束后ach的量有一定剩余，剩余量太多会使得检测的灵敏性降低。
[0026]
进一步地，酶促反应中，溶液的ph为7.8
‑
8(反应溶液中的磷酸盐缓冲液浓度为2mm)，原因是在此ph条件下，可以使得ache的活性达到最佳状态。
[0027]
进一步地，酶促反应后，将待测样品的ph调至2.3～2.7，目的是终止酶促反应(在ph小于5以后，即可将酶淬灭掉，而使用添加有机溶剂如甲醇、乙腈同样可以将酶淬灭掉，但是会影响ach的响应强度)并获得ach良好的出峰效果，(在加入磷酸盐缓冲液后，ach的出峰形状改变，为了获得ach的良好出峰条件，需要将待测样品的ph值调至2.3～2.7，不同ph条件下检测ach的出峰情况。
附图说明
[0028]
图1为不同体积分数甲醇对ache活性的影响；
[0029]
图2为不同体积分数乙腈对ache的影响
[0030]
图3为不同ph对ache活性的影响；
[0031]
图4(a)为ach和ch标准样品色谱图，(b)
‑
(h)为加入2mm磷酸盐缓冲液后的样品在不同ph条件下ach和ch的色谱图。
具体实施方式
[0032]
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
[0033]
实施例1
[0034]
一种灵敏的ache活性检测方法，包括以下步骤：
[0035]
第一步，配制流动相，流动相由色谱级甲醇和超纯水组成；
[0036]
第二步，色谱条件：uplc所使用的流动相为a:超纯水(upw)和b:甲醇(meoh)。采用梯度洗脱法对乙酰胆碱(ach)进行分离，具体操作步骤描述如下：以0％的甲醇为起始条件，甲醇在2.5分钟后升高至100％并保持1.5分钟，最后回到起始条件0％甲醇平衡2分钟。在上述的分离条件下，色谱柱的温度恒定维持在35℃，样品的自动进样室温度设为25℃，进样针
进样体积为2μl，流动相的流速设为0.2ml/min。
[0037]
第三步，质谱条件：质谱的离子化方式为电喷雾离子源模式(esi)；毛细管电压(capillary voltage)设为3.40kv；锥孔电压(cone)设为23.69v；脱溶剂气温度(desolvation temperature)设为350℃，离子源温度(source temperature)设为110℃；氮气(纯度>99.99％)作为脱溶剂气(desolvation gas flow)和锥孔反吹气(cone gas flow)，其流速分别设为500l/hr和35l/hr；碰撞气体(collision gas)为氩气(纯度>99.99％)，其流速设为0.10ml/min。
[0038]
表1 ach和ch的名称、保留时间、mrm运行参数
[0039][0040]
第四步，待测样品作用于ache：ph值为7.8时，ache的活性最佳，为了使酶的活性始终保持在较高的状态，需要在样品溶液中添加一定浓度的磷酸缓冲盐。本方法将酶促反应的时间控制在30min，通过检测反应30min前后ach浓度的变化间接反应ache的活性。为了合理控制ache的反应速度，需要研究乙酰胆碱酯酶与乙酰胆碱的最优比例。本研究设定溶液中初始ach的浓度为100μg/l，探究不同浓度下ache水解ach反应前后ach量的变化，反应时间设为30min，实验结果如表2。由表2可知当ach浓度为100μg/l时，加入7
×
10
‑4u/ml ache可以在30min内水解掉溶液中88％的ach。在这样的条件下，ach在30min后有足够剩余满足需要。确定好ache与ach的最优比例后，取25ml待测样品溶液，依次向待测样品溶液加入0.1mol/l ph＝8.0磷酸盐缓冲盐溶液500μl和0.5u/ml的乙酰胆碱酯酶溶液35μl，混合均匀后置于35℃生化培养箱中避光反应30min。
[0041]
表2不同浓度ache水解100μg/l ach反应前后ach量的变化
[0042][0043]
注：ach的量以液相色谱出峰的峰面积计。
[0044]
第五步，对酶促反应前后待测试样进行采集。使用本方法进行毒性检测实验过程中需要按时间点取反应中的溶液，作为待测试样检测相应时间点乙酰胆碱(ach)的浓度变化，继而通过乙酰胆碱(ach)浓度的变化速率间接反映待测溶液对ache抑制的情况。为了得到所取样品相应时间点准确的乙酰胆碱的浓度，需要在取样之后快速终止所取溶液中仍在进行的酶促反应。取样之后淬灭ache方法包括改变溶液ph以及加入有机溶剂(乙腈和甲醇)。
[0045]
在溶液ph＝8.0的条件下，本研究将在ache与ach的反应过程中加入、乙腈和甲醇等，分别测试不同的有机溶剂、不同的体积分数对ache活性的影响。10％体积分数的乙胫ache的抑制性很强，即可以快速终止溶液中ache的酶促反应。
