一种快速检测真菌感染性肉芽肿常见致病菌种的试剂盒的制作方法

1.本发明涉及医学检测技术领域，具体地说，是一种利用荧光定量pcr技术检测真菌感染性肉芽肿致病菌特异性基因的dna检测试剂盒。


背景技术：

2.皮肤真菌感染性肉芽肿是由真菌感染所致的皮肤及皮下组织的慢性肉芽肿性病变，其组织病理学表现为以上皮样细胞和多核巨细胞为主的炎细胞浸润，可伴有淋巴细胞、中性粒细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞等。真菌感染性肉芽肿的形成机制尚不清楚，可能是由于真菌病原体引发局部组织产生的迟发型超敏反应，固有免疫和适应性免疫均参与发病过程，引发一系列的炎症级联反应。根据致病菌的不同，其组织病理表现形式存在差异。引起真菌性肉芽肿的真菌种类繁多，如孢子丝菌、球孢子菌、组织胞浆菌、隐球菌、着色芽生菌、暗色丝孢霉菌、足分支菌、洛博芽生菌、马尼尔霏青霉菌、毛孢子菌、毛霉菌、曲霉菌、念珠菌、枝孢霉、皮肤癣菌等。
3.由于致病真菌的种类以及宿主的免疫状态的差异，导致皮肤真菌感染性肉芽肿的临床表现多种多样，局部的皮损可表现为丘疹、结节、溃疡、脓肿、赘生物等，易与细菌性肉芽肿、非感染性肉芽肿以及皮肤肿瘤等疾病相混淆；此外，很多患者的自觉症状往往不明显，不能引起重视，故仅根据患者的临床表现及自觉症状，极易造成误诊和漏诊。持续的真菌感染还可以导致自身的扩散以及人与人或人与动物之间的传播，给患者造成极大的痛苦，给社会造成极大的负担。然而，目前传统的诊断方法效率低、检测时间长、操作繁琐等，临床上急需研发一种能快速做出真菌感染的诊断以及鉴别真菌种属的新技术。
4.皮肤真菌感染性肉芽肿常见实验室诊断方法：
5.皮肤真菌感染性肉芽肿是一种慢性的、病原体难以被清除的疾病，特别是免疫抑制状态时发病率和致死率均较高。故而在临床上，快速的诊断和鉴定真菌种属是治疗过程中极为关键的两个方面。最简易皮肤真菌感染性肉芽肿检测方法是真菌镜检，可以发现真菌感染的存在，但是阳性率低，阴性结果并不能排除诊断，需要结合真菌培养的结果。真菌培养耗时较久，通常需要数周(2
‑
4周，最长可达6周，且每周2次检测真菌的生长情况)的时间，依据真菌的形态学特征以及生化特性由专业的人员进行菌种的鉴定，然而，并非所有的皮肤科或是基层医院均配备专业实验人员以及标准化的设备进行真菌的检测和鉴定。组织病理学检查是诊断皮肤真菌性肉芽肿的金标准，根据病程、致病真菌以及宿主免疫状态的不同，病理表现也是千差万别，如亲动物性的真菌感染常引起较为显著的炎症反应，而亲人性的真菌感染，炎症往往不明显。显微镜下寻找真菌感染的证据费时费力，需要专业的病理科医师；另外，he染色阳性率低，通常需要配合特殊染色，如pas、gms染色，但是大多数致病真菌在组织中形态非常相似，故而不能鉴定真菌的种属。
6.近年来，分子生物学技术也应用于真菌性皮肤病的诊断中，作为传统检测方法的补充，可以提高诊断的敏感性和特异性，如pcr技术、以pcr为基础的pcr
‑
relp技术、pcr
‑
rapd技术以及基因探针杂交技术等，但是这些技术可能存在临床适用范围有限，或是试验
结果不稳定，亦或是操作步骤繁琐等缺陷，故而限制了其在临床的广泛应用。所以，在皮肤真菌感染性肉芽肿诊断方面，有两方面的问题亟待解决：1)提高真菌感染致病菌的检测率，做出早期诊断以及菌种类型的鉴定；2)简化临床样本处理过程，缩短操作时间，期待方便快捷的结果判读。
7.目前尚无文献报告有关针对真菌感染性肉芽肿致病菌检测的qpcr试剂盒。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测真菌感染性肉芽肿常见致病菌种的dna序列的试剂盒。
9.为了实现上述目的，本发明筛选出临床上常见的致病菌种(包括白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、红色毛癣菌、申克孢子丝菌)，筛选出真菌特异性内转录区域1(internal transcribed spacer，its)或its2区域相应dna序列的核酸探针，建立qpcr芯片的诊断平台。利用常见致病菌标准菌株检测基因芯片平台的准确性、敏感性和特异性；同时使用临床组织标本对平台的实用价值进行评判，以期对于真菌感染性肉芽肿做出早期诊断，缩短临床诊疗过程，及时对患者进行必要干预，改善患者的预后，减少损容性皮肤损害、心理负担和经济负担。我们后期将进一步对真菌种类的进行扩大，使得诊断芯片所覆盖的真菌类型更广泛。为探讨皮肤真菌感染性肉芽肿的发病机制提供实验依据及诊断和防治提供新的技术平台和实验手段。
