可与油乳剂组合施用的免疫增强佐剂以及包含该佐剂的口蹄疫疫苗组合物的制作方法

1.本发明涉及用于口蹄疫疫苗的免疫增强佐剂和包含该佐剂的疫苗组合物。更具体地说，本发明涉及用于增强口蹄疫疫苗免疫性的佐剂，该佐剂可与油乳剂组合施用，以及包含该佐剂的疫苗组合物。


背景技术：

2.口蹄疫(foot
‑
and
‑
mouth disease,fmd)是一种高度传染性的病毒性疾病，主要影响偶蹄牲畜(即偶蹄目)，由于其传播速度快、死亡率高和生产力下降，给畜牧业造成重大经济损失。易感物种包括大约70种或更多的野生动物，包括反刍动物(反刍牲畜)，如牛、猪、水牛、骆驼、绵羊和山羊。这种疾病伴有高烧，已知会导致口腔、舌头、口鼻部、鼻子、乳头、蹄子和其他无毛皮肤部位起泡。
3.疫苗接种被用作控制口蹄疫发病国家的病理状况的一种手段，并在无口蹄疫国家制定应急计划方面发挥着重要作用。全世界的口蹄疫疫苗都使用死毒(灭活)疫苗，其中大多数通过随油佐剂(双油乳剂doe或单油乳剂soe)接种来提高有效性。然而，与牛相比，猪的抗体到防御水平的诱导期延迟、抗体滴度低、抗体持续时间短和免疫原性低被作为缺点指出。
4.口蹄疫疫苗目前主要集中在诱导体液免疫应答而不是细胞免疫应答，但其保护性能并不理想。口蹄疫疫苗的体液免疫应答(主要中和抗体igg)诱导期为4至7天，而细胞免疫应答诱导期为数小时至3天。因此，在口蹄疫感染早期，诱导细胞免疫应答似乎比体液免疫应答更有效地保护宿主。此外，目前的口蹄疫疫苗需要每4至6个月定期接种一次，因为接种后抗体维持期短。特别是，当肌内注射接种猪时，存在安全性低和局部副作用的缺点，如在接种部位形成损害，如在接种部位形成纤维化和肉芽肿。另一方面，到目前为止，已在大量评估研究中开展了与口蹄疫疫苗相关的研究，以确定疫苗在牲畜品种中对牛而不是对猪的有效性。然而，据报道，猪通过疫苗接种的免疫原性低于牛。因此，克服市售疫苗局限性的理想疫苗设计应满足包括以下的要求：例如，同时诱导细胞和体液免疫，通过诱导记忆应答维持高抗体滴度，确保安全性以减少局部副作用，以及根据新策略等开发针对牲畜品种优化的佐剂。
5.在国外，marcol 52、isa 206和isa 50主要用作商业化口蹄疫疫苗的佐剂。作为有效防御口蹄疫的佐剂相关研究，已进行了多种研究，如使用例如模式识别受体(prr)配体，如r848、聚(i:c)、mdp、mpl、β
‑
葡聚糖等，免疫增强剂，如菜籽油、人参根皂苷等，或者典型的商业佐剂(isa201、isa 206、emulsigen
‑
d、carbigen等)，评估口蹄疫疫苗在猪和山羊中的有效性，但是，这些佐剂尚未诱导完全免疫。
6.除口蹄疫疫苗外，还努力通过主要使用人类疫苗同时诱导细胞和体液免疫来提高免疫原性，具体而言：1)疫苗递送系统，如油乳剂、表面活性剂、脂质体、病毒体、iscoms等；2)免疫增强剂，如皂苷、氢氧化铝、磷酸钾等；3)toll样受体(tlr)、rig
‑
i样受体(rlr)、核苷
酸结合寡聚结构域(nod)样受体(nlr)和受体特异性免疫刺激剂，如c型凝集素受体(clr)配体；4)多种细胞因子如il
‑
1、il
‑
2、il
‑
6、il
‑
18、tnfα、ifnα、ifnγ和gm
‑
csf等已被研究并用作佐剂。其中一些材料目前用作预防和治疗多种人类疾病如癌症、肺结核、乙型肝炎、疟疾、流感、hiv和hsv的疫苗佐剂，或用于临床试验，但未用作口蹄疫的疫苗组合物。此外，由于多种佐剂具有不同的作用模式，因此根据可以诱导强烈的细胞和体液免疫应答的新策略，了解佐剂的免疫学机制对于fmd疫苗开发非常重要。
7.因此，本发明旨在通过开发在小鼠中具有佐剂功效的多种pprr配体和细胞因子，通过诱导细胞和体液免疫应答诱导记忆免疫应答，提出根据新策略开发fmd疫苗的可能性，以及针对不同物种(偶蹄目，如牛和猪)的优化佐剂和用于口蹄疫的包含该佐剂的疫苗组合物。
8.同时，与上述技术相关的现有技术包括题为“口蹄疫疫苗”的韩国专利公开号10
‑
2017
‑
0097116、题为“油性佐剂”的韩国专利公开号10
‑
2018
‑
002430等，但上述材料作为可用于口蹄疫疫苗中的免疫增强助剂或佐剂的效果以及包含它们的疫苗组合物尚未具体描述。
9.现有技术文献
10.专利文献
11.(专利文献1)韩国专利公开号10
‑
2017
‑
0097116
12.(专利文献2)韩国专利公开号10
‑
2018
‑
0024030
13.发明概述
14.本发明要解决的问题
15.为了解决前述问题，本发明旨在提供一种安全且优化用于偶蹄目(即偶蹄牲畜)如牛和猪以及小鼠中保护性抗体诱导的佐剂，以预防和治疗口蹄疫，以及包含该佐剂的疫苗组合物。
16.解决问题的方法
17.为了达到上述目的，本发明提供了一种包含模式识别受体(prr)配体作为活性成分的佐剂组合物。
18.此外，本发明还提供包含上述组合物的口蹄疫疫苗组合物。
19.佐剂组合物包含细胞因子作为活性成分，以及模式识别受体(prr)配体。
20.在本发明中，偶蹄目通常是指一组有两只蹄的动物，例如牛、猪、绵羊、山羊、驯鹿、水牛和骆驼，并且优选为牛和猪。
21.本发明中的口蹄疫病毒抗原可包括口蹄疫病毒o血清型、口蹄疫病毒a血清型、口蹄疫病毒亚洲1血清型、口蹄疫病毒c血清型、口蹄疫病毒sat1血清型、口蹄疫病毒sat2血清型和/或口蹄疫病毒sat3等。
22.细胞因子是细胞分泌的生物活性因子的总称，参与细胞间信号传导、细胞行为调节、免疫应答调节等，可指低分子蛋白质，如白细胞介素、淋巴因子、干扰素、细胞增殖和分化因子等。
23.本发明的细胞因子可包括il
‑
1β、il
‑
2、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
12p70、il
‑
12/23p40、il
‑
15/15r、il
‑
17a、il
‑
21、il
‑
22、il
‑
23(il
‑
12p40/il
‑
23p19)、il
‑
33、tnf
‑
α、ifn
‑
α、ifn
‑
β、ifn
‑
γ等，但它们不限于此。
24.上述细胞因子是常用的细胞因子，可以包括在大肠杆菌(e.coli)、杆状病毒、hek 293细胞等中表达的重组细胞因子。
25.在本发明的模式识别受体(prr)配体中，模式识别受体可用于识别区分病毒、细菌、真菌和寄生虫的保守分子模式，并且配体指受体的激动剂，即与受体结合并激活受体的物质。
