取得目标多肽信息的方法及试剂盒与流程

取得目标多肽信息的方法及试剂盒
【技术领域】
1.本发明涉及取得目标多肽信息的方法及试剂盒。


背景技术：

2.作为取得多肽的尺寸相关信息的分析法，知晓荧光相关分光法(fcs)及荧光相互相关分光法(fccs)。在非专利文献1中记载了使用fcs的蛋白质的失活导致的结构变化。在此文献中记载了对于已知扩散系数的染料及受试体蛋白质而使用由fcs得到的扩散时间的比例计算推定受试体蛋白质的尺寸。在非专利文献2中记载了使用含染料标记的尺寸不同的聚苯乙烯珠等的标准试样，由荧光相关分光法求出各自的尺寸的聚苯乙烯珠的扩散时间，制成校准曲线。在此文献中记载了对于目标蛋白质而将由fcs求出的扩散时间适用于上述校准曲线而计算目标蛋白质的尺寸。
3.【现有技术文献】
4.【非专利文献】
5.【非专利文献1】eilon sherman,biophysical journal volume 94,june 2008,4819
‑
4827,“using fluorescence correlation spectroscopy to study conformational changes in denatured proteins”6.【非专利文献2】tingjuan gao,protein science 2011vol 20:437
‑
447,“characterizing diffusion dynamics of a membrane protein associated with nanolipoproteins using fluorescence correlation spectroscopy”7.【发明的概要】
8.【发明要解决的课题】
9.本发明人发现，以往的方法有测定误差大，在正确性的观点成为课题。本发明以提供更正确地取得目标多肽的尺寸相关信息的方法及试剂盒作为课题。
10.【用于解决课题的手段】
11.本发明的有的实施方式涉及取得目标多肽信息的方法。上述取得目标多肽信息的方法包括：由荧光相关分光法或荧光相互相关分光法取得荧光标记的目标多肽的扩散时间和荧光标记的多个参照多肽的各自的扩散时间的工序；及以上述荧光标记的多个参照多肽的扩散时间作为参照，从上述荧光标记的目标多肽的扩散时间取得上述荧光标记的目标多肽的尺寸相关信息的工序。其中，上述荧光标记的多个参照多肽的各自的尺寸相关信息是已知的，上述多个参照多肽的尺寸互相不同。
12.根据本实施方式的蛋白质的信息取得方法，可与非专利文献1及非专利文献2比较而更正确地取得目标多肽的尺寸相关信息。本发明的有的实施方式涉及试剂盒。
13.试剂盒的有的实施方式涉及含荧光标记的多个参照多肽的试剂盒。上述荧光标记的多个参照多肽的各自的尺寸相关信息是已知的，上述多个参照多肽的尺寸互相不同。另外，上述试剂盒在上述蛋白质的信息取得方法中使用。
14.试剂盒的别的实施方式涉及含多个参照多肽和与上述多个参照多肽的各自结合
的荧光标记抗体的试剂盒。上述荧光标记的多个参照多肽的各自的尺寸相关信息是已知的，上述多个参照多肽的尺寸互相不同。另外，上述试剂盒在上述取得目标多肽信息的方法中使用。
15.根据上述实施方式的试剂盒，可与非专利文献1及非专利文献2比较而更正确地取得目标多肽的尺寸相关信息。
16.【发明的效果】
17.可更正确地取得目标多肽的尺寸相关信息。
18.【附图的简单的说明】
19.【图1】图1显示本发明的概略。本概略是使用fccs的例。
20.【图2】图2显示试剂盒的外观。
21.【图3】图3显示在比较例1中使用的比例转换的概略。
22.【图4】图4(a)显示在pbs内对流体力学半径进行测定，基准化之后的结果。图4(b)显示在稀释血浆内对流体力学半径进行测定，基准化之后的结果。图4(c)显示作为水性溶剂，使用pbs时和使用稀释受试体时的校准曲线的差异。在图4(c)中，略语各自表示ap：抑肽酶、l：溶菌酶、ca：碳酸酐酶、bs：牛血清白蛋白、ba：β
‑
淀粉酶、af：脱铁铁蛋白、t：甲状球蛋白。误差棒表示3次的测定的标准偏差。
23.【图5】图5(a)是基于使用稀释血清测定的扩散时间而制成的校准曲线。图5(b)是基于使用稀释血浆1测定的扩散时间而制成的校准曲线。图5(c)是基于使用与稀释血浆1不同的稀释血浆2测定的扩散时间而制成的校准曲线。
24.【图6】图6(a)显示由本发明的方法对于β
‑
淀粉酶求出的预测值和理论值的差异的值。图6(b)显示对于各参照多肽而求出的预测值和理论值的差的绝对值和参照多肽的关系。
25.【图7】图7(a)显示由比较例1的方法对于β
‑
淀粉酶求出的预测值和理论值的差异的值。图7(b)在各受试体中，显示对于各参照多肽而求出的差的绝对值和参照多肽的分子尺寸的关系。
26.【图8】图8(a)显示将重组体vwf蛋白质由fccs测定时的基准化前的相互相关g(τ)和延迟时间。图8(b)显示基于本发明的方法而算出的重组体vwf蛋白质的预测值、理论值、及其差异。