10.本发明的第一方面，提供一种快速检测真菌感染性肉芽肿常见致病菌种的试剂盒，包括：目标菌种的基因引物和荧光探针、chamq universal sybr qpcr master mix 2
×
、dna模板溶液；
11.所述的目标菌种为光滑念珠菌，热带念珠菌，白色念珠菌，红色毛藓菌，申克孢子丝菌。
12.进一步的，所述的目标菌种的基因引物和荧光探针的核苷酸序列分别如下所示：
13.①
光滑念珠菌：在internal transcribed spacer 1区设计一对引物如下：
14.上游引物：caaagacctgggagtgtgcg(seq id no.1)
15.下游引物：ccccaacgaacaaaagaatagtagt(seq id no.2)
16.探针：cy5
‑
ctattccaaaggaggtgttttatcacacga
‑
mgb(seq id no.3)
17.②
热带念珠菌：在internal transcribed spacer 2区设计一对引物如下：
18.上游引物：gtcatttctccctcaaacccc(seq id no.4)
19.下游引物：aagtttccacgttaaattctttcaa(seq id no.5)
20.探针：vic
‑
tttggtgttgagcaatacgctaggtttg
‑
mgb(seq id no.6)
21.③
白色念珠菌：在internal transcribed spacer 2区设计一对引物如下：
22.上游引物：gtttggtgttgagcaatacgact(seq id no.7)
23.下游引物：gcaagcaatgtttttggttagac(seq id no.8)
24.探针：fam
‑
tgcttgaaagacggtagtggtaaggc
‑
mgb(seq id no.9)
25.④
红色毛藓菌：在internal transcribed spacer 1区设计一对引物如下：
26.上游引物：ctggccccccacgatagg(seq id no.10)
27.下游引物：ccgggtgaggtagacaagaatg(seq id no.11)
28.探针：rox
‑
ccggaggacagacaccaagaaaaaat
‑
mgb(seq id no.12)
29.⑤
申克孢子丝菌：在internal transcribed spacer 1区设计一对引物如下：
30.上游引物：ctacgaacctttgtatctcaaccac(seq id no.13)
31.下游引物：gcaattcacattacgtatcgcatt(seq id no.14)
32.探针：hex
‑
gccctacgaacctttgtatctcaacca
‑
mgb(seq id no.15)。
33.更进一步的，所述的试剂盒基本反应体系如下：
[0034][0035]
本发明的第二方面，提供一种采用如上所述的试剂盒检测真菌感染性肉芽肿常见致病菌种的方法，包括以下步骤：
[0036]
真菌感染性肉芽肿组织样本，快速提取组织dna，进行rt
‑
pcr合成第一链cdna；配置pcr反应体系进行荧光定量pcr；在lightcycler数据分析系统中读出ct值结果；分别计算每个标本不同特异性基因的ct值；荧光定量pcr结果采用软件分析，并标化计算样本数据。
[0037]
本发明的优点和有益效果如下：
[0038]
1、敏感性：目标菌种按照浓度梯度进行稀释检测，检测不同目标菌种的最低检测弄滴，结果显示本发明的试剂盒检测灵敏度高。
[0039]
2、特异性：使用非目标菌种进行检测识别，发现本发明的试剂盒特异性好、假阳性低。
[0040]
3、操作简单、便捷快速：操作简单、安全、自动化程度高。速度快、高通量，可在3～4小时完成，为临床真菌感染性肉芽肿提供了一种全新基因诊断技术
附图说明
[0041]
图1为1
‑
5号目标菌种的lg浓度/ct值趋势线及扩增曲线。
[0042]
图2为1
‑
5号目标菌种在不同dna浓度梯度下的ct值。
[0043]
图3为6
‑
9号阴性对照菌株的扩增曲线图。
具体实施方式
[0044]
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明，但本发明的实施不仅限于此。
[0045]
实施例1：
[0046]