26.prr配体可包括例如r848(tlr
‑
7/8激动剂)、tdb(mincle激动剂)、curdlan(dectin
‑
1激动剂)、furfurman(dectin
‑
2激动剂)、mdp(nod
‑
2配体)、mpla
‑
sm(tlr
‑
4)、酵母聚糖(dectin
‑
2/tlr
‑
2)、壳聚糖(nlrp炎性小体诱导剂、mr)、聚(i:c)(tlr
‑
3)、聚(da:dt)(rig
‑
1/cds激动剂、aim
‑
2炎性小体诱导剂)或基于sting的配体，但不限于此。
27.基于sting的配体可包括可激活sting信号传导的dna、rna、蛋白质、肽片段、化合物等，且优选包括c
‑
di
‑
gmp(环二胍酯)、cgamp、3'3'
‑
cgamp、c
‑
di
‑
gamp、c
‑
di
‑
amp、2'3'
‑
cgamp、10
‑
(羧甲基)9(10h)吖啶酮(cma)(10
‑
(羧甲基)9(10h)吖啶酮(cma))、5,6
‑
二甲基黄嘌呤酮
‑4‑
乙酸
‑
dmxaa、甲氧基黄酮(methoxyvone)、6,4'
‑
二甲氧基黄酮、4'
‑
甲氧基黄酮、3',6'
‑
二羟基黄酮、7,2'
‑
二羟基黄酮、大豆苷元、芒柄花素、瑞图辛7
‑
甲醚、呫吨酮等，但不限于此。
28.聚(i:c)不仅指天然存在的聚肌苷酸:聚胞苷酸的聚合物，还指其合成形式。
29.本发明的组合物可包含任选地从上述prr选择的一种或多种组分。
30.当包含上述prr配体中的两种组分时，任一种prr配体:剩余prr配体可包括1:1至3的重量比，且优选1:1至2。
31.关于施用量，即本发明中的剂量，prr配体或细胞因子不受限制，但优选包含1至100μg/ml的剂量。
32.当包含两种或多种prr配体时，每种配体可包括基于单独包含的剂量的1/2或更小范围内，优选1至30μg/ml，更优选5至15μg/ml，且最优选7至10μg/ml。
33.由于上述剂量在体内无毒的范围内，如果超出上述范围，则在给动物施用时存在体内毒性风险。
34.除上述组分外，还可包含本领域公知的油(或油乳剂)和乳化剂、凝胶等。
35.油(或油乳剂)可以是isa201、isa 61、isa50或isa 206，但不限于此。
36.乳化剂可包括公认为乳化剂的物质，如吐温或产品线的其他产品(分别为聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯和脂肪酸取代的山梨醇酐表面活性剂)，以及其他溶解度改善剂，例如peg
‑
40蓖麻油或其他聚乙二醇化氢化油，但它们并不限于此。
37.有利作用
38.本发明可提供一种安全且优化用于诱导偶蹄目(如牛、猪等)的保护性抗体的佐剂组合物，以预防和治疗包括口蹄疫在内的小核糖核酸病毒，以及包含该佐剂组合物的疫苗组合物。此外，当口蹄疫发生时，本发明可用于有效应对现场的紧急疫苗，并且可提供有效且稳定的疫苗作为偶蹄目的常规疫苗。
39.附图简述
40.图1显示根据血清型特异性抗原在体内诱导初始细胞免疫应答的结果。
41.图2a显示根据血清型特异性抗原诱导dc的固有免疫应答和细胞免疫应答的结果。
42.图2b显示根据血清型特异性抗原诱导mφ的固有免疫应答和细胞免疫应答的结
果。
43.图3显示由口蹄疫病毒(o twn 97
‑
r)抗原在小鼠中诱导的细胞因子表达谱以及在体内进行时间动力学研究的策略。
44.图4显示口蹄疫病毒(o twn 97
‑
r)抗原在小鼠中诱导的细胞因子表达谱和体内时间动力学结果(时间点：0、6、12、24、48、72、96h)。
45.图5显示用于鉴定由口蹄疫病毒(o twn 97
‑
r)抗原介导的从小鼠腹膜渗出细胞(pec)和脾细胞分离的dc、mφ、ink t细胞、γδt细胞和t细胞中的细胞因子表达的体外特征的策略。
46.图6a至6c显示由口蹄疫病毒(o twn 97
‑
r)抗原介导的从小鼠腹膜渗出细胞(pec)和脾细胞分离的dc、mφ、ink t细胞、γδt细胞和t细胞中的时间相关细胞因子表达的结果(时间点：0、6、12、24、48、72、96h)。
47.图7显示当共培养从小鼠腹膜渗出细胞(pec)和脾细胞分离的dc、ink t细胞、γδt细胞和t细胞时，鉴定口蹄疫病毒(o twn 97
‑
r)抗原介导的细胞因子表达的体外特征的策略，其中(a)显示体外研究的策略，(b)是共培养细胞的示意图。
48.图8显示共培养细胞、小鼠中的dc、ink t细胞、γδt细胞和t细胞中抗原介导的细胞因子表达的结果。
49.图9显示在fmdv感染早期确认抗原o twn 97
‑
r介导的体内防御效应的策略。
50.图10显示在fmdv感染早期对抗原o twn 97
‑
r介导的体内防御效应(小鼠存活率、体重变化)的影响。
51.图11显示细胞消耗、细胞因子中和、以及抗原介导的体内防御效应的策略。
52.图12a和12b显示抗原在消耗dc和mφ以及中和细胞因子时对宿主抵抗fmdv感染的体内防御效应(存活率、体重变化)。
53.图13显示抗原介导的刺激分子cd40、cd80和cd86的表达以及经o twn 97
‑
r抗原和刺激物(r848、壳聚糖、酵母聚糖、odn 2395、tdb、furfuman和c
‑
di
‑
gmp)处理的dc中的细胞增殖的结果。
54.图14显示通过同时激活dc和mφ中的dectin
‑
1和mincle产生的il
‑
23活性。
55.图15显示当单独或组合施用prr配体和细胞因子时，用于评价作为疫苗佐剂的潜力和对fmdv感染的短期免疫记忆效应的策略。
56.图16显示当prr配体和细胞因子单独或组合施用作为宿主抵抗fmdv感染的佐剂时的短期免疫记忆效应和体内防御效应(存活率、体重变化)。
57.图17显示用于评价由细胞因子、hsp70蛋白和prr配体介导的针对fmdv感染(长期免疫)的长期记忆应答及其在小鼠中的保护作用的策略。
58.图18a至18d显示由细胞因子、hsp70蛋白和prr配体介导的长期记忆免疫应答以及对小鼠fmdv感染的保护作用的结果。
59.图19a至19g显示细胞因子、hsp70蛋白和prr配体介导的小鼠中免疫细胞扩增的结果。
60.图20显示确认ifnα和il
‑
23介导的对多种fmdv血清型(o型、a型和亚洲1型)感染的保护作用的策略。
61.图21显示ifnα和il
‑