27.【图9】图9(a)显示将卵清溶菌酶由fccs测定时的基准化前的相互相关g(τ)和延迟时间。图9(b)显示基于本发明的方法而算出的卵清溶菌酶蛋白质的预测值、理论值、及其差异。
28.【图10】图10(a)显示将pbs作为水性溶剂由fccs测定时的各参照多肽的扩散时间(μs)和流体力学半径的预测值。图10(b)显示基于图10(a)而制成的校准曲线。图10(c)显示由实施例4求出的预测值和理论值的差的绝对值和精度。图10(d)显示由比较例2求出的预测值和理论值的差的绝对值和精度。
29.【图11】图11(a)显示将pbs作为水性溶剂由fcs测定的各参照多肽的扩散时间(μs)和流体力学半径的预测值。另外，图11(b)显示基于图11(a)而制成的校准曲线。图11(c)显示由参考例求出的校准曲线和回归式。
30.【图12】图12(a)显示实施例5的结果，图12(b)显示参考例的结果，图12(c)显示比
较例3的结果。
31.【图13】图13(a)显示β
‑
淀粉酶的差的绝对值的比较数据。图13(b)显示甲状球蛋白的差的绝对值的比较数据。
【具体实施方式】
32.【1.取得目标多肽信息的方法】
33.【1
‑
1.用语的说明】
34.参照多肽是作为用于取得目标多肽的尺寸相关信息的参照使用的多肽，尺寸相关信息是已知的。另外，优选使用多个尺寸互相不同的参照多肽。例如，可使用2种、3种、4种、5种、6种或7种参照多肽。
35.参照多肽的尺寸对应于目标多肽的预计的尺寸适宜选择。例如，参照多肽的流体力学半径是1nm以上20nm以下。多个参照多肽至少含第1参照多肽和第2参照多肽。第1参照多肽、及第2参照多肽是互相不同的尺寸。在一实施方式中，第1参照多肽的流体力学半径和第2参照多肽的流体力学半径的差异是至少2倍。在别的实施方式中，第1参照多肽的流体力学半径是1nm以上且不足5nm，第2参照多肽的流体力学半径是5nm以上10nm以下。
36.多个参照多肽也可含第1参照多肽、第2参照多肽及第3参照多肽。第1参照多肽、第2参照多肽及第3参照多肽是各自不同的尺寸。在一实施方式中，第1参照多肽的流体力学半径是1nm以上且不足3nm，第2参照多肽的流体力学半径是3nm以上且不足6nm，第3参照多肽的流体力学半径是6nm以上且不足9nm。
37.参照多肽具体而言，可使用抑肽酶(流体力学半径1.4nm)；鸡卵清溶菌酶(流体力学半径1.9nm)；碳酸酐酶(ca)(流体力学半径2.1nm)；牛血清白蛋白(bsa)(流体力学半径3.5nm)；β
‑
淀粉酶(流体力学半径5.4nm)、脱铁铁蛋白(流体力学半径6.4nm)、甲状球蛋白(流体力学半径8.6nm)等。从这些中，可对应于目标多肽的预计的尺寸而选择2种以上。
38.目标多肽是成为测定对象的多肽。目标多肽可为来源于从生物体采集的受试体的多肽。作为受试体，可举例如，全血、血浆、血清、脑脊髓液、尿等。目标多肽可为蛋白质、蛋白质的片段、或者多肽的凝集体。多肽的凝集体也称为“聚合物”或“多聚体”，多个单体分子物理和/或化学聚合而形成。凝集体的具体例是von willebrand因子凝集体、淀粉样β凝集体、τ蛋白质凝集体、血清
‑
淀粉样
‑
a
‑
蛋白质凝集体、igg
‑
轻链凝集体、aapoai凝集体、aapoaii凝集体、attr凝集体、disc1凝集体、fus凝集体、iapp凝集体、sod1凝集体、α
‑
突触核蛋白凝集体、tdp
‑
43凝集体、huntingtin凝集体、溶菌酶凝集体等。多肽的凝集体可在疾病的存在与否等的判定中使用。例如，von willebrand因子在健康人的血中作为凝集体(von willebrand因子多聚体)存在，但在后天性von willebrand因子综合征中有此凝集体被分解的情况。即，von willebrand因子的尺寸相关信息可成为后天性von willebrand因子综合征的指标。另外，淀粉样β凝集体、τ蛋白质凝集体等的尺寸相关信息可成为阿尔茨海默病等的神经性疾病的指标。
39.荧光相关分光法(以下，有时称为“fcs”)是检测与1个分子结合的1色彩的荧光染料的方法。荧光相互相关分光法(以下，有时称为“fccs”)是检测与1个分子结合的2色彩的荧光染料的方法。进行由fcs或fccs的解析的装置是公知的。例如，通过将倒置显微镜zeiss axioobserver(carl zeiss株式会社)和同公司的zen software组合fcs及fccs的两方的解
析是可能的。另外，作为fcs的解析装置，可举例如荧光相关分光装置fcs紧凑系列(浜松photonics株式会社)。作为fccs的解析装置，可举例如荧光相互相关分光装置fccs紧凑(浜松photonics株式会社)。
40.扩散时间一般以记号τ
d
等表示，可以例如微秒(μs)或毫秒等的单位表示。
