黄精果寡糖及其制剂和用途的制作方法

1.本发明涉及天然植物化学领域。


背景技术：

2.黄精(pch)属于百合科，是一种药食同源的植物。用于治疗和预防咳嗽、疲劳、头晕和呼吸系统问题。pch含有多种有效成分，具有抗衰老、抗肿瘤、抗菌、抗病毒、降低血糖、血脂、增强免疫力、改善记忆等作用。因此，pch的研究和新剂型的开发具有重要的价值。
3.据报道，pch含有丰富的多糖化合物(pchp)。前期研究表明，pchp对人宫颈癌hela细胞具有抗癌作用。研究人员使用四种pchp在体外研究它们对hela细胞增殖、细胞毒性、caspase
‑
3活性、细胞周期和凋亡的影响。研究结果表明，随着pchp浓度的增加，hela细胞增殖明显受到抑制，细胞毒性显著增加，促进hela细胞凋亡。除了抗肿瘤活性外，还证明了pch多糖的抗氧化和抗菌潜能。通过dpph自由基清除活性、还原能力测定、abts自由基清除活性、羟基自由基清除活性、抑菌活性(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和鼠伤寒葡萄球菌)试验表明，pchp具有良好的抗氧化和抗菌活性。验证了pchp对枯草芽孢杆菌的抑菌活性。目前的研究大多集中在黄精多糖的研究上，对黄精果寡糖(pfos)药理研究较少。