23介导的记忆应答以及对多种fmdv血清型(o型、a型和亚洲1
型)感染的广泛保护作用的结果。
62.图22显示prr配体处理的牛pbmc中的ldh释放(细胞毒性，96小时后)。
63.图23显示牛pbmc中由prr配体(96小时后)介导的细胞增殖的结果。
64.图24显示在牛中评价prr配体介导的佐剂效应和记忆应答的策略。
65.图25显示牛中由prr配体介导的佐剂效应和记忆应答结果。
66.图26显示经prr配体处理的猪pbmc中ldh释放(细胞毒性，96小时后)的结果。
67.图27显示猪pbmc中由prr配体介导的细胞增殖(96小时后)的结果。
68.图28显示在猪中评价prr配体介导的佐剂效应和记忆应答的策略。
69.图29显示猪中prr配体介导的佐剂效应和记忆应答的结果。
70.实施本发明的方式
71.在下文中，将通过实例和实验实例的方式详细描述本发明。
72.然而，以下实例和实验实例仅是本发明的说明性实例，本发明的内容不限于以下实例和实验实例。
73.本发明的实例和实验实例中常用的实验材料如下：
74.抗原
75.按照以下方法纯化和灭活抗原。
76.抗原由fmdv o twn 97
‑
r(p1基因库ay593823)和bhk
‑
21细胞制备。对于病毒感染，用无血清dulbecco改良eagle培养基(dmem,cellgro,manassas,va,usa)替换培养基，并在37℃5％co2气体中培养1小时以接种病毒。去除细胞外病毒。感染24小时后，在摇动培养箱中用0.003n二元乙胺处理两次24小时来灭活病毒，并用聚乙二醇(peg)6000(sigma
‑
aldrich,st.louis,mo,usa)浓缩。病毒浓缩物通过15
‑
45％蔗糖密度梯度分层，然后离心。超速离心后，刺穿离心管的底部，并收集1毫升的级分。使用侧流装置(biosign fmdv ag,princeton biomeditech,princeton,nj,usa)通过光密度确认每个级分样品中存在fmdv颗粒。在用于实验之前，将peg预处理的上清液通过zz
‑
r和bhk
‑
21细胞至少两次，以确认是否没有发生细胞病变效应(cpe)，因此，确认上清液中没有活病毒。
77.模式识别受体(ppr)配体和细胞因子
78.作为prr配体，使用invivogen(sandiego,ca,usa)，而使用mitenyibiotec(miltenyibiotec,bergischgladbach,德国)的产品作为细胞因子。油乳剂isa206购自seppic corporation(seppic inc.,paris,法国)，而氢氧化铝凝胶和quil
‑
a购自invivogen。
79.小鼠
80.购买了年龄和性别匹配的野生型c57bl/6小鼠(7周龄雌性)(kosa bio inc,gyeonggi
‑
do,韩国)。所有小鼠均在韩国农业、林业和牲畜检疫局生物安全等级为3级(absl3)的无特定无菌病原体(spf)动物设施的微型检疫笼中饲养。
81.主要实验实例
82.确认口蹄疫抗原的宿主免疫学机制的试验
83.1.根据血清型特异性抗原确认诱导内在免疫应答
[0084]1‑
1.为了确认8种抗原是否在体内诱导内在免疫应答，将每种抗原2μg注射到小鼠腹腔内，并用2ml冷pbs清洗腹腔内，并离心收集的腹腔内清洗液，然后分析上清液中细胞因
子表达模式和时间动力学。
[0085]
由于检查血清型特异性抗原引起的细胞因子表达模式和瞬时变化，高度证明促抗炎细胞因子il
‑
23和抗炎细胞因子il
‑
10的表达可通过大多数抗原竞争性诱导“细胞因子风暴”。在注射sat1
‑
bot
‑
r、sat2
‑
zim
‑
r和sat3
‑
zim
‑
r的分组中，上述两种细胞因子的表达在从48小时至72小时和96小时相似地观察到，而o pa
‑2‑
r、o twn 97
‑
r、a22
‑
r、c3
‑
resende
‑
r和亚洲1
‑
mog
‑
r分组显示il
‑
23表达显著高于il
‑
10。il
‑
23表达的特征在于，在血清型o即o pa
‑2‑
r和o twn 97
‑
r中具有相似的表达模式，即在6至12小时表达迅速增加，然后在24小时显示略低的水平。然后，表达在48至72小时时再次增强，接近12小时时的水平，然后在96小时时显著降低(图1)。
[0086]1‑
2.为了研究dc和mφ对血清型特异性fmdv抗原的先天性和细胞免疫应答，从首次用于实验的小鼠分离dc和mφ，并用各自的抗原处理，然后分析细胞培养上清液中的炎性细胞因子，如il
‑
1α、il
‑
6、il
‑
10、il
‑
12p70、il
‑
12/23p40、il
‑
23和tnfα，0、12、24、48、72和96小时后的抗炎细胞因子表达模式和细胞因子表达的时间动力学。因此，dc中的表达如下。
[0087]
关于血清型il
‑
23和il
‑
10的表达水平，sat1
‑
bot
‑
r、sat2
‑
zim
‑
r、sat3
‑
zim
‑
r、c3
‑
resende
‑
r和亚洲1
‑
mog
‑
r处理组的细胞因子表达水平基本相似。另一方面，在a22
‑
r、o pa
‑2‑
r和o twn 97
‑
r的情况下，il
‑
23的表达水平显著高于il
‑
10。此外，il
‑
6的最大表达水平较高，如593至753pg/ml，其余细胞因子的表达水平约为50至200pg/ml。在大多数抗原处理组中，il
‑
23、il
‑
10和il
‑
6的表达水平在12小时时相互交叉，最初增加的il
‑
6的表达显示出由抗炎细胞因子il
‑
10下调的趋势，而il
‑
23则显示持续上调的趋势(图2a)。
[0088]
mφ中的整体细胞因子表达与dc中的细胞因子表达相似，如图2a所示。此外，关于血清型细胞因子表达的变化，观察到除亚洲1
‑
mog
‑
r外的大多数抗原处理细胞中的il
‑
23表达水平在48小时后显著高于il
‑
10。在sat1
‑
bot
‑
r、sat2
‑
zim
‑
r、sat3
‑
zim
‑
r和c3
‑
resende
‑
r处理组中，表达水平依次为il
‑
10>il
‑
6>il
‑
23直至12小时。然而，在上述细胞因子的表达水平在12至48小时交叉后，48小时后表达模式变化，顺序为il
‑
23>il
‑
10>il
‑
6。另一方面，在a22
‑
r、o pa
‑2‑