[0046]
在ph＝8.0时ache的活性达到最佳，ph偏低时酶的活性会受到抑制。将ph＝8.0的超纯水中的ache抑制性认定为0，在实验室中测试不同ph对ache活性的影响。改变样品溶液ph值至5.0及以下时可以快速终止溶液中ache的活性，使ache分解ach的反应快速终止。
[0047]
色谱柱可以成功分离ach和ch的标准样品，但在标准溶液中添加缓冲盐后出峰位置相对标样靠后且出峰形状较乱。为了改善出峰情况，我们提出的解决方案是改变样品进样前的溶液ph值。随着样品溶液ph的逐渐降低，样品的出峰位置发生前移，并且峰形逐渐改善，ach和ch的分离变好。当ph调节为2.5时样品出峰峰形和位置与标样接近一致。
[0048]
酶促反应前后取样后需要将待测试样的ph调至2.5，具体操作为向第四步反应后的溶液中加入25mg/l的乙酰胆碱(ach)溶液100μl，混合均匀。然后将溶液继续置于生化培养箱中35℃条件下避光反应，并按照时间点——0min，30min依次取样2ml加入离心管中作为待测试样，离心管中预先加入0.5mol/l h2so420μl，待测试样置于4℃冰箱中保存
[0049]
第六步，预处理样品及数据分析。将第五步所取样品以12000r/min转速离心15分钟，用0.22μm针头式过滤器过滤并转移至uplc
‑
ms/ms样品小瓶中利用uplc
‑
ms/ms检测各时间点样品中ach的含量变化，使用以下公式计算ache的抑制性，以百分比表示。
[0050][0051]
式中：h
ache
为测试样品对ache的抑制作用，以百分比表示；s0为在没有抑制剂的情况下(使用upw)，通过反应获得的反应动力学方程的斜率，为ln(ach
30
/ach0)；s为与测试样品反应得到的反应动力学方程式的斜率，即ln(ach
30
/ach0)。
[0052]
所述第五步中，向反应的样品溶液中加入10％有机溶剂乙腈或丙酮后样品中的ach浓度会降低，因此质谱检测信号响应强度也会降低；本方法选择通过改变溶液ph的方式来快速终止反应中的ache的活性。
[0053]
实施例2
[0054]
一种灵敏的ache抑制活性测定方法，用于评估水样的神经毒性，包括以下步骤：
[0055]
第一步，配制流动相，流动相由色谱级甲醇和超纯水组成。在25℃时，超纯水的电导率为18.2mω
·
cm。
[0056]
第二步，色谱条件：采用梯度洗脱法对乙酰胆碱(ach)进行分离，以0％的甲醇为起始条件，甲醇在2.5分钟后升高至100％并保持1.5分钟，最后回到起始条件0％甲醇平衡2分钟。在上述的分离条件下，色谱柱的温度恒定维持在35℃，样品的自动进样室温度设为25℃，进样针进样体积为2μl，流动相的流速设为0.2ml/min。
[0057]
第三步，质谱条件：质谱的离子化方式为电喷雾离子源模式(esi)；毛细管电压(capillary voltage)设为3.40kv；锥孔电压(cone)设为23.69v；脱溶剂气温度(desolvation temperature)设为350℃，离子源温度(source temperature)设为110℃；氮气(纯度>99.99％)作为脱溶剂气(desolvation gas flow)和锥孔反吹气(cone gas flow)，其流速分别设为500l/hr和35l/hr；碰撞气体(collision gas)为氩气(纯度>99.99％)，其流速设为0.10ml/min。
[0058]
第四步，待测样品作用于ache：ph值为7.8时，ache的活性最佳，为了使酶的活性始终保持在较高的状态，需要在样品溶液中添加一定浓度的磷酸缓冲盐。本方法将酶促反应的时间控制在30min，通过检测反应30min前后ach浓度的变化间接反应ache的活性。为了合理控制ache的反应速度，需要研究乙酰胆碱酯酶与乙酰胆碱的最优比例。本研究设定溶液中初始ach的浓度为100μg/l，探究不同浓度下ache水解ach反应前后ach量的变化，反应时间设为30min，实验结果如表2。由表2可知当ach浓度为100μg/l时，加入7
×
10
‑4u/ml ache可以在30min内水解掉溶液中88％的ach。在这样的条件下，ach在30min后有足够剩余满足需要。确定好ache与ach的最优比例后，取25ml待测样品溶液，依次向待测样品溶液加入0.1mol/l ph＝8.0磷酸盐缓冲盐溶液500μl和0.5u/ml的乙酰胆碱酯酶溶液35μl，混合均匀后置于35℃生化培养箱中避光反应30min。
[0059]