41.作为由fcs或fccs取得的尺寸相关信息，例示流体力学半径、流体力学直径、体积等。流体力学半径及流体力学直径可以例如纳米(nm)等的单位表示。体积可以立方纳米(nm3)等的单位表示。
42.在fcs中使用的荧光染料由于是1色彩，还可使用可由fcs解析装置检测的范围之任一者的荧光染料。
43.一方面，fccs使用2种荧光染料，大致同时检测这些荧光染料。因此，使用的2种荧光染料的荧光波长优选互相不同。例如，在2色彩的荧光染料之中一方的荧光染料的荧光波长的峰是400nm～550nm的范围时，另一方的荧光染料的荧光波长的峰优选为600nm～800nm的范围。当以激发波长表现时，在2色彩的荧光染料之中一方的荧光染料的激发波长的峰是400nm～500nm的范围时，另一方的荧光染料的激发波长的峰优选为530nm～700nm的范围。例如，在对于一方的荧光染料使用alexa fluor(商标)488、fitc、cy3、cy2等时，可对于另一方的荧光染料使用alexa fluor(商标)647、若丹明、cy5等。在使用荧光光谱重叠的2种荧光染料时，例如，也可经带通滤波器等而检测荧光信号。
44.标记在目标多肽的荧光染料和标记在参照多肽的荧光染料优选为相同。
45.在参照多肽或目标多肽中，可由公知的方法经共价键等的化学结合标记荧光染料。以下，经化学结合的荧光标记方法也称为直接标记法。例如，可利用氨基标记、巯基标记等而将荧光染料由共价键标记在多肽。氨基标记可使用荧光染料的n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)酯、磺基二氯苯酚(sdp)酯、四氟苯基(tfp)酯等，由上述酯和多肽的胺的胺偶联反应标记荧光染料。另外，巯基标记可由荧光染料的马来酰亚胺衍生物和多肽的巯基的共价键标记荧光染料。
46.在进行标记时、多肽和荧光染料酯或荧光染料衍生物在指定的反应缓冲液内混合。多肽和荧光染料酯或荧光染料衍生物的混合比可设为相对于多肽1摩尔而荧光染料酯或荧光染料衍生物2摩尔至50摩尔。在使用2个荧光染料时，例如，可设为相对于多肽1摩尔而第1荧光染料酯或第1荧光染料衍生物2摩尔至50摩尔及第2荧光染料酯或第2荧光染料衍生物2摩尔至50摩尔。优选以第1和第2荧光染料酯或荧光染料衍生物的摩尔比变得相同的方式混合。
47.标记反应可一边在暗处，例如于20℃～28℃搅拌，一边进行30分钟至2小时左右。
48.被荧光标记的多肽可通过将反应液使用脱盐－缓冲液交换用柱等脱盐，除去未反应的荧光染料酯或荧光染料衍生物来纯化。作为脱盐－缓冲液交换用柱，可使用例如，hitrap desalting(ge healthcare cat.no.29048684)。
49.作为别的实施方式，可对参照多肽或目标多肽使用荧光标记探针而由公知的方法经探针标记荧光染料。以下，经探针的荧光标记方法也称为间接标记法。其中，探针只要是可与各参照多肽、或者目标多肽等特异性地结合，就不限制。在本说明书中，特异性地结合是指也可包括对测定产生不良影响的程度的非特异性的反应。在探针中，含抗体、凝集素、适体等。探针优选是抗体。在抗体中，还可使用多克隆抗体、单克隆抗体、及它们的片段(例
如，fab、f(ab')、f(ab)2等)之任一者。免疫球蛋白的类及亚类不特别限制。上述抗体可为从抗体库筛选的，也可为嵌合抗体、scfv、单结构域抗体(sdab)等。另外，在抗体中，还可包括骆驼科动物来源重链抗体的vhh(重链抗体的重链的可变结构域，variable domain of heavy chain of heavy chain antibody)结构域、软骨鱼类(例如鲨)重链抗体ignar(新抗原受体，new antigen receptor)来源的vnar(可变新抗原受体，variable new antigen receptor)结构域等。作为荧光标记探针使用的抗体优选使用其本身的分子尺寸小的fab、vhh、vnar、scfv。
50.在fcs中，可对于与各参照多肽、或者目标多肽结合的探针标记相同的荧光波长的荧光染料、优选相同的荧光染料。
51.在fccs中，可使上述1
‑
1中所述的荧光波长不同的2种荧光染料与多肽结合，以参照多肽含2种荧光染料的方式进行荧光标记。此时，优选使含2种荧光染料之中一方的荧光染料的第1探针和含另一荧光染料的第2探针与多肽结合。对于目标多肽，也同样地可使荧光波长不同的2种荧光染料与不同的2个探针结合而以目标多肽含2种荧光染料的方式进行荧光标记。此时，优选标记在参照多肽的2种荧光染料与标记在目标多肽的荧光染料相同。
52.第1探针和第2探针识别的多肽内的区域可不同，也可相同，优选不同。在探针是抗体时，含第1荧光染料的第1抗体的表位和含第2荧光染料的第2抗体的表位优选为1个多肽内不同的部位。
