菠菜中的霜霉病抗性的制作方法

菠菜中的霜霉病抗性
发明领域
1.本发明涉及能够赋予菠菜植物针对一种或多种粉霜霉菠菜专化型小种(peronospora farinosa f.sp.spinaciae race)的抗性的基因。本发明还涉及菠菜植物、所述菠菜植物的繁殖材料、所述菠菜植物的细胞以及携带该基因的所述菠菜植物的种子。本发明进一步涉及生产携带该基因的菠菜植物的方法以及该基因在育种中赋予针对粉霜霉菠菜专化型抗性的用途。
2.发明背景
3.霜霉病(粉霜霉菠菜专化型)是菠菜种植者的主要威胁，因为其直接影响收获的叶。在菠菜中，霜霉病是由卵菌粉霜霉菠菜专化型(以前称为散展霜霉(p.effusa))引起的。感染使得叶子不适合销售和消费，因为其本身在表型上表现为老叶上的黄色病变，并且在叶背表面上可以观察到灰色真菌生长。感染可以非常迅速地传播，并且其可以在温室栽培和土壤栽培中发生。粉霜霉菠菜专化型孢子的形成和萌发的最适温度为9至12℃，并且被高相对湿度促进。当孢子沉积在潮湿的叶表面上时，它们可以容易地萌发和感染叶。真菌生长最适温度为8至20℃，相对湿度≥80％，并且感染后6至13天内可观察到菌丝生长。粉霜霉的卵孢子可以在土壤中存活长达3年，或作为菌丝体存在于种子或活植物中。
4.迄今为止，已正式鉴定和表征了17种菠菜霜霉病(pfs)的致病小种，并且在田间观察到了许多新的候选物。粉霜霉菠菜专化型的17种正式认可的小种被命名为pfs：1至pfs：17(irish等人phtypathol.vol.98pg.894
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900,2008；plantum nl(荷兰种子和幼小植物育种、组织培养、生产及贸易协会(dutch association for breeding,tissue culture,production and trade of seed and young plants))新闻发布，“benoeming van pfs：14,een nieuwe fysio van valse meeldauw in spinazie”，2012年9月19日；report jim correl(univ.arkansas)和steven koike(uc cooperative extension,monterey county)，“race pfs：14
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another new race of the spinach downy mildew pathogen”，2012年9月18日；plantum nl新闻发布，“denomination of pfs：15,a new race of downy mildew in spinach”，2014年9月2日；plantum nl新闻发布，“denomination of pfs：16,a new race of downy mildew in spinach,march 15,2016；plantum nl新闻发布，denomination of pfs：17,a new race of downy mildew in spinach”,april 16,2018)。在1990年至2014年期间鉴定了小种4至16，而最近才鉴定了两种新的霜霉属(peronospora)分离株(称为ua201519b和us1602)，其后来由国际霜霉工作组(iwgp)正式命名为pfs：16和pfs：17(plantum nl(荷兰种子和幼小植物育种、组织培养、生产及贸易协会)新闻发布，“denomination of pfs：16,a new race of downy mildew in spinach”，2016年3月15日；plantum nl新闻发布，denomination of pfs：17,a new race of downy mildew in spinach”，2018年4月16日。所有17种正式认可的pfs小种可以从department of plant pathology,university of arkansas,fayetteville,ar 72701,usa,以及nak tuinbouw,sotaweg 22,2371gd roelofarendsveen,the netherlands公开获得。
5.尤其是最新鉴定的霜霉属小种可以打破目前在世界范围内商业使用的许多菠菜
品种的抗性，从而它们对菠菜产业的生产力构成严重威胁。因此，保持在这一领域的发展前沿至关重要，因为霜霉属不断发展打破存在于商业性菠菜品种中的抗性的能力。因此，针对霜霉病的新的抗性基因是非常有价值的资产，并且它们形成了育种特别是菠菜和生菜育种的重要研究焦点。菠菜育种者的主要目标之一是在这些小种变得广泛传播并可威胁到该产业之前，迅速开发出对尽可能多的霜霉属小种(包括最新鉴定的小种)具有抗性的菠菜品种。
6.在商业菠菜品种中，针对霜霉病的抗性通常是由所谓的r基因引起的。r基因介导的抗性基于植物识别入侵病原体的能力。在许多情况下，这种识别发生在病原体建立第一阶段的相互作用并将所谓的致病性(或无毒力)因子转移到植物细胞中之后。这些致病因子与宿主组分相互作用，以建立有利于病原体侵入宿主并从而引起疾病的条件。当植物能够识别由致病因子触发的事件时，可以启动抗性应答。在许多不同的植物病原体相互作用系统中，例如菠菜与不同霜霉病菌株的相互作用，植物只有在特定识别入侵病原体后才会启动这些事件。
7.植物和病原体的共同进化导致了一场军备竞赛，其中r基因介导的抗性有时被克服，结果病原体能够以不同的方式与替代性宿主靶标或相同靶标相互作用并对其进行修改，使得失去识别，并且可以成功地建立感染，从而导致疾病。为了在植物中重新建立抗性，必须引入新的r基因，该基因能够识别替代性致病因子的作用模式。