本发明的利用荧光定性pcr技术检测真菌感染性肉芽肿常见致病菌种特异性dna序列的试剂盒，包含目标菌种的基因引物和荧光探针、chamq universal sybr qpcr master mix 2
×
、dna模板溶液。
[0047]
①
光滑念珠菌：在internal transcribed spacer 1区设计一对引物如下：
[0048]
上游引物：caaagacctgggagtgtgcg(seq id no.1)
[0049]
下游引物：ccccaacgaacaaaagaatagtagt(seq id no.2)
[0050]
探针：cy5
‑
ctattccaaaggaggtgttttatcacacga
‑
mgb(seq id no.3)
[0051]
②
热带念珠菌：在internal transcribed spacer 2区设计一对引物如下：
[0052]
上游引物：gtcatttctccctcaaacccc(seq id no.4)
[0053]
下游引物：aagtttccacgttaaattctttcaa(seq id no.5)
[0054]
探针：vic
‑
tttggtgttgagcaatacgctaggtttg
‑
mgb(seq id no.6)
[0055]
③
白色念珠菌：在internal transcribed spacer 2区设计一对引物如下：
[0056]
上游引物：gtttggtgttgagcaatacgact(seq id no.7)
[0057]
下游引物：gcaagcaatgtttttggttagac(seq id no.8)
[0058]
探针：fam
‑
tgcttgaaagacggtagtggtaaggc
‑
mgb(seq id no.9)
[0059]
④
红色毛藓菌：在internal transcribed spacer 1区设计一对引物如下：
[0060]
上游引物：ctggccccccacgatagg(seq id no.10)
[0061]
下游引物：ccgggtgaggtagacaagaatg(seq id no.11)
[0062]
探针：rox
‑
ccggaggacagacaccaagaaaaaat
‑
mgb(seq id no.12)
[0063]
⑤
申克孢子丝菌：在internal transcribed spacer 1区设计一对引物如下：
[0064]
上游引物：ctacgaacctttgtatctcaaccac(seq id no.13)
[0065]
下游引物：gcaattcacattacgtatcgcatt(seq id no.14)
[0066]
探针：hex
‑
gccctacgaacctttgtatctcaacca
‑
mgb(seq id no.15)
[0067]
本检测实验采用的试剂为chamq universal sybr qpcr master mix，基本反应体系如下：
[0068][0069]
其中阴性对照和阳性对照：以非目标菌种为阴性对照，以含有目标菌种dna样品为阳性对照。菌种编号为阳性对照菌
①
光滑念珠菌，
②
热带念珠菌，
③
白色念珠菌，
④
红色毛藓菌，
⑤
申克孢子丝菌；阴性对照菌：
⑥
裴元着色菌，
⑦
趾间毛藓菌，
⑧
季也蒙毕赤酵母，
⑨
近平清念珠菌。阳性对照菌用于敏感性检测，阴性对照菌用于特异性检测。
[0070]
1.敏感性检测：
[0071]
将各1
‑
5号菌dna模板按以下梯度稀释：0.1ng/μl，0.01ng/μl，0.001ng/μl，0.0005ng/μl(4、5号未做)，0.0001ng/μl五梯度稀释进行qpcr反应。反应程序如下：
①
95℃预变性30s；
②
95℃变性10s，65℃退火延伸10s，40循环；每浓度梯度测试3次重复实验，取平均ct值与浓度对数作散点图(图1)。
[0072]
所有引物皆成功扩增，且模板浓度对数与ct值呈线性关系，溶解曲线为单峰位且各重复位置一致。从lg浓度/ct值趋势线来看，所有引物斜率绝对值大于2.8(图2)。
[0073]
目标菌种按照浓度梯度进行稀释检测，检测不同目标菌种的最低检测浓度，结果显示本发明的试剂盒检测灵敏度高。
[0074]
2.特异性检测：
[0075]
将6
‑
9号模板以终浓度0.1ng/μl加入反应体系，与各个实验组引物一一进行qpcr反应。反应程序如下：
①
95℃预变性30s；
②
95℃变性10s，65℃退火延伸10s，40循环；每引物模板组3次重复实验，检测结果如图3。