53.荧光标记探针可在pbs等的缓冲液内、受试体内、或者稀释受试在体内，与各参照多肽、或者目标多肽混合结合。稀释受试体可为被pbs、生理盐水等稀释为1.5倍至10倍左右的受试体。反应时间是例如，室温(约23℃～27℃)、3分钟至7分钟左右。荧光标记抗体可例如，以50nm～150nm左右蛋白质浓度添加。可由此反应调制被荧光标记的各参照多肽、或者被荧光标记的目标多肽。
54.【1
‑
2.取得目标多肽信息的方法】
55.本发明的有的实施方式涉及取得目标多肽信息的方法(以下，有时简称为“信息取得方法”)。信息取得方法包括由fcs或fccs取得荧光标记的目标多肽的扩散时间和荧光标记的多个参照多肽的扩散时间的第1工序，基于荧光标记的多个参照多肽的扩散时间而取得荧光标记的目标多肽的尺寸相关信息的第2工序。
56.(1)第1工序：扩散时间取得工序
57.在第1工序中，从各标准样品取得荧光标记的参照多肽的扩散时间。标准样品可使用由直接标记荧光标记的参照多肽或由间接标记荧光标记的参照多肽调制。在标准样品中，包括含荧光标记的第1参照多肽的第1标准样品和含荧光标记的第2参照多肽的第2标准样品。从而，从各标准样品取得的扩散时间含荧光标记的第1参照多肽的扩散时间、及荧光标记的第2参照多肽的扩散时间。在标准样品还包括含荧光标记的第3参照多肽的第3标准样品时，从标准样品取得的扩散时间至少含荧光标记的第1参照多肽的扩散时间、荧光标记的第2参照多肽的扩散时间、及荧光标记的第3参照多肽的扩散时间。
58.在将各参照多肽由直接标记法荧光标记时，在一实施方式中，可在水性溶剂中使参照多肽和荧光染料反应，以该反应液作为标准样品使用。在别的实施方式中，可将被荧光标记的参照多肽和水性溶剂混合，以该混合液作为标准样品使用。针对每参照多肽调制标准样品。在本说明书中的“水性溶剂”只要是液状的溶剂，就不特别限定。作为水性溶剂，例
示水、缓冲液、生理盐水等。另外，也可以从生物体采集的液状的受试体作为“水性溶剂”使用。受试体可含细胞等的不溶性成分，例示全血、血浆、血清、脑脊髓液、尿等的受试体。另外，受试体也可根据需要由公知的方法进行不溶性成分的除去或稀释等的预处理。
59.在将参照多肽由间接标记法荧光标记时，在一实施方式中，在水性溶剂中使参照多肽和荧光探针反应。在此实施方式中可以该反应液作为标准样品使用。在别的实施方式中，可将被荧光标记的参照多肽和水性溶剂混合，以该混合液作为标准样品使用。
60.再者，在第1工序中，从测定样品取得被荧光标记的目标多肽的扩散时间。
61.可使用由直接标记法荧光标记的目标多肽或由间接标记法荧光标记的目标多肽而调制测定样品。在将目标多肽由直接标记法荧光标记时，在一实施方式中，可在水性溶剂中使目标多肽和荧光染料反应，以该反应液作为测定样品使用。
62.在将目标多肽由间接标记法荧光标记时，在一实施方式中，在水性溶剂中使目标多肽和荧光探针反应。在此实施方式中可以该反应液作为测定样品使用。在别的实施方式中，可将被荧光标记的目标多肽和水性溶剂混合，以该混合液作为测定样品使用。
63.液中的分子的扩散时间受水性溶剂的粘度影响。从而，优选含荧光标记的参照多肽的水性溶剂的粘度和含荧光标记的目标多肽的水性溶剂的粘度是同程度。更优选含荧光标记的参照多肽的水性溶剂和含荧光标记的目标多肽的水性溶剂相同。在测定样品是荧光标记的目标多肽含在含从生物体采集的受试体等的杂质的水性溶剂时，标准样品优选通过将荧光标记的各参照多肽、测定样品中使用的水性溶剂和相同的水性溶剂混合来调制。此时，在更优选的实施方式中，将从生物体采集的受试体等的水性溶剂分割为多个，一方添加标记目标多肽的荧光标记探针，另一方添加荧光标记的参照多肽。由此，可调制含荧光标记的目标多肽的测定样品和含荧光标记的参照多肽的标准样品。更具体而言，将含从生物体采集的目标多肽的受试体分割为第1等份、第2等份及第3等份。通过将第1等份和与目标多肽结合的荧光标记探针混合，可调制含荧光标记的目标多肽的测定样品。通过将第2等份和荧光标记的第1参照多肽混合，可调制第1标准样品。另外，通过将第3等份和荧光标记的第2参照多肽混合，可调制第2标准样品。
64.含被荧光标记的各参照多肽或被荧光标记的目标多肽的测定样品的粘度优选为于23℃，0.800～30.00mpa.s左右。另外，肽溶液中所含的荧光染料的量优选以成为0.1nm～1000nm左右的方式调制。
65.在一实施方式中，目标多肽和荧光染料的结合样式与参照多肽和荧光染料的结合样式相同。例如，在荧光染料由直接标记结合于目标多肽时，也可向参照多肽由直接标记结合荧光染料。在荧光染料由间接标记结合于目标多肽时，也可向参照多肽由间接标记结合荧光染料。此时，优选在目标多肽和荧光染料的间接标记中使用的荧光标记探针的种类与在参照多肽和荧光染料的间接标记中使用的荧光标记探针的种类相同。作为具体例，目标多肽由与所述目标多肽特异性地结合的荧光标记抗体标记，参照多肽由与所述参照多肽特异性地结合的荧光标记抗体标记。