8.尽管存在r基因的持久性相对较低的事实，r基因在菠菜中仍然是抵御霜霉病的主要形式。这主要是因为它是提供绝对抗性的唯一防御形式。到目前为止，植物育种者已经非常成功地利用存在于作物物种野生种质中的抗性基因来生产霜霉病抗性菠菜品种。尽管r基因广泛用于菠菜育种，但到目前为止，人们对这些r基因知之甚少。
9.直到最近才发现，菠菜中正式认可的r基因实际上是两个紧密相连的基因，即α
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wolf和β
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wolf基因的所有不同等位基因。这也是首次在分子水平上对r基因或更好地r等位基因首次进行表征，即确定其核苷酸和氨基酸序列。尽管这为育种人员提供了提高检测和选择r等位基因的效率的工具，但充分响应新出现的霜霉病小种对于开发商业成功的菠菜品种仍然至关重要。因此，本发明的目的是提供赋予对新出现的霜霉病分离株的抗性的新抗性等位基因，并提供用于鉴定该新抗性等位基因的分子生物学工具。
10.发明概述
11.在导向本发明的研究中，发现了wo2018059651中描述的α
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wolf基因的新等位基因变体。α
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wolf基因编码属于cc
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nbs
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lrr家族(卷曲螺旋
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核苷酸结合位点
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富含亮氨酸的重复序列)的蛋白质。取决于菠菜植物中存在的等位基因变体(或多个等位基因变体)，所述植物将产生赋予对粉霜霉菠菜专化型的致病小种某种抗性谱的wolf蛋白变体。
12.在本发明的上下文中，术语“等位基因”或“等位基因变体”用于指定与特定表型即抗性谱相联系的基因版本。发现菠菜可以携带一种或两种wolf基因。这两种wolf基因中的每一种都包含多个等位基因，每个等位基因赋予特定的抗性谱。在本发明的上下文中，等位基因或等位基因变体是核酸。
13.βwolf基因位于支架12735(scaffold12735)(序列：genbank：kq143339.1)上，位置213573
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221884。如果菠菜植物也携带或仅携带α
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wolf基因，则α
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wolf基因位于与β
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wolf基因在viroflay基因组组装中的支架12735上的位置大致相同的位置。
14.新发现的α
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wolf等位基因至少提供了对霜霉病小种pfs:16的抗性。α
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wolf 25还提供对pfs:8和pfs15的抗性。
15.发明详述
16.菠菜品种viroflay(它对所有已知的粉霜霉菠菜专化型的致病小种都敏感)的基因组组装是公开可获得的(菠菜(spinacia oleracea)栽培种synviroflay，全基因组鸟枪测序项目；bioproject：prjna41497；genbank：ayzv00000000.2；biosample：samn02182572，另见dohm等人，2014,nature 505:546
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549)。在viroflay的基因组组装中，β
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wolf基因位于支架12735(序列：genbank：kq143339.1)上，位置为213573
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221884。该间隔覆盖的序列包括viroflay的β
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wolf基因的整个基因组序列，加上该基因上游的2000个碱基对序列，加上该基因下游的序列，直到位于wolf基因下游的相邻基因的基因座。菠菜品种viroflay仅具有单个wolf基因，即β
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wolf基因，但大多数其他菠菜品系在基因组中的同一位置携带单个α型wolf基因。其他菠菜品系在基因组中大致相同的位置含有两种wolf基因。在这种情况下，两种wolf基因彼此相邻。在含有两种wolf基因的大多数菠菜品系中，所述wolf基因之一属于α型，而另一个wolf基因属于β型。据观察，wolf基因座中的这种等位基因变异是对粉霜霉菠菜专化型的致病小种抗性差异的原因。
17.α
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wolf基因的等位基因和β
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wolf基因的等位基因之间的区别在于编码的蛋白质序列中存在特定的保守氨基酸基序。如上所述，所有wolf蛋白都具有(从n末端到c末端)本领域公知的以下结构域：卷曲螺旋结构域(rx