r和o twn 97
‑
r的情况下，细胞因子表达水平较高，直至12小时，顺序为il
‑
6>il
‑
23和il
‑
10，在这些细胞因子的表达水平在12到24小时交叉后，24小时后表达模式变化，顺序为il
‑
23>il
‑
6和il
‑
10(图2b)。
[0089]
从上述结果，确认了在进行血清型特异性抗原处理的早期，dc和mφ被有效刺激。此外，已证明炎性细胞因子(即il
‑
23和il
‑
6)，以及抗炎细胞因子(即il
‑
10)主要由经刺激的细胞表达。
[0090]
2.体内抗原介导的细胞因子变化的测量
[0091]
此试验方法与图3所示相同，试图通过测量细胞因子的变化来确认免疫细胞的刺激。
[0092]
作为实验的结果，il
‑
1β(il
‑
1贝塔)和il
‑
6最初发生反应，并且大部分随时间推移受到刺激。il
‑
12/23p40、il
‑
17a和tnfα(tnf阿尔发)在12至24小时之间被刺激，而il
‑
1β(il
‑
1β)、il
‑
2、il
‑
10、il
‑
15/15r和il
‑
33在72小时内被完全刺激。此外，在il
‑
4、il
‑
9、il
‑
12p70、il
‑
21、il
‑
22和ifnγ(ifn伽玛)的情况下，应答增加直至96小时。由于细胞中被刺激的细胞因子不同，可以推测哪些细胞起作用(图4)。
[0093]
3.从小鼠腹膜渗出细胞(pec)和脾细胞分离的免疫细胞的抗原介导的体外细胞因
子表达谱的变化的测量
[0094]
此试验方法与图5所示相同。从小鼠腹膜渗出细胞(pec)和脾细胞中分离免疫细胞(dc、mφ、ink t细胞、γδt细胞和t细胞)，然后测量细胞因子表达的变化，以确认对特异性免疫细胞的刺激。具体而言，用o twn 97
‑
r抗原(2μg)处理细胞，并从pec和脾脏分离细胞(dc、mφ、ink t细胞、γδt细胞和t细胞)，然后测量随时间的变化(0、6、12、24、48、72、96h)。
[0095]
作为实验的结果，与dc反应的细胞因子il
‑
12p70、il
‑
12/23总p40、il
‑
10、il
‑
5和tnfα的细胞因子反应性在最初6至12小时内趋于较高。此外，可以确认il
‑
12/23p40和il
‑
23在24至48小时时有表达增加的趋势(图6a至6c)。
[0096]
4.通过在分选细胞中同时培养测量o twn 97
‑
r抗原介导的细胞因子表达谱的体外变化
[0097]
为了分选细胞，此试验方法与主要实验实例2中的相同，分离并混合免疫细胞(dc、mφ、ink t细胞、γδt细胞和t细胞)，然后测量o twn97
‑
r抗原介导的细胞因子的变化，以确认免疫细胞的刺激(图7)。具体而言，用o twn 97
‑
r抗原(2μg)处理细胞，并在抗原刺激48小时后测量其结果。
[0098]
作为实验的结果，确认il
‑
2、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
12/23p40、il
‑
15/15r、il
‑
21、il
‑
23、ifnγ等仅在添加dc时显示出反应性。另一方面，已确认即使不添加dc，il
‑
β、il
‑
6、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
12p70、il
‑
17a、il
‑
22、il
‑
33、tnfα等也显示反应性(图8)。
[0099]
5.通过先天免疫应答的抗原刺激的防御机制分析
[0100]5‑
1.图9显示一种研究策略，用于确认激活先天免疫应答和细胞免疫应答的o twn 97
‑
r抗原在感染fmd病毒时是否确实显示防御作用。首先，为了确定抗原的接种期，小鼠腹腔注射2μg抗原，小鼠分别在1、3、5和7dpi时感染病毒，然后监测其存活率和体重变化，直至7dpc。此后，为了确认抗原的剂量特异性反应，将2、5和10μg抗原注射到同一途径，小鼠在5dpi时感染病毒，并监测存活率和体重变化，直到7dpc。
[0101]
作为结果，5dpi组显示40％的防御率，而剂量增加到5、10μg的组显示100％的存活率而没有体重减轻(图10)。
[0102]5‑
2.为了保护宿主免受口蹄疫感染，试图确认dc和mφ中的哪些细胞重要，或者哪些细胞因子显示重要作用(图11)。
[0103]
用抗体来消耗细胞或中和细胞因子，24小时后注射抗原，5天后(5dpi)感染病毒以确认防御性能。作为结果，确认il
‑
23p19、tnfα和il
‑
10起重要作用。施用针对炎性细胞因子il
‑
23p19的抗体组的所有小鼠在第5天(5dpc)死亡，施用tnfα抗体组的所有小鼠在第6天(6dpc)死亡，而施用针对抗炎细胞因子il
‑
10的抗体组的存活率为100％，未观察到体重减轻。在通过特异性抗体进行的抗原诱导的细胞因子中和实验中，关于il
‑
23、tnfα、il
‑
1β、il
‑
6和il
‑
10，这些细胞因子在实验中被鉴定为在保护宿主免受fmdv攻击方面起重要作用，这些细胞因子的防御作用分别得到确认。首先，将每种细胞因子以5μg/100μl pbs的量腹腔注射到小鼠体内，6小时后用o
‑
vet(me
‑
sa)感染小鼠，随后监测存活率和体重变化，直到7dpc。另一方面，阴性对照组以相同途径施用100μl pbs进行比较。结果，在注射il
‑
23后，确认fmdv感染组小鼠的存活率为100％，证明完全保护。此外，与感染前相比，未观察到体重的变化。
[0104]
在il
‑
1α和tnfα处理组的情况下，存活率较低。此外，虽然体重减少了约30％，但死
亡往往会推迟。另一方面，在il
‑
6和il
‑
10处理组的情况下，小鼠在感染早期死亡，证明没有防御作用。
[0105]
从以上结果来看，认为细胞因子il
‑
23在宿主防御fmdv攻击中起着最重要的作用。il
‑
1α和tnfα也弱于il
‑
23，但它们被确定为在病毒感染开始时部分有助于宿主防御。
[0106]
另一方面，在il
‑
10作为抗炎细胞因子的情况下，同时注射5μg的il
‑
10和抗原，以及单独注射il
‑
10，以比较两者之间的存活率和体重变化。
[0107]
为了抑制抗原刺激后高水平表达的il
‑
23、il
‑
1α、il
‑
6和tnfα，用特异性小鼠单克隆抗体中和这些细胞因子中的每一种，同时注射il
‑