66.在别的实施方式中，目标多肽和荧光染料的结合样式与参照多肽和荧光染料的结合样式相异。由于参照多肽只要是可对于多肽的尺寸相关信息而成为目标多肽的参照即可，无结合样式必然相同的必要。例如，在荧光染料由直接标记结合于目标多肽时，也可向参照多肽由间接标记结合荧光染料。在荧光染料由间接标记结合于目标多肽时，也可向参
照多肽由直接标记结合荧光染料。作为具体例，目标多肽由与所述目标多肽特异性地结合的荧光标记抗体标记，参照多肽是，所述参照多肽经共价键而由荧光染料标记。
67.在后述的扩散时间的取得中，可各自取得测定样品中的荧光标记的目标多肽的扩散时间、第1标准样品中的荧光标记的第1参照多肽的扩散时间和第2标准样品中的荧光标记的第2参照多肽的扩散时间。
68.向384孔的玻璃底板(sigma
‑
aldrich，m4437
‑
16ea)等独立地分注各30μl左右各样品，供于测定。标准样品及测定样品的测定时的温度优选设为同程度，例如，更优选在23℃～25℃左右测定。
69.在测定中使用的激光只要是可激发各样品中所含的荧光染料，就不限制。激光收缩焦点至1fl区域左右，在检测样品中的荧光标记多肽通过共聚焦区域之时发的荧光信号。在fcs中，使用1个激光激发荧光染料，经时取得荧光信号。在fccs中，使用2个激光激发荧光染料，经时取得荧光信号。检测的荧光信号的原始数据是以信号强度和测定时间表示的数据组。此原始数据的处理由于用fcs和fccs而不同，接下来将两者分开进行说明。
70.在原始数据中，也可根据需要，进行删除显示基线的漂移或爆裂(平均荧光亮度和3倍以上高的荧光信号)的测定值的预处理。
71.(i)fcs
72.由上述的fcs解析装置取得单一波长的光子测量的原始数据。进行原始数据的自身相关分析，取得自身相关函数的原始曲线。对于自身相关函数的曲线进行由适合的拟合模型的拟合，求出由相关函数g(τ)和延迟时间(τ)绘制的相关曲线。
73.在测定样品及标准样品使用从生物体采集的受试体调制时，可用2成分模型进行由自身相关函数的拟合。在2成分模型中使用的第1成分可例如作为未反应的荧光标记探针。第2成分可作为各多肽和与这些相对应的荧光标记探针的各复合体。例如，在zen software等的解析软件上，选择1成分模型，针对每荧光标记探针，对第1成分的扩散时间进行测定。接下来，在相同的软件上，选择2成分模型，将第1成分的扩散时间固定于先测定的第1成分的扩散时间，对第2成分的扩散时间进行测定。
74.(ii)fccs
75.由上述的fccs解析装置取得2波长的光子测量原始数据。进行原始数据的相互相关分析，取得相互相关函数的原始曲线。对于相互相关函数的曲线用适合的拟合模型进行拟合，得到以例如x轴是延迟时间(τ)、y轴是相互相关函数g(τ)表示的相关曲线。具体性的函数示于实施例的方程1a、方程1b、方程2、及方程3。
76.在fccs中，可用1成分模型进行相关函数的拟合。1成分是各多肽和与这些相对应的荧光标记探针的各复合体。在zen software等的软件上，选择1成分模型，对各复合体的扩散时间进行测定。由于fccs相对于1个多肽而使用2种荧光染料，精度更高的解析是可能的。
77.其中，以τ＝0之时的g(τ)的值作为原点的值，扩散时间表示原点的值成为1/2之时的延迟时间τ。具体而言，在延迟时间(τ)是0的g(τ)值、即g(0)是a时，扩散时间是指成为g(τ)＝a
×
1/2的延迟时间τ。更具体而言，在相关函数g(τ)中，将g(0)之时的值换算为1之时、扩散时间是成为g(τ)＝0.5的延迟时间τ。从而，相关函数g(τ)也可以最大值成为“1”、最小值成为“0”的方式基准化。在使相关函数g(τ)基准化时，最大值及最小值的组合可适宜设
定。例如，可作为最大值是“2”及最小值是“1”的组合，也可作为最大值是“100”及最小值是“0”的组合等。
78.(2)第2工序：信息取得工序
79.可以与第1工序中得到的各标准样品中所含的参照多肽的指定的g(τ)值相对应的扩散时间作为参照，从目标多肽的扩散时间取得目标多肽的尺寸相关信息。在取得荧光标记的第1参照多肽的扩散时间、及荧光标记的第2参照多肽的扩散时间时，以这些作为参照，取得目标多肽的尺寸相关信息。在取得荧光标记的第1参照多肽的扩散时间、荧光标记的第2参照多肽的扩散时间、及荧光标记的第3参照多肽的扩散时间时，以这些作为参照，取得目标多肽的尺寸相关信息。
80.优选基于与各标准样品中所含的参照多肽的指定的g(τ)值相对应的扩散时间和预先分的各自的参照多肽的尺寸而求出回归式，制成校准曲线。取得与和参照多肽的指定的g(τ)值相同的目标多肽的g(τ)值相对应的扩散时间。将取得的目标多肽的扩散时间适用于校准曲线，取得目标多肽的尺寸相关信息。其中求出的目标多肽的尺寸是未被荧光标记的目标多肽的尺寸。
81.(3)实施方式的一例