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cc样，cd14798)、nbs结构域(也称为“nb
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arc结构域”，pfam00931；van der biezen&jones,1998,curr.biol.8:r226
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r228)，以及包含lrr结构域的富含亮氨酸重复序列(ipr032675)。此外，所有wolf蛋白在其氨基酸序列的n末端都包含基序“maeigysvc”。除此之外，所有α
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wolf蛋白在其氨基酸序列中都包含基序“kwmclr”，而所有β
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wolf蛋白在其氨基酸序列中都包含基序“hvgcvvdr”。
18.本发明涉及赋予新粉霜霉菠菜专化型抗性的α
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wolf基因的等位基因，命名为α
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wolf 25。
19.特别地，本发明涉及命名为α
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wolf 25的赋予粉霜霉菠菜专化型抗性的等位基因，其中由所述等位基因编码的蛋白质是cc
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nbs
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lrr蛋白质，cc
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nbs
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lrr蛋白质在其氨基酸序列中包含：a)在其n末端的基序“maeigysvc”；b)基序“kwmclr”；并且其中蛋白质的lrr结构域以增加的优先性顺序与seq id no:5具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。任选地，α
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wolf 25等位基因在其氨基酸序列中还包含另外的基序，即“dqedegedn”。
20.本发明进一步涉及命名为α
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wolf 25的赋予粉霜霉菠菜专化型抗性的等位基因，其中由所述等位基因编码的蛋白质是cc
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nbs
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lrr蛋白质，cc
‑
nbs
‑
lrr蛋白质在其氨基酸序列中包含：a)在其n末端的基序“maeigysvc”；b)基序“kwmclr”；并且其中蛋白质的lrr结构域以增加的优先性顺序与seq id no:5具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。任选地，α
‑
wolf 25等位基因在其氨基酸序列中还包含另外的基序，即“dqedegedn”。
21.本发明还涉及具有lrr结构域的α
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wolf 25等位基因，该结构域具有以增加的优先性顺序与seq id no:4具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的基因组序列。
22.本发明还涉及具有lrr结构域的α
‑
wolf 25等位基因，该结构域具有以增加的优先性顺序与seq id no:4具有至少96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性的基因组序列。
23.出于本发明的目的，将α
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wolf 25等位基因的蛋白质的lrr结构域限定为以增加的优先性顺序与seq id no:5具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列。
24.出于本发明的目的，将α
‑
wolf 25等位基因的蛋白质的lrr结构域限定为以增加的优先性顺序与seq id no:5具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性的氨基酸序列。
25.技术人员熟悉用于计算序列相似性和序列同一性的方法。使用emboss stretcher 6.6.0(www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_stretcher)，使用eblosum62矩阵，用设置gap open:12和gap extend:2来计算氨基酸序列的序列相似性。对于dna，使用dna全矩阵，用设置gap open:16和gap extend:4来计算序列相似性。
26.可以通过使用特异性引物对编码lrr结构域的氨基酸序列的基因组dna进行扩增和测序来确定如本文所定义的α