第五步，对酶促反应前后待测试样进行采集。使用本方法进行毒性检测实验过程中需要按时间点取反应中的溶液，作为待测试样检测相应时间点乙酰胆碱(ach)的浓度变化，继而通过乙酰胆碱(ach)浓度的变化速率间接反映待测溶液对ache抑制的情况。为了得到所取样品相应时间点准确的乙酰胆碱(ach)的浓度，需要在取样之后快速终止所取溶液中仍在进行的酶促反应。取样之后淬灭ache方法包括改变溶液ph以及加入有机溶剂(丙酮、乙腈和甲醇)。
[0060]
在溶液ph＝8.0的条件下，本研究将在ache与ach的反应过程中加入丙酮、乙腈和甲醇等，分别测试不同的有机溶剂、不同的体积分数对ache活性的影响，测试结果如图1。10％体积分数的丙酮或者乙腈对ache的抑制性很强，即可以快速终止溶液中ache的酶促反应。
[0061]
图1为不同体积分数甲醇对ache活性的影响，图2为不同体积分数乙腈对ache活性的影响；在ph＝8.0时ache的活性达到最佳，ph偏低时酶的活性会受到抑制。将ph＝8.0的超纯水中的ache抑制性认定为0，在实验室中测试不同ph对ache活性的影响。改变样品溶液ph值至5.0及以下时可以快速终止溶液中ache的活性，使ache分解ach的反应快速终止。
[0062]
图3为不同ph对ache活性的影响；色谱柱可以成功分离ach和ch的标准样品。但在标准溶液中添加缓冲盐后出峰位置相对标样靠后且出峰形状较乱。为了改善出峰情况，我们提出的解决方案是改变样品进样前的溶液ph值。随着样品溶液ph的逐渐降低，样品的出峰位置发生前移，并且峰形逐渐改善，ach和ch的分离变好。当ph调节为2.5时样品出峰峰形和位置与标样接近一致。
[0063]
图4(a)为ach和ch标准样品色谱图，(b)—(h)为加入2mm磷酸盐缓冲液后样品不同ph条件下ach和ch的色谱图。由图可知，酶促反应前后取样后需要将待测试样的ph调至2.5，具体操作为向第四步反应后的溶液中加入25mg/l的乙酰胆碱溶液100μl，混合均匀。然后将溶液继续置于生化培养箱中35℃条件下避光反应，并按照时间点——0min，30min依次取样2ml加入离心管中作为待测试样，离心管中预先加入0.5mol/l h2so
4 20μl，并将待测试样置于4℃冰箱中保存。
[0064]
第六步，将所取样品以12000r/min转速离心15分钟，过0.22μm针头式过滤器并转移至uplc
‑
ms/ms样品小瓶中，利用uplc
‑
ms/ms检测各时间点样品中ach的含量变化，分别为ach0和ach
30
。使用以下公式计算ache的抑制性，以百分比表示。
[0065][0066]
式中：h
ache
为测试样品对ache的抑制作用，以百分比表示；s0为在没有抑制剂的情况下(使用upw)，通过反应获得的反应动力学方程的斜率，为ln(ach
30
/ach0)；s为与测试样品反应得到的反应动力学方程式的斜率，即ln(ach
30
/ach0)。
[0067]
为了验证该方法，使用常见的有机磷农药马拉氧磷和对氧磷溶液为待测试样。以超纯水为对照组，分别配制0.3ug/l、0,8ug/l马拉氧磷和3ug/l、10ug/l对氧磷溶液，按照上述几步测定该浓度下的马拉氧磷和对氧磷的毒性。结果显示，0.3ug/l马拉氧磷的毒性为20％，0.8ug/l马拉氧磷的毒性为50％；3ug/l对氧磷的毒性为20％，10ug/l对氧磷的毒性为50％。
[0068]
对比例
[0069]
以ellman方法测定马拉氧磷和对氧磷的毒性。取20μl处理过的样品和20μl ache(5u/ml)加入3ml磷酸盐缓冲液(100mmol/l，ph＝8.0)中，并在35℃下反应20min。然后，依次添加20μlatchi(75mmol/l，用作底物)和100μldtnb(100mmol/l，作为显色剂)。混合均匀后在分光光度计中以30s的间隔在412nm下测量其3min的吸光度。酶活性表示为线性回归的光密度斜率(以od min
‑1计)。使用如下公式计算ache抑制活性，以百分比表示。
[0070][0071]
式中：h
ache
为测试样品对ache的抑制作用，以百分比表示；s0为在没有抑制剂的情况下(使用upw)通过反应获得的反应动力学方程的斜率；s为与测试样品反应得到的反应动力学方程式的斜率。
[0072]
经计算，40ug/l马拉氧磷的毒性为20％,130ug/l马拉氧磷的毒性为50％；400ug/l对氧磷的毒性为20％，1.6mg/l对氧磷的毒性为50％。结果表明，两种方法相比，案例1的方法检测限更低，灵敏度更高。
[0073]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。