82.对于本实施方式的方法的原理而使用图1中所示的具体例进行说明。图1中所示的例终究是一例，本发明不限定于此例而解释。在图1中，显示使用荧光相互相关分光法的信息取得方法。
83.在工序a中对于被荧光染料标记的多个参照多肽而由fccs取得扩散时间(也称为延迟时间)τ。溶液中的分子由布朗运动等常常自由移动。fcs及fccs使用共聚焦激光，在检测溶液中的分子通过共聚焦区域之时发的荧光信号。检测的荧光信号的原始数据以信号强度和测定时间表示。将其在fccs中用相互相关函数拟合，得到了例如x轴以扩散时间(τ)、y轴以相关函数g(τ)表示的相关曲线。在fcs的情况中，将检测的荧光信号的原始数据用自身相关函数拟合，可得到相关函数g(τ)的曲线。其中，工序a中所示的相关函数g(τ)是基准化后的相关曲线。
84.在工序b中，制成校准曲线。参照多肽由于预先得知尺寸，可从与各自的参照多肽中的一定的g(τ)值相对应的扩散时间和各自的参照多肽的尺寸(其中，流体力学半径)求出回归式，制成校准曲线。
85.工序c是求出荧光标记的目标多肽的扩散时间的工序。扩散时间可与参照多肽的扩散时间同样地求出。
86.工序a和工序c相当于取得荧光标记的目标多肽的扩散时间和荧光标记的多个参照多肽的扩散时间的工序。工序a和工序c的顺序不限定。可在工序c之前进行工序a，也可在工序a之前进行工序c，还可同时进行工序a和工序c。
87.工序d是从工序b中制成的校准曲线和工序c中求出的目标多肽的扩散时间取得目标多肽的尺寸相关信息的工序。将与制成校准曲线之时的g(τ)值相对应的目标多肽的扩散时间适用于校准曲线，取得目标多肽的分子的尺寸相关信息。
88.【2.试剂盒】
89.本发明的有的实施方式涉及试剂盒。试剂盒含上述1
‑
2.中所述的荧光标记的多个参照多肽。此试剂盒可作为用于取得目标多肽的尺寸相关信息的校准物使用。荧光标记的
多个参照多肽优选各自收容在不同的容器。试剂盒可作为图2中所例示的试剂盒提供于使用者。试剂盒50含外装箱55、收纳被荧光标记的第1参照多肽的第1容器51、收纳被荧光标记的第2参照多肽的第2容器52、收纳被荧光标记的第3参照多肽的第3容器53和试剂盒的附带文书54。在附带文书54中，可记载了试剂盒的对待方法、储存条件、使用期限等。也可将含稀释用的水性溶剂的容器等同装在外装箱55。
90.另外，试剂盒也可作为含多个参照多肽和与上述多个参照多肽的各自结合的荧光标记抗体的试剂盒提供于使用者。
91.与多个参照多肽的各自结合的荧光标记抗体也可含结合于1个参照多肽的第1荧光标记抗体和第2荧光标记抗体。优选标记在第1荧光标记抗体的荧光染料的荧光波长与标记在上述第2荧光标记抗体的荧光染料的荧光波长不同。另外，优选第1荧光标记抗体的表位与第2荧光标记抗体的表位不同。
92.【实施例】
93.接下来，使用实施例对于本发明更详细地进行说明。但是，本发明不限定于实施例解释的。
94.【i.方法】
95.【1.参照多肽】
96.作为参照多肽，使用抑肽酶(sigma
‑
aldrich，a3886
‑
1vl，流体力学半径1.4nm)；鸡卵清溶菌酶(sigma
‑
aldrich，l4919
‑
500mg，流体力学半径1.9nm)；碳酸酐酶(ca)(sigma
‑
aldrich，c7025
‑
1vl，流体力学半径2.1nm)；牛血清白蛋白(bsa)(sigma
‑
aldrich，a8531
‑
1vl，流体力学半径3.5nm)；β
‑
淀粉酶(sigma
‑
aldrich，a8781
‑
1vl，流体力学半径5.4nm)、脱铁铁蛋白(sigma
‑
aldrich，a3660
‑
1vl，流体力学半径6.4nm)、甲状球蛋白(sigma
‑
aldrich，t1001
‑
100mg，流体力学半径8.6nm)。
97.【2.向多肽的荧光标记】
98.(1)荧光染料向多肽的直接标记
99.使用alexa fluor(商标)647(invitrogen，cat.no.a20006)、和/或alexa fluor(商标)488(invitrogen，cat.no.a20000)的n
‑
羟基琥珀酰亚胺基(nhs)酯而对参照多肽及目标多肽的胺由胺偶联反应标记荧光染料。在用fcs测定的各多肽中，对上述之中任何1种荧光染料进行标记。在用fccs测定的各多肽中，对上述的2种荧光染料进行标记。胺偶联反应将荧光染料和多肽在pbs之中混合，于暗处、室温一边以400rpm搅拌，一边进行1小时。
100.在fcs中，多肽和荧光染料的nhs酯的混合比以摩尔比设为抑肽酶:荧光染料＝1:2、ca:荧光染料＝1:2、溶菌酶:荧光染料＝1:2、bsa:荧光染料＝1:5、β
‑
淀粉酶:荧光染料＝1:20、脱铁铁蛋白:荧光染料＝1:20、甲状球蛋白:荧光染料＝1:50。在fccs中使用2个荧光染料时，例如，将摩尔比设为如抑肽酶:第1荧光染料:第2荧光染料＝1:2:2一样，以第1和第2荧光染料的摩尔比变得相同的方式混合。