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wolf 25等位基因的lrr结构域，然后将该dna序列翻译成氨基酸序列，从而应用选择正确阅读框的常识。技术人员能够使用免费提供的在线生物信息学工具(例如可以在这里找到：http://web.expasy.org/translate/)来做到这一点。
27.可以使用具有正向引物和反向引物的引物对来扩增α
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wolf基因例如α
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wolf 25的lrr结构域的基因组序列，正向引物是具有seq id no：1的序列的核酸分子，反向引物是具有seq id no：2的序列的核酸分子。
28.本发明还涉及赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性的核酸分子，其中由所述核酸分子编码的蛋白质是cc
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nbs
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lrr蛋白质，cc
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nbs
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lrr蛋白质在其氨基酸序列中包含：a)在其n末端的基序“maeigysvc”；b)基序“kwmclr”；并且其中蛋白质的lrr结构域以增加的优先性顺序与seq id no:5具有至少95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性。任选地，该核酸分子是分离的核酸分子。
29.本发明还涉及赋予对至少一种粉霜霉菠菜专化型小种的抗性的核酸分子，其中由所述核酸分子编码的蛋白质是cc
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nbs
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lrr蛋白质，cc
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nbs
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lrr蛋白质在其氨基酸序列中包含：a)在其n末端的基序“maeigysvc”；b)基序“kwmclr”；并且其中蛋白质的lrr结构域以增加的优先性顺序与seq id no:5具有至少93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。任选地，该核酸分子是分离的核酸分子。
30.该等位基因显示与它赋予对霜霉病小种pfs8、pfs15和pfs16的抗性的显性遗传一致的隔离模式(segregation pattern)。
31.使用具有seq id no:1和seq id no:2的引物扩增α
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wolf基因的lrr结构域编码区的pcr条件是，使用platinum taq酶(thermo fisher scientific)：在95℃3分钟(初始变性步骤)；40个扩增循环，每个循环由：在95℃变性30秒，在60℃退火30秒，在72℃延伸30秒组成；在72℃2分钟(最终延伸步骤)。
32.可以使用正向引物和反向引物来扩增β
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wolf基因的lrr结构域，例如存在于品种viroflay中的空等位基因，正向引物是具有seq id no:3的序列的核酸分子，反向引物是具有seq id no:2的序列的核酸分子。
33.使用具有seq id no:2和seq id no:3的引物扩增β
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wolf基因的lrr结构域编码区
的pcr条件如下，使用platinum taq酶(thermo fisher scientific)：在95℃3分钟(初始变性步骤)；40个扩增循环，每个循环由：在95℃变性30秒，在58℃退火50秒，在72℃延伸50秒组成；在72℃2分钟(最终延伸步骤)。
34.因此，本发明还涉及用于扩增α
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wolf基因的lrr结构域，更具体地用于扩增α
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wolf 25等位基因的lrr结构域的引物对，其中正向引物是具有seq id no:1的序列的核酸分子，反向引物是具有seq id no:2的序列的核酸分子。本文公开的引物被专门设计用于选择性扩增wolf基因、而不是任何其他cc
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nbs
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lrr蛋白质编码基因的部分。
35.本发明涉及α
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wolf25等位基因，其具有以增加的优先性顺序与seq id no:8具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的编码序列。