技术实现要素：

4.创口是皮肤及其深部组织连续性中断所形成的裂口。目前较为常见的创口有压力性溃疡、烧伤、物理创伤、糖尿病溃疡(或糖尿病伤口)。
5.黄精果寡糖目前并未见有对于创口愈合方面的研究。
6.本发明研究发现，黄精果寡糖(pfos)有促进创口愈合的功效。基于该研究，本发明实际提供了黄精果寡糖作为活性成分在制备促进创口愈合的产品中的用途。
7.其中，所述产品为局部给药制剂。
8.糖尿病溃疡是糖尿病的一种并发症，长期糖尿病的患者，常有血管的病变及末稍神经炎的并发症。此类病人趾端的感觉因为神经炎的关系，常常丧失知觉，因此经常会碰撞至流血而仍不自知。此类的趾端或下肢的伤口再加上末梢血管的病变和胶原蛋白不正常，非常不容易愈合，而往往演变成慢性溃疡。
9.本发明研究发现，黄精果寡糖对于糖尿病溃疡的愈合有良好的促进作用，可以将其制备成治疗或辅助治疗糖尿病溃疡的产品。
10.一种黄精果寡糖水凝胶，其活性成分包括黄精果寡糖。
11.水凝胶是由可溶性聚合物通过化学或物理交联形成的亲水性大分子网络结构。由于水凝胶具有多孔结构、高含水量和柔软的粘稠度，与天然活组织相似，能吸水膨胀而不溶解，因此水凝胶具有渗出能力高、不粘附、易脱离伤口、加速愈合等优点。水凝胶由大约90％的水和10％的天然或合成聚合物组成。在干燥和坏死的伤口，这种高含水量的水凝胶特别适合。由于水凝胶的高吸水性，每克水凝胶敷料可吸收高达1000克伤口渗出物。羧甲基壳聚糖(cmc)具有良好的生物相容性和水溶性。它显示出非细胞毒性。此外，它的抗菌性能优于
cs。同样，卡波姆940(cbm 940)的粘度也会随着ph值的变化而变化，且无细胞毒性，延展性好。它被广泛用于水凝胶的制备。因此，本研究选择cmc和cbm 940)作为水凝胶基质。
12.其中，辅料包括辅料包括凝胶基质、碱、保湿剂、增溶剂、溶剂。
13.其中，所述凝胶基质选自卡波姆、cmc；碱选自三乙醇胺、氢氧化钠、月桂胺、乙二胺、碳酸氢钠；保湿剂选自甘油、丙二醇；增溶剂选自吐温
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80、聚氧乙烯氢氧化蓖麻油、平平加o。
14.另外，根据需求，还可以在辅料中添加抗氧剂、防腐剂等，例如亚硫酸盐、半胱氨酸、二叔丁基羟基甲苯、山梨酸钾，尼泊金类、苯甲酸及钠盐等。
15.本发明中使用的黄精果寡糖，可以使用现有的方法进行提取，也可以使用95％乙醇脱脂后热水提取(可以使用50～100℃)，也可以使用石油醚脱脂后碱性条件下超声提取，还可以使用酶解提取，或者使用酸解后水提等方式。
16.根据对各种提取方式的动物实验结果可知，各种方式所得黄精果寡糖均有一定的创口治疗效果，其中，以95％乙醇脱脂后热水提取所得提取物效果最佳，且明显由于其他方法所得果寡糖提取物。
17.基于上述效果差异，本发明还提供了一种黄精果寡糖的制备方法，取黄精，95％乙醇脱脂后，热水提取，浓缩至提取液体积的1/8
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1/12，通过8k da和1kda截止膜超滤分离，得到黄精果寡糖。
18.本发明还提供了一种黄精果寡糖水凝胶的制备方法，它包括如下内容：取凝胶基质，溶入水中，加入碱调节ph至中性，再加入黄精果寡糖的水溶液，混匀，即得。
附图说明
19.图1小鼠背部创面图
20.图2实施例1果寡糖凝胶剂治疗下的背部创面图
21.图3实施例2果寡糖凝胶剂治疗下的背部创面图
22.图4实施例3果寡糖凝胶剂治疗下的背部创面图
23.图5实施例4果寡糖凝胶剂治疗下的背部创面图
24.图6正常组病理图
25.图7糖尿病创口模型组病理图
26.图8水凝胶低剂量组病理图
27.图9水凝胶高剂量组病理图
具体实施方式
28.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
29.cbm 940(中国上海市嘉定区嘉信路1157弄945号上海世达生物技术有限公司)、cmc(中国上海市化学工业园沧工路1288号上海麦克林生化有限公司)、三乙醇胺(购自sigma)、蒸馏水配制水凝胶、溶液和稀释剂。
30.实施例1果寡糖的制备
31.将新鲜的黄精根茎(6.0kg)切成小薄片(2
×
2mm厚)，并在25
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30℃下于95％乙醇
(18l)中浸泡10天并间歇搅拌来脱脂，提取重复两次，将残余物风干(产量4.85kg)，并用沸腾的蒸馏水萃取三次(每次30l，每次3小时)。然后，将提取物合并并浓缩至体积的十分之一，然后通过使用8k da和1k da截止膜的超滤进行分离，以获得低分子量黄精果寡糖pfos(8k da
‑
1 k da)。浓缩后，将pfos在50℃的真空下干燥。
32.实施例2果寡糖的制备
33.将新鲜的黄精根茎(6.0kg)切成小薄片(2
×
2mm厚)，加12l石油醚50℃回流提取2h，过滤，滤渣挥干溶剂，加12l 2mol/l的naoh溶液，于50℃、100w超声提取1h，冷却过滤，滤液浓缩，将提取物合并、浓缩至体积的十分之一，然后通过使用8k da和1k da截止膜的超滤进行分离，以获得低分子量黄精果寡糖pfos。浓缩后，将pfos在50℃的真空下干燥。
34.实施例3果寡糖的制备
35.将新鲜的黄精根茎(6.0kg)切成小薄片(2
×
2mm厚)，加18l蒸馏水，加250g纤维素酶，50℃恒温酶解2h，煮沸灭酶，冷却，过滤，滤液浓缩，将提取物合并并浓缩至体积的十分之一，然后通过使用8k da和1k da截止膜的超滤进行分离，以获得低分子量黄精果寡糖pfos。浓缩后，将pfos在50℃的真空下干燥。
36.实施例4果寡糖的制备
37.将新鲜的黄精根茎(6.0kg)切成小薄片(2
×
2mm厚)，加18l蒸馏水，加125ml盐酸(质量分数36％
‑
38％)，90℃酸解3h，冷却，加2mol/l的naoh调ph至中性，过滤，滤液浓缩，将提取物合并并浓缩至体积的十分之一，然后通过使用8k da和1k da截止膜的超滤进行分离，以获得低分子量黄精果寡糖pfos。浓缩后，将pfos在50℃的真空下干燥。
38.实施例5水凝胶的制备
39.取cbm940和cmc适量分别溶解于蒸馏水中，分别配成2％的溶液，按体积比1:1混合搅拌30min，然后用三乙醇胺将ph值调整到7，得到辅料混合物。
40.将1g、2g、4g不同用量的黄精果寡糖分别溶解于蒸馏水中(实施例1
‑
4制备得到)，并将蒸馏水加至6g。将不同量的黄精果寡糖加入至20g辅料混合物，即得黄精果寡糖水凝胶。
41.实施例6本发明水凝胶的药效活性(糖尿病创口愈合)
42.实验方法：
43.(1)将9周龄2型糖尿病模型db/db小鼠随机分组，设置正常组(无创口，给予空白凝胶)、模型组(给予空白凝胶)、低剂量组(0.5％黄精果寡糖水凝胶)db/db小鼠；高剂量组(2％黄精果寡糖凝胶)db/db小鼠，每组10只。
44.(2)麻醉小鼠。
45.(3)用剃毛器将小鼠背部皮肤毛发剃去。
46.(4)用打孔器于小鼠背部左右两边对称打孔，使形成直径为2mm的圆形伤口(参见图1)。各组每只小鼠涂抹给药，一次/日，左边为给药组，右边为生理盐水组，连续给药3周。每周对创面拍照一次，每组每周取材1
‑
2只共取三周，多聚甲醛固定皮肤，进行病理实验。
47.实验结果：
48.(1)创面结果
49.根据图2
‑
5的给药组和给与空白凝胶的模型组对比可知，使用本发明黄精果寡糖凝胶剂，能够明显缩小创口面积，表明本发明黄精果寡糖凝胶剂对糖尿病创口愈合有促进
作用。
50.同时，图2
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5进行对比可知，实施例1的黄精果寡糖凝胶剂创口愈合明显最快，效果明细那优于实施例2
‑
4制备的黄精果寡糖。
51.(2)病理结果(实施例1产品制备得到的凝胶)：
52.正常组(空白凝胶)：皮肤组织表皮结构完整清晰，角化层明显，复层扁平上皮层较薄，细胞排列整齐紧密；真皮内胶原纤维交错排列，胞质红染、均匀；皮下脂肪层及肌层结构清晰可见，脂肪细胞及肌纤维排列整齐、致密，体积大小均一，细胞核形态正常；未见明显病理变化。参见图6。
53.糖尿病创口模型组(第0天)：表皮层增厚，见棘细胞层数明显增多；并伴有炎性细胞浸润，见核呈杆状的中性粒细胞和核呈圆形深染的淋巴细胞，以及较多的新生毛细血管形成。参见图7。
54.水凝胶低剂量组(第14天)：血痂比模型组减少，表皮增厚比模型组减少。参见图8。
55.水凝胶高剂量组(第14天)：皮肤组织表皮结构完整清晰，细胞排列整齐紧密；皮下脂肪层及肌层结构较为清晰可见，脂肪细胞及肌纤维排列整齐、致密，体积大小均一，细胞核形态正常；未见明显病理变化。参见图9。