一株高产木聚糖酶菌株Fusicollasp7-2及其应用的制作方法

一株高产木聚糖酶菌株fusicolla sp7
‑
2及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及一株高产木聚糖酶菌株fusicolla sp.7
‑
2及其应用。


背景技术：

2.半纤维素是植物细胞壁的主要成分，是地球上仅次于纤维素的第二大可再生资源。与纤维素不同，半纤维素的结构更为复杂，它是由两种以上的单糖以多种连接方式构成的杂多糖，且在不同的植物甚至同种植物的不同生长期，其含量和结构也存在差异。木聚糖作为半纤维素的主要成分，约占半纤维素的20％
‑
30％，因此研究木聚糖的生物转化具有重要意义。
3.木聚糖酶是分解木聚糖的酶系总称，主要作用于主链的内切
‑
1，4
‑
β
‑
d
‑
木聚糖酶和作用于侧链取代基的β
‑
d
‑
木糖苷酶、α
‑
l
‑
阿拉伯呋喃糖苷酶等。木聚糖酶具有广泛的用途，包括作为动物饲料的添加剂以提高动物对饲料中营养成分的吸收；在烘焙行业中，作为添加物可用于提高面团的质量；木聚糖的水解产物低聚木糖是很好的益生元，可增强人体内双歧杆菌和乳酸杆菌的活性；另外一种水解产物木糖可用于发酵燃料生产乙醇。目前利用微生物合成木聚糖酶是其优点在于微生物繁殖快，产物易于分离，且不同种的微生物能够产不同性质的木聚糖酶，更适合多样化的工业生产。目前发现的产木聚糖酶微生物包括细菌，真菌，放线菌及一些酵母。
4.实现木聚糖酶的高效生产，进而实现半纤维素类物质的生物降解，是当下社会发展的需求，也是目前农业废弃物的处理及转化的重点与难点，因此提供能够高产木聚糖酶的菌株对目前生物质的资源化利用非常重要。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一株可高产木聚糖酶的真菌fusicolla sp.7
‑
2。本发明所要解决的另一技术问题在于提供前述菌株制备木聚糖酶的具体实施方法。本发明所要解决的最后技术问题在于提供由前述菌株制得的木聚糖酶的具体应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.一株高产木聚糖酶的真菌fusicolla sp.7
‑
2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号cctcc no：m 2021151；保藏日期：2021年1月25日；保藏地址：中国武汉武汉大学。
8.所述的高产木聚糖酶的真菌fusicolla sp.7
‑
2在制备木聚糖酶中的应用。
9.含有所述的高产木聚糖酶的真菌fusicolla sp.7
‑
2的发酵液，所述发酵液的制备工艺为：将fusicolla sp.7
‑
2接种在液体培养基中，好氧发酵，培养获得所述的发酵液。
10.进一步地，所述液体培养基的配方为：木聚糖10g/l、蛋白胨1g/l、硫酸铵4g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l。
11.一种木聚糖酶，由所述高产木聚糖酶的真菌fusicolla sp.7
‑
2发酵制备得到。
12.制备所述的木聚糖酶的方法，包括：将fusicolla sp.7
‑
2接种在含有木聚糖的液体培养基中，好氧发酵，培养获得发酵液，离心发酵液所得上清液即为粗酶液。
13.进一步地，所述的制备木聚糖酶的方法，是将fusicolla sp.7
‑
2菌株接入种子培养基中，培养一段时间后，接种于含有木聚糖的液体培养基中发酵培养获得发酵液；离心发酵液所得上清液即为粗酶液。
14.进一步地，所述种子培养基的配方为：木聚糖10g/l、硫酸铵4g/l、蛋白胨1g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l。
15.进一步地，所述含有木聚糖的液体培养基的配方为：木聚糖10g/l、蛋白胨1g/l、硫酸铵4g/l、磷酸二氢钾1g/l、七水硫酸镁0.5g/l。
16.所述的木聚糖酶的应用，是用于降解木聚糖或半纤维素类生物质。
17.相比于现有技术，本发明的有益效果为：
18.本发明于江苏省东台市黄海森林公园的杨树凋落物中分离得到一株高产木聚糖酶的真菌fusicolla sp.7
‑
2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，本发明所提供的高产木聚糖酶菌株fusicolla sp.7
‑
2在28℃条件下，具有较高的产木聚糖酶能力，能够有效的利用木聚糖，进一步达到分解半纤维素的目的，为农业废弃物的再利用提供了一种有效手段。并且通过实验进一步发现，菌株fusicolla sp.7
‑
2能够有效利用多种碳源，易于培养。因此，本发明所提供的菌株fusicolla sp.7
‑
2具有在工业上开发生产木聚糖酶的良好应用前景。
附图说明
19.图1为fusicolla sp.7
‑
2的制备流程图；