36.本发明还涉及α
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wolf25等位基因，其具有以增加的优先性顺序与seq id no:8具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性的编码序列。
37.在本发明的另一方面中，α
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wolf 25等位基因编码蛋白质，其具有以增加的优先性顺序与seq id no:9具有至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列相似性的氨基酸序列。
38.在本发明的另一方面中，α
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wolf 25等位基因编码蛋白质，其具有以增加的优先性顺序具有与seq id no:9至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性的氨基酸序列。
39.当存在于菠菜植物中时，α
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wolf 25等位基因赋予对17种正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种中的至少一种的完全抗性。在另一个实施方案中，当存在于菠菜植物中时，α
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wolf 25等位基因赋予对17种正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种中的至少两种的完全抗性。在另一个实施方案中，当存在于菠菜植物中时，α
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wolf 25等位基因以增加的优先性顺序赋予对17种正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种中的至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种、十二种、十三种、十四种、十五种、十六种或全部的完全抗性。
40.当杂合地或纯合地存在于菠菜植物中时，α
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wolf 25等位基因至少赋予对正式认可的粉霜霉菠菜专化型小种pfs:8、pfs15和pfs:16的完全抗性，并且不赋予对霜霉病小种pfs:3的抗性(见表1)。
41.可以通过使用幼苗试验来确定菠菜植物针对粉霜霉菠菜专化型一个或多个小种的抗性。在本文中，幼苗试验定义为这样一种试验，其中将菠菜植物种植在含有生长培养基的托盘中，任选地在幼苗出现后每周施肥两次。在第一真叶阶段用浓度约为2.5
×
105/ml的待测粉霜霉菠菜专化型或分离株的一种致病小种的孢子囊悬浮液接种植物。将接种的植物置于18℃、100％相对湿度的露室中24小时，然后移至18℃、12小时光周期的生长室中6天。6天后，将植物放回露室24小时以诱导孢子形成，并随后对疾病反应进行评分。优选地，每个小种测试30株植物。
42.如本文所用，当植物在本文所述的幼苗试验中未表现出症状时，植物针对粉霜霉菠菜专化型小种具有完全抗性。
43.如本文所用，当植物在本文所述的幼苗试验中仅表现出萎黄病症状或孢子形成仅发生在子叶尖端时，植物针对粉霜霉菠菜专化型小种具有中等抗性。
44.如本文所用，当植物在本文描述的幼苗试验中不仅表现出萎黄病症状，或者当孢子形成发生在大于仅子叶尖端的区域时，植物对粉霜霉菠菜专化型小种的分离株易感。
45.本发明的另一方面涉及菠菜植物，其包含本发明的α
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wolf 25等位基因，其种子的代表性样品以ncimb登录号43495保藏于ncimb。
46.在另一个实施方案中，包含α
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wolf 25等位基因的本发明植物是农艺学优良的菠菜植物。在本发明的上下文中，农艺优良的菠菜植物是具有导致可区分和所需农艺性状积累的基因型的植物，其允许生产者收获具有商业意义的产品，优选地包含α
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wolf 25等位基因的农艺学优良的菠菜植物是近交系或杂交种的植物。
47.如本文所用，近交系的植物是三轮或更多轮自交或回交产生的植物群体的植物；或者该植物是双单倍体。近交系可以例如是用于生产商业杂交种的母系。
48.如本文所用，杂交种植物是具有不同基因型的两种不同植物之间杂交产生植物。更特别地，杂交种植物是两个不同近交系植物之间杂交的结果，这种杂交种植物可以是例如是f1杂交品种的植物。
49.携带杂合形式的α
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wolf 25等位基因的植物可以进一步包含β
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wolf 0等位基因，例如存在于品种viroflay中，其中β
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wolf 0等位基因不赋予对霜霉病的任何抗性。然而，α
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wolf 25等位基因杂合的植物还可包含确实提供对霜霉病的抗性的α/β