10和抗原，然后在24小时进行病毒感染。注射每种抗体的同种型对照抗体，并作为对照组进行比较。结果，与il
‑
10处理组类似，fmdv感染后第4天(4dpc)的存活率降至20％，所有动物在第6天(6dpc)死亡，体重变化也降低了约30％。因此，在fmdc感染的早期，il
‑
10似乎抑制了宿主内的免疫应答，以致增加对病毒的易感性，从而恶化宿主防御。
[0108]
从以上结果来看，认为如果il
‑
23作为一种炎性细胞因子的表达在fmdv感染早期增加，同时抑制il
‑
10的产生，体内细胞免疫应答可被激活，从而更有效地保护宿主。
[0109]
此外，为了确认il
‑
23作为佐剂(疫苗佐剂)是否显示免疫刺激活性，将2.5μg il
‑
23与等量抗原组合施用。
[0110]
结果，仅施用2.5μg抗原组的小鼠显示存活率为40％，而同时施用il
‑
23和抗原组的小鼠存活率为80％或更高，第2至3天(2dpc)体重减轻不明显，然后显示恢复的趋势。因此，确认了il
‑
23的辅佐作用改善对fmdv感染的防御作用。
[0111]
另一方面，为了确认抗原刺激的dc和mφ在fmdv感染初期是否确实在宿主防御中发挥重要作用，在抗原施用6小时后将活化的dc和mφ分离并移植到首次用于实验的小鼠体内，1小时后进行病毒感染。然后，观察存活率和体重变化，直至7dpc。
[0112]
结果，确认在活化的dc和mφ移植组中，所有小鼠均100％存活，并且未观察到体重变化(图12a和12b)。
[0113]
从以上结果来看，预期抗原刺激dc和mφ在fmdv感染初期促进这些细胞分泌炎性细胞因子、趋化因子和共刺激分子，并通过向t细胞呈递抗原在保护宿主方面发挥重要作用。
[0114]
检查抗原介导的共刺激分子在dc中的表达的结果如下(图13)。在单独使用抗原或将prr配体添加到抗原作为佐剂处理后，通过检测cd40、cd80和cd86的表达，在分别添加r848、酵母聚糖、tdb和c
‑
di
‑
gmp的治疗组中观察到高表达。因此，尽管仅用抗原刺激dc以增加共刺激分子的表达，但预期使用prr配体作为佐剂处理可更强烈地刺激dc，从而有效地将抗原呈递给t细胞。
[0115]
之前，在dc和mφ中观察到o twn 97
‑
r ag衍生的细胞因子的变化。为了研究哪种prr配体信号启动这些细胞因子的表达，从首次用于实验的小鼠的pec中分离dc和mφ，并用o twn 97
‑
r ag处理。然后，在处理6小时后，采集细胞样本并制备rna，然后通过qrt
‑
pcr确认prr配体的基因表达水平。
[0116]
因此，如图14所示，dectin1、dectin2、tlr7和tlr8等在dc中的表达较高，而mincle和sting在mφ中的表达较高，tlr2、tlr4、nlrp3等的表达也相对较高。从dc和mφ的整体基因表达水平来看，prr配体基因表达水平较高，顺序为dectin1>mincle>dectin2>tlr7>
sting>tlr8。
[0117]
从以上结果可以理解，o twn 97
‑
r ag同时刺激细胞内在的prr配体，如tlr7、tlr8、sting等，以及细胞外在的prr配体，如dectin1、dectin2、mincle等，从而增强apc如dc和mφ中的先天免疫应答以及细胞免疫应答。此外，可促进th细胞向th1、th2或th17细胞的分化过程，从而最终促进t细胞的激活。因此，预期上述物质可诱导细胞免疫应答，并在fmdv感染早期的宿主防御中发挥决定性作用。
[0118]
<实施例1>通过小鼠中的功效评估筛选候选佐剂
[0119]1‑
1.prr配体和细胞因子作为疫苗佐剂的潜力和记忆效应分析
[0120]
为了评估prr配体和重组细胞因子作为疫苗佐剂的潜力以及对fmdv感染的记忆效应，按图15所示测试了表1的材料。
[0121]
表1
[0122]
prr配体和细胞因子介导的小鼠佐剂作用评估的实验设计
[0123][0124]
当单独施用prr配体和细胞因子时，存活率较高，顺序为ifnα>il
‑
23>c
‑
di
‑
gmp施用组，如图16(a)所示。此外，在图16(b)的体重变化的ifnα的情况下，基本上未观察到体重变化。此外，图16(c)显示与prr配体组合施用时的存活率。
[0125]
存活率很高，顺序为r848 tdb>tdb c
‑
di
‑
gmp>furfurman tdb，同时仅观察到体重
变化小于约20％的范围内的体重减轻(图16(d))。
[0126]
从以上结果可以看出，与单独施用prr配体相比，与细胞因子组合施用时，小鼠更有效地免受fmdv感染。特别是，确定了tlr
‑
7/8、mincle、dectin
‑
2、sting等的组合具有更高的疫苗佐剂潜力。
[0127]1‑
2.prr配体和细胞因子介导的小鼠记忆免疫应答
[0128]
为了评估prr配体和重组细胞因子作为疫苗佐剂的潜力以及对fmdv感染的记忆效应，按照图17所示的策略进行实验。本文使用的口蹄疫抗原为o twn 97
‑
r，阳性对照(pc)组的疫苗组成如下：o tnw97
‑
r ag(15μg/剂量/ml，1/160剂量)、isa206(50％，w/w)、10％al(oh)3、15μg/小鼠quil
‑
a。
[0129]
小鼠在0dpv(接种后天数)i.m.(肌肉内接种)第1次接种，然后在28天后(接种后第28天，dpv)进行第2次接种(增强)。此后，在第56天(接种后第56天，dpv)，对小鼠腹腔内施用fmdv(o vet 2013的100ld
50
，me
‑
sa拓扑型)，然后监测存活率和体重变化，直到第7天(攻击后的天数，dpc)。此外，为了确认诱导细胞和体液免疫应答的能力，在0、28和56dpv对小鼠血清和腹膜渗出细胞(pec)进行取样，然后将其用于分析，例如sp elisa和病毒中和滴度(vn滴度、中和抗体)。
[0130]
作为实验的结果，如图18a所示，与对照组相比，在28dpv时，ifnα、ifnγ il
‑
2 tnfα、il
‑
15 il
‑
18、tdb c
‑
di
‑
gmp和r848 c
‑
di
‑
gmp施用组的抗体滴度显著增加。此外，在56dpv时，所有细胞因子和prr配体佐剂施用组的抗体滴度均显著较高。特别是在ifnα的情况下，抗体滴度一直保持在高水平，直到56dpv。在il
‑
23施用组的情况下，在先前的实验中，细胞免疫应答显著增加，观察到抗体滴度也很高，从而表明可以有效诱导体液免疫应答。