[0076]
使用非目标菌种进行检测识别，结果显示本发明的试剂盒特异性好、假阳性低。且操作简单、便捷快速：操作简单、安全、自动化程度高。速度快、高通量，可在3～4小时完成。
[0077]
实施例2：用本发明的试剂盒检测目的菌种的dna表达
[0078]
以检测24例真菌感染性肉芽肿石蜡切片标本组织结果为例。
[0079]
检测流程：获得临床真菌感染性肉芽肿组织样本，快速提取组织dna，进行rt
‑
pcr合成第一链cdna；配置pcr反应体系进行荧光定量pcr。在lightcycler数据分析系统中读出ct值结果。分别计算每个标本不同特异性基因的ct值。荧光定量pcr结果采用软件分析，并标化计算样本数据。
[0080]
具体步骤如下：
[0081]
1.1石蜡切片dna的提取
[0082]
(1)向石蜡切片样本加入试剂盒中的脱蜡液1ml，旋涡震荡30s后在65℃下水浴30min，期间旋涡震荡数次加速石蜡脱离组织。
[0083]
(2)4℃，12000rpm离心15min。石蜡会在离心后转移到上层并凝固在管壁上。用移液枪弃去上清后，用枪头将余下组织挑入新的1.5ml无菌离心管中。加入1ml脱蜡液，漩涡震荡30s。然后65℃水浴30min，期间旋涡震荡数次加速脱蜡。
[0084]
(3)4℃，12000rpm离心15min。若还有大量石蜡凝结在离心管上，像
②
中那样将组织挑入新的离心管中继续加入1ml脱蜡液。若没有或只有微量石蜡析出，则直接弃去上清后加入1ml脱蜡液。然后65℃水浴30min，期间旋涡震荡数次加速脱蜡。
[0085]
(4)向有组织和脱蜡液的离心管中加入与组织体积相近的二氧化硅粉末作为摩擦剂，漩涡震荡10s，然后室温下15000rpm离心5min，弃去上清。
[0086]
(5)关上离心管盖。将组织连同离心管投入液氮中冷冻。然后将冷冻好的离心管插入冰盒备用。
[0087]
(6)用无菌蒸馏水清洗研磨棒，然后连接到手持式研磨器上。将研磨棒伸入离心管中用力顶住冷冻好的组织，开启研磨器电源。随着研磨进程推进，组织将会被匀浆，二氧化硅的摩擦力会越来越大并使研磨棒停止转动。此时，稍稍减少压力使研磨棒继续转动约60s，即可结束研磨。
[0088]
(7)向离心管中加入试剂盒中的400μl溶液a，然后加入40μl 1mg/ml蛋白酶k，旋涡震荡混匀。56℃水浴消化3h，然后37℃水浴过夜消化直至溶液变清亮。
[0089]
(8)室温下12000rpm离心1min，取上层液体，弃去沉淀。12000rpm离心3min，取350ul下层清亮液体装入新无菌离心管，弃去上层白色粘稠浮沫和底部沉淀。
[0090]
(9)向清亮液体中加入350μl溶液b，然后75℃水浴15
‑
30min至混合液变清亮，期间颠倒混匀数次。
[0091]
(10)向液体加入350μl无水乙醇，颠倒混匀。有可能会产生絮状沉淀。将混合液与
no.20)
[0120]
1.2.2.反应体系
[0121]
实验中将提取到的dna溶液稀释10倍后与chamq universal sybr qpcr master mix及引物混合进行反应(表1)。
[0122]
表1实验中所使用的反应体系
[0123][0124]
1.2.3.反应程序
[0125]
①
95℃预变性30s。
[0126]
②
95℃解链15s，62℃退火30s，此步骤循环30次，每次退火结束后记录荧光值。
[0127]
2.实验结果：将实时荧光定量pcr所得数据进行分析获得ct值，根据不同反应孔的数据比对结果：
[0128]
表2对比传统培养方法与qpcr芯片技术检测真菌感染性肉芽肿
[0129][0130]
在24例临床确诊真菌感染性肉芽肿患者中，使用传统培养 测序的方法进行诊断，敏感性为91.67％，特异性100％，耗时1
‑
8周；使用qpcr芯片技术进行诊断，敏感性为91.67％，特异性为100％，耗时4小时，阳性预测值为90.5％，阴性预测值为100％；此外在传统培养阴性的病例中，我们使用qpcr芯片技术检测出致病菌，并且与临床诊断以及治疗结果相一致，因此qpcr芯片技术具有快速高效诊断真菌感染性肉芽肿的价值。
[0131]
上述实验可以说明，检测目标致病菌特异性its序列的dna水平，其检测结果的敏感性高，特异性高，操作简洁、快速高效，本发明的试剂盒为临床真菌感染性肉芽肿提供了一种全新基因诊断技术。
[0132]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。