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wolf基因的等位基因。优选地，这样的等位基因将补充α
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wolf 25等位基因，使得菠菜植物将对α
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wolf 25等位基因不提供抗性的一个或多个其他小种至少具有中等抗性。最优选地，α/β
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wolf基因的其他等位基因补充α
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wolf 25等位基因，使得植物对粉霜霉菠菜专化型小种pfs:1至pfs:17具有抗性。在一个实施方案中，这样的植物是农艺优良植物。
50.可替代地，携带α
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wolf 25等位基因的植物的抗性谱由完全不同基因的抗性赋予等位基因所补充。这种基因的实例是例如us8,354,570中所述的dmr1、us9,121,029中所述的dmr6和us20170327839中所述的p10。因此，本发明涉及携带α
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wolf 25等位基因并进一步包含导致针对粉霜霉菠菜专化型小种pfs:1至pfs:17的抗性的遗传决定簇的菠菜植物。遗传决定簇可以是另一种抗性赋予α/β
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wolf等位基因，或完全不同基因的抗性赋予等位基因。
51.本发明进一步涉及包含α
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wolf 25等位基因的繁殖材料。在一个实施方案中，繁殖材料适用于有性繁殖。这种繁殖材料包括例如小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。在另一个实施方案中，繁殖材料适用于营养繁殖。此类繁殖材料包括例如插条、根、茎、细胞、原生质体和可再生细胞的组织培养物。适合制备组织培养物的植物部分特别是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根尖、花药、花、种子和茎。
52.本发明还涉及包含α
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wolf 25等位基因的菠菜植物的细胞。这种细胞可以是分离的形式，或可以是完整植物或其部分的一部分，并然后仍然构成本发明的细胞，因为这种细胞含有赋予对霜霉病的抗性的α
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wolf 25等位基因。本发明植物的每个细胞都携带赋予对粉霜霉菠菜专化型的抗性的遗传信息。本发明的这种细胞也可以是可再生细胞，其可用于再生包含本发明的等位基因的新植物。
53.本发明的另一方面涉及一种制备杂交种菠菜种子的方法，包括将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交并收获所得杂交种菠菜种子，其中所述第一和/或第二亲本菠菜植物包含α
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wolf 25等位基因。在特定的实施方案中，第一和/或第二亲本植物是本文限
定的近交系的植物。
54.本发明进一步涉及由通过将第一亲本菠菜植物与第二亲本菠菜植物杂交并收获所得杂交种菠菜种子而产生的种子生长的杂交种菠菜植物，其中所述第一和/或第二亲本菠菜植物包含α
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wolf 25等位基因。
55.可以使用本领域已知的任何合适的分子生物学方法来确定菠菜植物基因组中至少部分wolf基因的基因组dna或编码dna序列，包括但不限于(基因组)pcr扩增，然后是sanger测序、全基因组测序、转录组测序、序列特异性靶标捕获然后进行下一代测序(例如，使用integrated dna technologies的靶标捕获系统)、包含lrr结构域的基因序列的特异性扩增(例如，使用renseq方法，如美国专利申请14/627116和jupe等人，2013，plant j.76：530
‑
544中所述)然后进行测序等。
56.在一个实施方案中，本发明涉及一种鉴定携带α
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wolf 25等位基因的植物的方法，包括确定编码本文定义的lrr结构域的dna序列。
57.在该方法的另一个实施方案中，通过使用引物对扩增lrr结构域的基因组dna区域来确定α
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wolf 25等位基因的lrr结构域。正向引物优选地是具有seq id no:1的序列的核酸分子，并且反向引物优选地是具有seq id no:2的序列的核酸分子。
58.本发明的另一方面涉及生产包含对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植物的方法，包括：(a)将包含α
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wolf 25等位基因的植物与另一植物杂交；(b)可选地进行一轮或多轮自交和/或杂交；(c)任选地在每轮自交或杂交后选择包含α
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wolf 25等位基因的植物。