[0131]
同时，即使在涉及t细胞活性和t细胞介导的细胞和体液免疫应答的ifnγ il
‑
2 tnfα施用组的情况下，抗体滴度在28dpv后保持稳定的高水平，而作为佐剂涉及黏膜免疫的il
‑
15 il
‑
18施用组也显示出高抗体滴度。此外，当施用已知涉及长期免疫的hsp70时，观察到抗体滴度相对增加至较高水平，尽管其略低于其他佐剂施用组。此外，在prr配体施用组的情况下，所有组均显示高抗体滴度。
[0132]
为了观察由接种本身引起的体重变化，在接种后的8周(56dpv)内每周监测一次体重变化(图18b)。因此，ifnγ il
‑
2 tnfα组合施用组在7dpv时体重略有减轻，但无显著差异。此外，由于重组细胞因子的剂量(总剂量15μg)略高于其他组(总剂量5至10μg)，因此推测这一结果。
[0133]
在接种疫苗后第56天(56dpv)，通过观察感染o vet 2013后的存活率(图18c)和体重(bw)变化(图18d)，阴性对照组小鼠在第4天100％死亡，而阳性对照组小鼠显示40％存活的趋势。另一方面，给予prr配体和细胞因子佐剂组的小鼠存活率为100％，但没有观察到体重减轻。
[0134]
因此，当用这些细胞因子和prr配体作佐剂时，预期疫苗诱导的细胞免疫应答和体液免疫应答都能有效地诱导，从而显著促进宿主防御。
[0135]
为了观察细胞因子和prr配体对细胞和体液免疫应答的诱导作用，通过facs分析涉及这些免疫应答的细胞的扩增情况。在图19a中，确认了cd3

cd4

t细胞的数量，并在添加ifnα、hsp70、r848 tdb、tdb c
‑
di
‑
gmp等的组中观察到细胞扩增。图19b显示cd3

cd8

t细胞群。与cd4

t细胞相比，细胞总数似乎较低，ifnα处理组在28dpv时显示显著性。
[0136]
在图19c中，确认了cd4

cd8

t细胞的扩增。在28dpv时，除hsp70外，所有细胞因子和prr配体添加组的细胞数量均显著增加，而在56dpv时，细胞数量有显著减少的趋势。由于观察到cd44
高
cd62
低
t细胞(称为记忆t细胞的标志物)的扩增(图19d)，与28dpv相比，在56dpv时该群体迅速增加。此外，在28dpv时，prr配体比细胞因子更显著地诱导记忆t细胞扩增，而在56dpv时，所有添加佐剂组的细胞数量均增加。因此，预期这些佐剂有效诱导记忆性t细胞，从而促进细胞和体液免疫应答的刺激。
[0137]
在图19e中，观察到cd44
高
cd27
低
γδt细胞(记忆γδt细胞)的表达。已知小鼠体内存在约5％的γδt细胞，但由于添加佐剂，这些细胞的数量增加了约8％至10％，而在28和56dpv之间未观察到显著差异。因此，可以看出，添加佐剂不仅对诱导初始细胞免疫应答有效，而且对诱导中期和长期细胞免疫应答也有效。
[0138]
图19f显示记忆b细胞(cd3
‑
cd44

cd27

b细胞)的扩增。在28dpv时，il
‑
23、r848 tdb、tdb c
‑
di
‑
gmp显示细胞数量显著增加，与28dpv时相比，56dpv时细胞数量普遍增加，所有细胞因子和prr配体添加组中的记忆b细胞均确认显著扩增。特别是，il
‑
23、ifnγ il
‑
2 tnfα、il
‑
15 il
‑
18、r848 tdb和r848 c
‑
di
‑
gmp添加组显示显著性p<0.001或更低。
[0139]
图19g显示确认称为记忆样nk细胞的cd3
‑
cd335(nkp46)

cd27

细胞扩增的结果。具体而言，ifnα施用组显示出显著高的细胞数量，从结果来看，ifnα似乎能有效刺激参与先天免疫应答的nk细胞，并且可以在诱导记忆应答方面达到优异的效果。
[0140]1‑
3.细胞因子作为佐剂的潜力和对小鼠中多种血清型的fmdv感染的保护作用
[0141]
为了观察细胞因子，特别是ifnα和il
‑
23作为疫苗佐剂的潜力、记忆应答以及对多种血清型的fmdv感染的防御作用，进行了如图20所示的动物实验。
[0142]
为了确认上述效果，o vet(o vet 2013)、o jc(o jincheon 2014)、amalay(amalay 97)、亚洲shamir
‑
r(亚洲1shamir的全基因组重组克隆)和pc组仅注射isa206油免疫增强剂，nc为阴性对照组。
[0143]
作为实验的结果，ifnα和il
‑
23作为佐剂的施用组对o vet2013、ojc、a malay 97和亚洲1shamir的攻击几乎表现出完全的防御能力，而体重变化与病毒攻击前相比几乎没有降低(图21)。
[0144]
因此，确认了ifnα和il
‑
23在体内的记忆功能，并预期无论疫苗中所含抗原病毒之间的特异性如何，上述物质都可以有效地保护宿主免受多种血清型的fmdv攻击。
[0145]
<实施例2>牲畜品种对候选佐剂反应性的评估
[0146]
基于上述小鼠的实验结果，使用下表2的佐剂组合物进行实验，以观察牛和猪免疫细胞中prr配体、hsp70和细胞因子介导的细胞增殖和细胞毒性。
[0147]
表2
[0148]
[0149][0150]
pbmc的分离
[0151]
猪和牛的全血由animal sanitation laboratory in gyeonggi province 捐献。使用bd
‑
vaccutainer肝素管(bd,becton,dickinson and company,franklin lakes,nj,usa)收集15ml全血，并通过ficoll
‑
paque
tm plus(ge healthcare bio
‑
sciences corp.,piscataway,nj,usa)密度梯度离心收集外周血单核细胞(pbmc)。用ack(氯化铵钾)裂解缓冲液(gibco,carlsbad,ca,usa)处理裂解残留红细胞。
[0152]
将溶液悬浮在添加2％fbs(gibco,carlsbad,ca,usa)的无ca
2
和mg
2
(gibco,carlsbad,ca,usa)的dulbecco's pbs中，并通过体积流量计(macsquant analyzer,
miltenyi biotec,bergisch gladbach,德国)计数细胞数。所有细胞在使用前立即新鲜分离，而不使用冷冻保存的细胞。
[0153]