20.图2为fusicollasp.7
‑
2分别在不同培养基上的菌落形态图，注：a是pda培养基(25℃，14d)，b是sna培养基(25℃，14d)，c是cya培养基(25℃，14d)，d是木聚糖培养基(25℃，5d)；
21.图3为fusicolla sp.7
‑
2菌株的微观形态图，图中标尺均是20μm；
22.图4为fusicolla sp.7
‑
2菌株以its序列构建的系统发育树；
23.图5为fusicolla sp.7
‑
2菌株在台盼蓝染色的木聚糖培养基水解透明圈图示(30℃，3d)；
24.图6为fusicolla sp.7
‑
2菌株产木聚糖酶能力与模式菌株里氏木霉产酶能力大小的对照图。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中如无特殊说明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
26.pda培养基：购自美国bd公司。
27.sna培养基：购自上海艾礼生物科技有限公司。
28.ypd培养基：购自美国bd公司。
29.cya培养基：购自上海康朗生物公司。
30.ff microplate
tm
(碳源微孔板)：购自biolog公司。
31.木聚糖培养基：木聚糖10g/l；硫酸铵4g/l；蛋白胨1g/l；七水硫酸镁0.5g/l；磷酸二氢钾1g/l；琼脂20g/l；台盼蓝0.04g/l。
32.种子培养基：木聚糖10g/l；硫酸铵4g/l；蛋白胨1g/l；七水硫酸镁0.5g/l；磷酸二氢钾1g/l。
33.液体发酵培养基：木聚糖10g/l；硫酸铵4g/l；蛋白胨1g/l；七水硫酸镁0.5g/l；磷酸二氢钾1g/l。
34.所有培养基均在121℃条件下，高压灭菌15min。
35.实施例1：fusicolla sp.7
‑
2的分离与鉴定
36.如图1流程图所示：本实施例所提供的高效产木聚糖酶菌株fusicolla sp.7
‑
2的分离过程如下：样本采集自江苏省东台市黄海森林公园的林场，以杨树的凋落物作为样本，用无菌剪刀将0.5g杨树叶片剪碎成2
‑
3mm的小片，置于50ml无菌管中，并加入10ml的灭菌水，振荡，充分混匀；之后对其进行梯度稀释，稀释浓度分别为10
‑2，10
‑3，10
‑4，10
‑5，将上述梯度稀释液各吸取300μl，均匀涂布于木聚糖培养基上，于30℃条件下培养3
‑
10d，期间根据水解透明圈的大小，挑选透明圈较大的单菌落进一步纯化，其中水解圈较大的菌株命名为7
‑
2。
37.1、形态学鉴定
38.选用四种培养基对菌株7
‑
2进行形态学观察，分别为pda，sna，cya以及木聚糖培养基。采用三点培养法，将菌株接种于上述四种培养基，培养基倒置，25℃条件下，培养时间为14d，其中菌株在木聚糖培养基上培养时间为5d。观察并拍照记录菌株的生长情况。如图2a所示为7
‑
2在pda培养基上的生长形态：培养14d后菌落直径达31
‑
32mm，菌落边缘平坦，中部为18
‑
19mm的圆形橙色粘分生孢子团，中心凸起有褶皱，边缘为白色，菌丝呈放射状，无孢子产生。菌株在sna培养基的生长状态如图2b所示：菌落直径达28
‑
29mm，菌落极平坦，中部有3mm左右的环状凸起，菌丝为白色且稀疏，无孢子产生。菌落在cya培养基上的生长状态如图2c所示：菌落直径达38
‑
39mm，较窄的白色环状边缘，且平坦；中部呈橙色，有凸起，无孢子产生，菌落呈黏稠状。菌落在木聚糖培养基上的生长形态如图2d所示：25℃条件下培养5d，菌落直径为8
‑
9mm，菌落中部凸起，淡橙色，有稀疏气生菌丝生成，边缘为白色。菌落的微观形态如图3所示，分生孢子为镰刀状，无隔。菌丝壁粗糙有空腔。
39.2、系统发育分析
40.菌株于ypd液体培养基中培养3天，采用ctab法提取dna，并进行多基因序列分析，包括its以及管家基因rpb2，cam，bena。pcr扩增所用引物分别为its4/its5，5f2/7cr，cal
‑
f/cal
‑
r，以及tub
‑
f/tub
‑
r。总反应体系为50μl，如下表：
41.表1 pcr反应体系/50μl
[0042][0043][0044]
表2真菌fusicolla sp.7
‑
2pcr反应条件
[0045][0046]
对pcr产物进行测序，将序列上传至ncbi数据库，利用blast
‑
n进行序列比对，下载相似度较高的序列，利用bioedit，clustalx对序列进行校对，编辑，用mega7.0软件构建系统发育树。具体的系统发育树见图4。综上所述，结合该菌株的形态学观察结果及多基因的系统发育分析，结果表明该菌株属于fusicolla属，将其命名为fusicolla sp.7
‑2[0047]
该菌株已于2021年1月25日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，保藏单位地址：中国武汉，武汉大学；邮政编码：430072)，分离命名：fusicolla sp.7