59.可以通过确定等位基因的nbs
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lrr结构域的基因组dna序列的存在，在基因型上选择包含α
‑
wolf 25等位基因的植物，该序列以增加的优先性顺序与seq id no:4具有95％、96％、97％、98％、99％、100％序列相似性，或与seq id no:4具有95％、96％、97％、98％、99％、100％序列同一性。
60.在另一个实施方案中，可以通过确定整个等位基因的编码序列的存在，在基因型上选择包含α
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wolf 25等位基因的植物。
61.可替换地，可以通过在疾病测试例如本文所述的测试中测定植物来在表型上确定α
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wolf 25等位基因的存在。
62.本发明还涉及携带α
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wolf 25等位基因的菠菜植物在育种中赋予针对粉霜霉菠菜专化型的抗性的用途。
63.本发明还涉及用于培育携带本发明的α
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wolf 25等位基因的菠菜植物的育种方法，其中使用包含所述等位基因的种质。能够长成包含本发明等位基因的植物并代表种质的种子以登录号ncimb 43495保藏于ncimb。
64.在另一方面，本发明涉及生产包含α
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wolf 25等位基因的菠菜植物的方法，该方法包括：(a)将包含等位基因的植物与另一植物杂交；(b)任选地在f1中选择包含所述等位基因的植物；(c)任选地将所得f1与优选亲本回交并在bc1f1中选择具有所述等位基因的植物；(d)任选地进行一轮或多轮另外的自交、杂交和/或回交，并随后选择包含所述等位基因或显示对应于所述等位基因的抗性谱的植物。本发明还包括通过该方法生产的菠菜植物。
65.本发明还涉及本发明菠菜植物的收获的叶，涉及包含本发明菠菜植物的收获的叶的食品，以天然或加工形式。
66.菠菜叶以包装形式出售，包括但不限于预包装的菠菜叶或加工成包含所述叶的沙
拉。这样的包装是例如美国专利号5,523,136所制备，该专利提供了包装膜和由这种包装膜制成的包装，包括含有叶类产品的这种包装，以及制造和使用这种包装膜和包装的方法，这些包装膜和包装适用于本发明的菠菜叶。因此，本发明包括制造和使用本发明菠菜植物的叶以及源自本发明的菠菜植物的叶的用途和方法。
67.本发明进一步涉及一种容器，其包含一种或多种本发明的植物，或一种或多种源自本发明的植物的菠菜植物，其在居家环境中在生长基质中用于从植物收获叶子。这样，当植物处于准备收获的状态时，消费者可以采摘非常新鲜的叶用于沙拉。
68.本发明还涉及菠菜植物在生产包含α
‑
wolf 25等位基因的菠菜植物中的用途，该菠菜植物的代表性种子以登录号ncimb 43495保藏于ncimb。
69.在另一个实施方案中，所述菠菜植物是杂交种、双单倍体或近交菠菜植物。
70.本发明的另一方面是包含α
‑
wolf 25等位基因的细胞用于生产显示对粉霜霉菠菜专化型的抗性的菠菜植物的用途。
71.本发明还涉及包含α
‑
wolf 25等位基因的组织培养物在生产显示对粉霜霉菠菜专化型显示抗性的菠菜植物中的用途。
72.抗性信息
73.表1
74.α
‑
wolf 25等位基因赋予的抗性谱。
“‑”
表示针对特定霜霉病小种的完全抗性；“(
‑
)”表示针对特定霜霉病小种的中等抗性；“ ”表示等位基因不赋予抗性并且会导致仅携带α
‑
wolf 25等位基因的植物对特定的霜霉病小种完全易感；“nt”表示尚未针对该分离株进行测试。
[0075][0076]
保藏信息
[0077]
在其基因组中包含本发明的α
‑
wolf 25等位基因的植物的种子于2019年10月2日以保藏登录号ncimb 43495保藏于ncimb ltd,ferguson building,craibstone estate,bucksburn,aberdeen ab21 9ya,uk。该保藏是根据布达佩斯条约的条款进行的。专利授权后，所有对保藏的限制将被取消，并且保藏旨在满足37cfr
§
1.801
‑
1.809的要求。专利授权后，该保藏将不可撤销地并且对公众无限制或无条件地发布。保藏将在保藏机构保存30年，
或最后一次请求后5年，或专利的有效期限，以较长者为准，并在此期间必要时予以更换。
[0078]
序列信息
[0079]
表2.序列信息。
[0080]
[0081]
[0082]
[0083]
[0084][0085]
本发明将在以下实施例中得到进一步阐明，并且这些实施例仅用于示例说明目的并不旨在以任何方式限制本发明。
实施例
[0086]
实施例1
[0087]
测试菠菜植物中对粉霜霉菠菜专化型的抗性
[0088]
如irish等人(2008；phytopathol.98:894
‑
900)所述，对霜霉病感染的抗性进行了测定，使用差异集(differential set)。本发明的菠菜植物与来自不同其他基因型的菠菜植物(见表3)一起播种在含有scotts redi
‑
earth培养基的托盘中，并在幼苗出现后用osmocote peter's(13
‑
13
‑
13)肥料(scotts)施肥每周两次。植物在第一真叶期接种粉霜霉菠菜专化型病原小种的孢子囊悬液(2.5
×
105/ml)。以此方式，对4个正式认可的致病小种进行了测试。
[0089]
将接种的植物置于18℃、100％相对湿度的露室中24小时，并然后移至18℃、12小时光周期的生长室中6天。6天后，将植物放回露室24小时以诱导孢子形成，并对疾病反应进行评分。
[0090]