将纯化的pbmc重新悬浮在补充10％胎牛血清(fbs)(hyclone,logan,utah,usa)、3mm l
‑
谷氨酰胺(sigma
‑
aldrich,usa)和100u/ml青霉素
‑
链霉素(sigma
‑
aldrich,st.louis,mo,usa)的rpmi
‑
1640(gibco,carlsbad,ca,usa；st.louis,missouri)中，然后在37℃、5％co2下培养，然后将每孔1
×
104个细胞黏附到96孔板上。培养3小时后，用无血清培养基替换培养基，然后用多种prr配体和细胞因子刺激。
[0154]
prr配体和细胞因子处理
[0155]
用表2所示的prr配体和细胞因子处理猪和牛pbmc。96小时后，收集细胞培养基(上清液)，观察乳酸脱氢酶(ldh)分泌引起的细胞毒性和5
‑
溴
‑
2'
‑
脱氧尿苷(brdu)掺入引起的细胞增殖。
[0156]
猪和牛pbmc中prr配体和细胞因子介导的ldh分泌的测量
[0157]
经处理的猪和牛pbmc上清液中的细胞毒性水平如上所述。ldh分泌分析按照制造商的方案，使用cytotox 96非放射性细胞毒性测定(promega)进行。
[0158]
ldh分泌百分比计算如下：ldh分泌百分比＝100x(未处理对照的吸光度读数)/(最大ldh发射对照的吸光度
‑
无吸光度对照的吸光度)
[0159]
使用试剂盒中的裂解缓冲液裂解细胞，并使用裂解缓冲液处理细胞的上清液确定最大ldh释放对照。
[0160]
猪和牛pbmc中brdu掺入分析
[0161]
使用brdu细胞增殖测定试剂盒(cell signaling technology,beverly,ma,usa)评估prr配体和细胞因子对猪和牛pbmc增殖的影响，其基于dna合成过程中brdu的掺入。
[0162]
将10μm brdu添加到细胞培养液中，并在37℃培养4小时。然后将细胞固定并与抗brdu小鼠单克隆抗体和辣根过氧化物酶(hrp)缀合的山羊抗小鼠抗体孵育。用显色底物四甲基联苯胺来显色。在450/550nm的双波长下测量吸光度。
[0163]
疫苗接种和采样
[0164]
进行本实验来在猪和牛中观察prr配体作为佐剂的潜力、细胞和体液免疫应答的诱导以及长期免疫效应。使用o twn 97
‑
r作为口蹄疫抗原，阳性对照组疫苗组成如下：o tnw 97
‑
r ag(15μg/剂量/ml)、isa206(50％，w/w)、10％al(oh)3、150μg/剂量/ml quil
‑
a。
[0165]
通过动物颈部的深部肌肉注射途径，每隔28天施用1ml疫苗两次(0dpv，28dpv)。分别在0、14、28、42、56、70、84dpv采集猪的血样，以及在0、14、28、56、84、112、140、168dpv采集牛的血样。
[0166]
每天监测动物的体温和食欲。血清样品在
‑
80℃储存，直到进行试验。
[0167]
血清学试验
[0168]
1)用于检测结构蛋白抗体的elisa(酶联免疫吸附测定法)
[0169]
为了检测血清中的结构蛋白(sp)抗体，使用了priocheck fmdv o型(prionics,瑞士)。将elisa板的吸光度转换为抑制百分比(pi)值。如果pi值为50％或更高，则认为该动物为抗体阳性。
[0170]
2)病毒中和试验
[0171]
按照oie手册进行病毒中和试验。通过在56℃的血清中浸泡30分钟来激活病毒。通
过调整细胞密度以形成70％的单层，制备1:4至1:512的2倍稀释血清样品。稀释血清样品在37℃与100倍组织培养感染剂量(tcid)50/0.5ml同源病毒孵育1小时。1小时后，将lf
‑
bk(牛肾)细胞悬液添加到所有孔中。2至3天后，测量cpe以通过滴度抗体稀释的log 10中和100tcid
50
的病毒的滴度。
[0172]2‑
1.牛候选佐剂的反应性评估结果
[0173]
作为确认ldh(乳酸脱氢酶)的分泌以观察prr配体、细胞因子、凝胶、皂苷等分别对牛源pbmc的细胞毒性的结果，发现处理组本身的细胞毒性较低。因此，在本实验中使用的佐剂浓度下没有毒性(图22(a))。图22(b)显示了分别使用prr配体和细胞因子(与疫苗佐剂油 凝胶 皂苷混合)处理牛源pbmc后观察细胞毒性的结果。即使在此时，与对照组相比，也未观察到佐剂混合物引起的细胞毒性。
[0174]
另一方面，即使在与prr配体组合进行联合处理后，也未观察到上述佐剂的细胞毒性(图22(c))。此外，即使将prr配体组合，也与疫苗佐剂油 凝胶 皂苷混合，然后用于处理，也未观察到细胞毒性(图22(d))。
[0175]
图23(a)显示了分别用prr配体和细胞因子、油、凝胶、皂苷和油 凝胶 皂苷处理牛源pbmc 96小时后通过brdu掺入观察细胞增殖的结果。与对照组相比，所有prr配体处理组的细胞增殖都有所增加，特别是发现curdlan、tdb、c
‑
di
‑
gmp、r848和furfarman的作用很大。
[0176]
另一方面，凝胶和皂苷的作用在96小时时不显著。此外，将每个prr配体和细胞因子与油 凝胶 皂苷混合并使用其进行处理后，观察细胞增殖。作为实验的结果，与对照组相比，与油 凝胶 皂苷混合的所有prr配体中的细胞增殖增加，但与未添加油 凝胶 皂苷(w/o)的情况相比，细胞增殖水平较低(图23(b))。
[0177]
图23(c)显示通过组合prr配体观察细胞增殖的结果。与对照组相比，所有处理组的细胞增殖均增加，尤其是r848 tdb、furfurman tdb和tdb c
‑
di
‑
gmp处理组的显示更高的值。从这个结果来看，这些prr配体的组合似乎有效地刺激牛pbmc，从而增强细胞增殖和刺激免疫应答。此外，这些佐剂引起的牛源pbmc的免疫应答明显高于猪源pbmc，因此，牛免疫细胞似乎比猪免疫细胞更敏感地应答。
[0178]
同时，作为在用prr配体与油 凝胶 皂苷组合的混合物处理牛源pbmc后96小时观察到细胞增殖的结果，与对照组相比，所有prr配体和油 凝胶 皂苷混合物处理组的细胞增殖水平增加。然而，上述水平低于不添加油 凝胶 皂苷(w/o)(图23(d))。从与猪免疫细胞的结果基本相似的上述结果来看，认为当直接用prr配体处理牛免疫细胞时，细胞比使用prr配体和油 皂苷 凝胶处理时受到更快的刺激，从而促进细胞增殖并启动免疫应答。
[0179]