‑
2，保藏编号为cctcc no：m 2021151。
[0048]
实施例2：fusicolla sp.7
‑
2对不同碳源的利用情况的测定
[0049]
采用三点培养法将菌株接种于pda培养基，设置培养温度为30℃，培养时间为7d，按照ff microplate
tm
的说明书要求进行操作。制备一定密度的孢子悬浮液，并以100μl的接种量接种于板上每个微孔，将碳源板置于室温25℃(
±
1℃)，48h后观察并记录板上的微孔变化。
[0050]
表3所示为fusicollasp.7
‑
2对不同碳源的利用情况说明。结果表明能够被菌株fusicollasp.7
‑
2较好利用的碳源包括：d
‑
arabinose，l
‑
arabinose，glucose
‑1‑
phosphate，d
‑
ribose，d
‑
xylose，γ
‑
hydroxy
‑
butyric acid，α
‑
keto
‑
glutaric，d
‑
saccharic acid，l
‑
alanine，l
‑
asparagine，l
‑
aspartic acid，l
‑
glutamic acid，l
‑
ornithine，l
‑
pyroglutamic acid，l
‑
serine，l
‑
threonine。
[0051]
表3 fusicolla sp.7
‑
2对不同的碳源的利用情况
[0052]
[0053][0054]
实施例3：fusicolla sp.7
‑
2温度生长实验
[0055]
采用三点培养法将fusicolla sp.7
‑
2接种于pda培养基，设置不同的培养温度4℃，25℃及30℃。观察并记录菌落的生长速度，测定菌落最大生长直径。表4为菌落生长直径记录。
[0056]
表4 fusicolla sp.7
‑
2不同温度下生长实验说明
[0057]
温度/℃/14d/pda菌落直径/mm4℃11
‑
1225℃31
‑
3230℃42
‑
44
[0058]
实施例4：fusicolla sp.7
‑
2降解木聚糖能力的测定
[0059]
图5所示为台盼蓝染色的木聚糖培养基，根据图示可以看出，在30℃条件下培养5天，菌株fusicolla sp.7
‑
2的透明圈明显且菌落生长状态良好，据此判断该菌株具有良好的产木聚糖酶能力，能够很好地利用木聚糖。
[0060]
实施例5：fusicolla sp.7
‑
2产木聚糖酶能力的测定
[0061]
1、粗酶液的制备
[0062]
将菌株fusicolla sp.7
‑
2接种于种子培养基，设置培养温度28℃，摇床转速150rpm，培养48h，以4％的接种量接种于液体发酵培养基，同样条件下培养72h，将培养好的发酵液离心(4℃，10000rpm)，所得上清液即为粗酶液。
[0063]
2、木糖标准曲线的制备
[0064]
准确称取1.0000gd
‑
木糖，加入蒸馏水充分溶解，定容至100ml，即为1％(w/v)木糖标准溶液。分别吸取1％木糖标准溶液0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml于15ml试管中，蒸馏水稀释至5ml。吸取不同浓度的梯度稀释液各0.5ml于试管中，加入1.5ml乙酸
‑
乙酸钠缓冲液(ph＝4.8)，另外以0.5ml蒸馏水作为空白组对照，向所有的试管加入3mldns试剂终止反应，沸水浴中反应5min，流水快速冲洗至冷却，加入10ml蒸馏水，摇匀，在540nm处用分光光度计测定吸光度a，以吸光度a为纵坐标，木糖浓度为横坐标，绘制标准曲线并计算其线性回归方程。每组浓度设置三个平行。
[0065]
3、酶活力的测定
[0066]
制备1％木聚糖溶液：准确称取1.0000g木聚糖，并加入乙酸
‑
乙酸钠缓冲液溶解，定容至100ml。准确吸取0.5ml适当稀释的粗酶液(50℃预热2min)，快速加入1.5ml的1％木聚糖溶液(边搅拌边加入)，立即计时，50℃水浴加热，准确反应10min，迅速加入3ml dns试
剂，沸水浴加热5min，迅速用流水冲洗至冷却，适当稀释后，于540nm波长条件下测定吸光度。同时作为空白对照，先吸取0.5ml粗酶液，沸水浴反应5min使酶失活，再进行上述步骤。酶活力单位定义为：每毫升粗酶液在50℃，ph＝4.8条件下，1min水解木聚糖生成相当于1μmol木糖还原物质的量为一个酶活力单位，以iu表示。
[0067]
通过与同样培养条件下的模式菌株里氏木霉accc30590(中国农业微生物菌种保藏管理中心)进行产酶能力活性对照，结果如图6所示，本发明所提供的菌株fusicolla sp.7
‑
2所产木聚糖酶活力在液体培养条件下(28℃，150rpm)，72h后可达19iu，是同样培养条件下模式菌株里氏木霉accc30590的2倍多，说明该菌株具有高产木聚糖酶能力，具有良好的应用前景。
[0068]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。