101.胺偶联反应后，使用hitrap desalting column(ge healthcare cat.no.29048684)而使反应液脱盐，除去未反应的荧光染料。将脱盐后的反应液供于进一步使用tskgel g3000swxl column(tosoh cat.no.08541)的超高效液相层析法(ultra high performance liquid chromatography，uhplc)，对荧光标记多肽的品质进行解析。
102.荧光标记多肽的品质通过取得230nm～700nm的区域的荧光光谱，对来源于蛋白质
的280nm的区域和各荧光染料的荧光波长区域的峰进行观察来评价。
103.(2)荧光染料向多肽的间接标记
104.间接标记在检测含血清或如血浆一样多数的成分的受试体中的目标多肽的测定中使用。
105.通过使结合了针对目标多肽的alexa fluor(商标)647或alexa fluor(商标)488的标记抗体与受试体中所含的各多肽反应，对目标多肽进行间接荧光标记。在用fccs测定的各多肽中，使用alexa fluor(商标)647标记抗体和alexa fluor(商标)488标记抗体的两方进行标记。
106.向血清或血浆添加与受试体相同的量的荧光标记抗体溶液。在添加荧光标记抗体后，暗处、室温、5分钟混合，温育。其后，13,000rpm离心/5分钟，以上清作为测定样品。
107.【3.测定】
108.(1)荧光标记参照多肽的测定
109.在作为水性溶剂而使用pbs时，将直接标记荧光染料的各荧光标记参照多肽以成为100nm的方式添加到pbs中，作为校准曲线制成用的标准样品。在作为水性溶剂而使用稀释受试体时，向血清或血浆以成为100nm的方式添加各荧光标记参照多肽而作为校准曲线制成用的标准样品。
110.向用封闭试剂n101(日本油脂、71s410050011)预先封闭的384孔的玻璃底板(sigma
‑
aldrich，m4437
‑
16ea)添加各30μl各自的标准样品，供于测定。测定在具备lsm710激光模块的zeiss axioobserver的confocor3配置中进行。alexa fluor(商标)488用488nm的激光激发。alexa fluor(商标)647用633nm激光激发。488nm及633nm的激光各自以8mw及1.2mw输出。将各孔1次的测定设为20秒钟，进行10次的测定。即，将各孔的总测定时间设为200秒钟。相关函数基于此10次的测定而算出。测定时的温度设为23℃。在fcs解析、及fccs解析中，使用zeiss公司的zen software。
111.(2)各函数的拟合和多肽的尺寸推定
112.使用zen software，对于取得的原始数据进行删除显示基线的漂移或爆裂(平均荧光亮度和3倍以上高的荧光信号)的测定值的预处理。在fccs中使用的相互相关、及在fcs中使用的自身相关曲线的拟合由基于3d扩散模型的1成分或2成分拟合(3d、或者3d 3d、或者t
×
3d、或者t
×
{3d 3d})进行。
113.用于求出3维1成分相关曲线(3d)的拟合函数g(τ)以下述方程1a表示。用于求出3维2成分相关曲线(3d 3d)的拟合函数g(τ)以下述方程1b表示。两方的函数均显示并进扩散过程。在从相互相关曲线算出并进扩散时间时，如下述方程1a或方程1b一样使用拟合模型。
114.【数1】
[0115][0116]
【数2】
[0117][0118]
在方程1a中，n表示振幅(分子数)。τ
d
表示扩散时间(μs)。τ表示延迟时间。ω(结构因子)是激光焦点体积的横(xy)幅及纵(z)轴幅的比(w
z
/w
xy
)。在方程1b中，q是量子收率。
[0119]
结构因子基于从作为参照使用的100nm的alexa fluor(商标)488和10nm的alexa fluor(商标)647的染料混合物得到的公知的扩散时间而在测定开始时每日分配。
[0120]
为了算出三重项状态迁移时间(t)，如以下方程2一样使用拟合模型。下述方程2显示三重项状态迁移。
[0121]
【数3】
[0122][0123]
在方程2中，τ显示三重项状态振幅。τ
t
显示染料荧光团的三重项状态迁移。
[0124]
自身相关函数的情况如含并进扩散时间及染料的三重项状态迁移时间两方(t
×
3d、或者t
×
{3d 3d})的以下方程3一样使用拟合模型。
[0125]
【数4】
[0126][0127]
上述各数学式是公知的(krichevsky and bonnet,2002.fluorescent correlation spectroscopy,the technique and its applications.rep.prog.phys.65 251)。
[0128]
(i)使用受试体的fcs解析
[0129]