如irish等人(2007；plant dis.91:1392
‑
1396)所述，根据萎黄病症状以及子叶和真叶上病原体孢子形成的迹象，将用于该特定测试的植物评分为抗性、中等抗性或易感。没有表现出萎黄病和孢子形成迹象的植物在该特定测试中被认为具有抗性。重新接种抗性植物以评估最初评分为抗性的植物是否已逃脱感染，或者它们是否真正具有抗性。仅表现出萎黄病症状或孢子形成仅出现在子叶尖端的的植物被评分为中等抗性。显示出比这些霜霉病感染症状更多的植物被评分为易感。
[0091]
表1显示了携带α
‑
wolf 25等位基因的植物对这些致病小种中每一种的抗性。表3显示了菠菜霜霉病小种的差异集以及各种菠菜品种(杂交种)对这些致病小种中每一种的抗性。易感反应记为“ ”(表明被真菌成功感染，在整个子叶上发生孢子形成)，并且抗性记为
“‑”
(子叶上没有孢子形成)。弱抗性应答用“(
‑
)”表示，这在实践中意味着感染水平略有
降低(在差异苗试验中仅出现萎黄病症状，或仅在子叶尖端发生孢子形成)。
[0092]
表3:
[0093][0094][0095]
实施例2
[0096]
lrr结构域编码区的扩增
[0097]
使用正向引物acaagtggatgtgtcttagg(seq id no:1)和反向引物ttcgccctcatcttcctgg(seq id no:2)，将包含α
‑
wolf 25等位基因的菠菜植物的分离的基因组dna(其种子的代表性样品以ncimb登录号43495保藏于ncimb)用于聚合酶链反应(pcr)，。引物对扩增α
‑
wolf基因的lrr结构域编码区，并且被设计用于选择性扩增wolf基因、而不是其他cc
‑
nbs
‑
lrr蛋白质编码基因的部分。
[0098]
使用具有seq id no:1和seq id no:2的引物扩增α
‑
wolf基因的lrr结构域编码区的pcr条件如下，使用platinum taq酶(thermo fisher scientific)：
[0099]
‑
在95℃3分钟(初始变性步骤)
[0100]
‑
40个扩增循环，每个循环由：在95℃变性30秒，在60℃退火30秒，和在72℃延伸30秒组成
[0101]
‑
在72℃2分钟(最终延伸步骤)
[0102]
使用正向引物tcacgtgggttgtgttgt(seq id no:3)和反向引物ttcgccctcatcttcctgg(seq id no:2)，将包含β
‑
wolf 0等位基因的品种viroflay菠菜植物的分离基因组dna用于聚合酶链反应(pcr)。引物对扩增β
‑
wolf基因的lrr结构域编码区，并且被设计用于选择性扩增wolf基因、而不是其他cc
‑
nbs
‑
lrr蛋白质编码基因的部分。
[0103]
使用具有seq id no:2和seq id no:3的引物扩增β
‑
wolf基因的lrr结构域编码区的pcr条件如下，使用platinum taq酶(thermo fisher scientific)：
[0104]
‑
在95℃3分钟(初始变性步骤)
[0105]
‑
40个扩增循环，每个循环由：在95℃变性30秒，在58℃退火50秒和在72℃延伸50秒组成
[0106]
‑
在72℃2分钟(最后延伸步骤)
[0107]
将pcr产物在琼脂糖凝胶上可视化(未显示)，并从pcr反应中纯化dna。随后使用本领域公知的方法确定pcr产物的序列。
[0108]
由具有seq id no:1和seq id no:2的引物扩增的α
‑
wolf 25等位基因的lrr结构域的序列在表2中以seq id no:4提供。
[0109]
由具有seq id no:2和seq id no:3的引物扩增的β
‑
wolf 0等位基因的lrr结构域的序列在表2中以seq id no:6提供。
[0110]
最后，将获得的序列翻译成lrr结构域的相应氨基酸序列，分别为α
‑
wolf 25等位基因和β
‑
wolf 0的seq id no:5和seq id no:7(另见表2)。
[0111]
如果使用smrt测序(pacific biosciences)对pcr产物进行测序，则pcr引物和pcr条件不同。
[0112]
向上述正向引物添加以下标准扩增序列：gcagtcgaacatgtagctgactcaggtcac。
[0113]
向反向引物添加以下标准扩增序列：tggatcacttgtgcaagcatcacatcgtag。
[0114]
实施例3
[0115]
在不携带等位基因的植物中引入α
‑
wolf 25等位基因
[0116]
将包含α
‑
wolf 25等位基因的菠菜植物(其代表性种子样品以ncimb登录号43495保藏在ncimb)与携带β
‑
wolf 0等位基因的品种viroflay的植物杂交以获得f1代。随后，f1植物进行自交以获得f2群体。
[0117]
如实施例1中所述测定f2群体的植物对粉霜霉菠菜专化型pfs：16的抗性。在测定中，大约75％的植物评分为完全抗性。这种隔离模式与显性遗传的隔离模式一致。
[0118]
分离同一f2群体的每株植物的基因组dna并用于两种不同的聚合酶链反应(pcr)。第一pcr反应使用用于扩增α
‑
wolf等位基因的lrr结构域的引物进行，并且第二pcr反应使用用于扩增β
‑
wolf等位基因的lrr结构域的引物进行，两者均如实施例2中所述。
[0119]
将pcr产物在琼脂糖凝胶上可视化(未显示)，这表明大约75％的植物含有α
‑
wolf片段，而其余大约25％的植物仅含有β
‑
wolf片段。含有α
‑
wolf片段的植物与评分为对pfs:16具有抗性的植物完全相关。仅包含β
‑
wolf片段的植物与评分为对pfs:16易感的植物完全相关。
[0120]
纯化来自pcr反应的dna，并随后确定pcr产物的序列。α
‑
wolf pcr产物产生对应于seq id no:4的序列的序列，α
‑
wolf 25等位基因的lrr结构域的基因组序列。β
‑
wolf pcr产
物产生对应于seq id no:6的序列的序列，β
‑
wolf 0等位基因的lrr结构域的基因组序列。