对于在使用牛pbmc的prr配体筛选实验中显示出显著结果的候选物质，采用图24所示的策略进行动物实验，以观察实际现场牛中prr配体介导的佐剂效应和记忆应答。在现场试验中，使用5个月大的牛(fmd抗体血清阴性)，将牛分为3组(n＝5/组)。用未接种疫苗的动物作为阴性对照组，试验期间在密闭空间隔离牛。
[0180]
作为通过sp o elisa确认ab滴度(抗体滴度)的结果，prr配体添加组在接种后28天(28dpv)的抗体滴度显著高于对照组。此外，在增强后140天(140dpv)内保持高水平(图25(a))。此外，作为确认vn滴度(病毒中和滴度)的结果，prr配体添加组显示出显著高于14dpv对照组的值(p<0.01)，并且从那时起至140dpv维持非常高的水平(p<0.001)(图25(b))。
[0181]
从上述结果来看，当添加r848 tdb、curdlan c
‑
di
‑
gmp等作为疫苗佐剂时，天然和细胞免疫应答被有效刺激，进而持续刺激体液免疫应答，从而预期有助于宿主防御fmdv感染。
[0182]2‑
2.候选佐剂在猪中的反应性和安全性的评估
[0183]
为了观察prr配体和细胞因子、油、凝胶、皂苷和油 凝胶 皂苷分别对猪源pbmc的细胞毒性，确认了ldh(乳酸脱氢酶)的分泌。因此，发现处理组本身的细胞毒性较低，并且在本实验中使用的佐剂浓度下没有细胞毒性(图26(a))。
[0184]
图26(b)显示用prr配体和细胞因子与油 凝胶 皂苷的混合物作为疫苗佐剂处理猪源pbmc后观察细胞毒性的结果。即使在此时，与对照组相比，也未观察到佐剂混合物的细胞毒性。
[0185]
另一方面，即使在使用组合prr配体处理猪源pbmc后确认细胞毒性，也未观察到这些佐剂的细胞毒性(图26(c))。此外，即使使用组合prr配体和疫苗佐剂(即油 凝胶 皂苷)的混合物处理猪源pbmc后，也显示出类似的趋势(图26(d))。
[0186]
图27(a)显示，作为在分别使用prr配体和细胞因子、油、凝胶、皂苷和油 凝胶 皂苷处理猪源pbmc后96小时，通过在猪源pbmc中掺入brdu观察细胞增殖的结果，与对照组相比，所有prr配体处理组的细胞增殖均增加，尤其是tdb和c
‑
di
‑
gmp的作用最大。另一方面，凝胶和皂苷的作用在96小时时不显著。
[0187]
作为在用prr配体和细胞因子与油 凝胶 皂苷的混合物处理猪源pbmc后96小时观察细胞增殖的结果，与对照组相比，所有prr配体和油 凝胶 皂苷混合物处理组的细胞增殖均增加，然而，其水平低于不添加油 凝胶 皂苷(w/o)(图27(b))。图27(c)显示通过prr配体组合观察细胞增殖的结果。与对照组相比，所有处理组的细胞增殖均增加，尤其是r848 tdb、furfurman tdb和tdb c
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gmp处理组显示更高的值。从这些结果来看，认为这些prr配体的组合可有效刺激猪pbmc，从而增强细胞增殖和刺激免疫应答。另一方面，作为在用组合prr配体与油 凝胶 皂苷的混合物处理猪源pbmc后96小时观察细胞增殖的结果，与对照组相比，所有prr配体和油 凝胶 皂苷混合物处理组的细胞增殖水平均增加，但低于不添加油 凝胶 皂苷(w/o)(图27(d))。从上述结果来看，当猪免疫细胞单独使用prr配体处理而不使用任何油佐剂(油乳剂)时，细胞的刺激速度可比使用prr配体和油 皂苷 凝胶处理时更快，从而促进细胞扩散并启动免疫应答。
[0188]
对于在使用猪pbmc的prr配体筛选实验中显示出显著结果的候选物质，进行如下动物实验，以观察实际现场猪中prr配体介导的佐剂效应和记忆应答(图28)。对于现场试验，采用10周龄猪(fmd抗体血清阴性)，分为4组(n＝5/组)。用未接种疫苗的动物作为阴性对照组，研究期间在密闭空间隔离猪。
[0189]
为了确认通过疫苗接种产生的抗体滴度，使用猪血清进行sp oelisa。因此，如图29(a)所示，与对照组相比，tdb c
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gmp施用组在14dpv时的抗体滴度显著增加(p<0.001)。此外，在28dpv时，与对照组相比，所有prr配体施用组的抗体滴度均显著增加(p<0.001)。特别是，在tdb c
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gmp添加组的情况下，发现抗体滴度显著高于对照组，持续维持到84dpv。猪初次接种的高抗体滴度被解释为prr配体有效激活先天和细胞免疫应答，并强烈诱导体液免疫应答。
[0190]
此外，认为28dpv的二次疫苗接种(增强)可有效诱导由一次疫苗接种刺激的免疫
细胞的“回忆刺激”，同时维持长期免疫。此外，作为确认vn滴度的结果，tdb c
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gmp(p<0.001)、r848 tdb(p<0.01)添加组在14dpv时的vn滴度显著高于对照组。此外，在28dpv时，所有prr添加组的vn滴度均显著高于对照组(p<0.001)。特别是，tdb c
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gmp添加组保持较高的vn滴度直至84dpv，而r848 tdb添加组从早期(14dpv)到中期(42dpv)显示出良好的免疫增强效应。然而，此后上述效应表现出略有下降的趋势。
[0191]
此外，在furfurman tdb添加组的情况下，vn滴度缓慢增加，直到最初的14dpv，但vn滴度从28dpv到84dpv显著高于对照组。
[0192]
prr配体 添加剂组从14dpv开始显示出显著高于对照组的水平，即使直到84dpv，与对照组相比仍保持显著较高的水平(图29(b))。从上述结果来看，预期当r848 tdb、furfurman tdb和tdb c
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gmp作为佐剂添加到疫苗中时，疫苗可以有效地刺激先天和细胞免疫应答，并持续刺激体液免疫应答，从而显著促进宿主防御fmdv感染。此外，预期本发明可能根据新策略用于fmdv疫苗的开发。