fcs用2成分模型进行自身相关函数的拟合。以第1成分作为未反应荧光标记抗体。第2成分作为各参照多肽和与这些相对应的荧光标记抗体的各免疫复合体。首先，在zen software上，选择1成分模型，针对每荧光标记抗体，将第1成分的扩散时间用不含抗原的别的独立的实验系测定(tp
488
或tp
647
)。接下来，在zen software上，选择2成分模型，将第1成分的扩散时间固定于先测定的第1成分的扩散时间(tp
488
或tp
647
)。对第2成分的扩散时间进行测定。求出取得的扩散时间和各参照多肽的流体力学半径(nm)的回归式，制成校准曲线。
[0130]
对于目标多肽而也求出与参照多肽同样地扩散时间，从校准曲线算出流体力学半径。
[0131]
(ii)使用稀释受试体的fccs解析
[0132]
fccs用1成分模型进行相关函数的拟合。1成分是各多肽和与这些相对应的荧光标记抗体的各免疫复合体。在zen software上，选择1成分模型，对各免疫复合体的扩散时间
进行测定。求出取得的扩散时间和各参照多肽的流体力学半径(nm)的回归式，制成校准曲线。对于目标多肽而也求出与参照多肽同样地扩散时间，从校准曲线算出流体力学半径。
[0133]
【ii.比较例1】
[0134]
作为比较例1，使用记载在非专利文献1的比例转换。图3显示比例转换的概略。在比例转换中，首先，作为标准品将已知流体力学半径r
hc
的alexa fluor(商标)488(流体力学半径r
hc
＝0.7nm)的扩散时间和alexa fluor(商标)647(流体力学半径r
hc
＝0.8nm)的扩散时间由fcs测定(图3的工序1)。测定时的温度设为23℃。接下来，求出标准品的自身相关函数，修正荧光染料的扩散时间(图3的工序2)。接下来，将荧光标记目标多肽的扩散时间用fcs测定，从荧光染料的扩散时间τ
dc
(μs)、荧光标记目标多肽的扩散时间τ
d
(μs)和作为标准品而流体力学半径r
hc
求出荧光标记目标多肽的流体力学半径r
h
。
[0135]
【iii.实施例1】
[0136]
根据上述i.中说明的方法，作为水性溶剂，使用pbs或稀释受试体，作为参照多肽，使用抑肽酶、溶菌酶、ca、bsa、β
‑
淀粉酶、脱铁铁蛋白、甲状球蛋白而用fccs测定扩散时间，制成校准曲线。再者，以血清1例、受试者不同的血浆2例作为受试体使用而制成校准曲线。
[0137]
图4显示作为水性溶剂而使用pbs时和使用稀释血浆时的扩散时间(延迟时间(s))的差异。图4(a)显示在pbs内对流体力学半径进行测定，基准化之后的结果。图4(b)显示在稀释血浆内对流体力学半径进行测定，基准化之后的结果。在图4(b)中，与图4(a)相比，相关曲线向右变动。另外，图4(c)显示作为水性溶剂而使用pbs时和使用稀释血浆时的校准曲线的差异。在作为水性溶剂而使用pbs时和使用稀释血浆时，校准曲线的斜率不变，但pbs的方截距变低。因此，在比pbs粘度高的稀释血浆中，显示分子移动速度变慢。
[0138]
图5显示使用不同的3种受试体取得的校准曲线。图5(a)是基于使用稀释血清测定的扩散时间而制成的校准曲线。图5(b)是基于使用稀释血浆1测定的扩散时间而制成的校准曲线。图5(c)是基于使用与稀释血浆1不同的稀释血浆2测定的扩散时间而制成的校准曲线。与血浆相比，血清的扩散时间短。另外，关于血浆，也显示因受试体而扩散时间有差异。
[0139]
从这些结果认为，为了预测目标多肽的尺寸，优选参照多肽的测定也在与目标多肽同等的溶剂环境中进行，制成校准曲线。
[0140]
另外，将参照多肽的各自假定为目标多肽，基于使用本发明的fccs的稀释受试体的测定系而得到的校准曲线而算出各参照多肽的流体力学半径的预测值。受试体使用血清、血浆1或血浆2。进而，以作为凝胶过滤层析法标志物记载的分子尺寸作为流体力学半径的理论值而求出预测值和理论值之间的差异、及差的绝对值。图6(a)显示对于β
‑
淀粉酶而求出的差异的值。另外，图6(b)显示在各受试体中对于各参照多肽而求出的差的绝对值和参照多肽的流体力学半径的关系。
[0141]
再者，根据比较例1的方法而同样地算出参照多肽的预测值，与各自的参照多肽的理论值比较。结果示于图7。图7(a)显示对于β
‑
淀粉酶而求出的预测值和理论值的差异的值。图7(b)显示在各受试体中对于各参照多肽而求出的差的绝对值和参照多肽的分子尺寸的关系。在记载在比较例1的方法中，在作为标准品而使用alexa fluor(商标)488及alexa fluor(商标)647的荧光染料时，预测值和理论值的差异也大。另外，即使在使用3种受试体之任一者时，预测值和理论值的差异也大。特别是显示，参照肽的流体力学半径变得越大，预测值和理论值的差异变得越大。
[0142]
从这些结果显示，相比比较例，本发明的信息收集方法的预测精度更高。
[0143]
【iv.实施例2】
[0144]
为了证明对于大的尺寸的多肽，由本发明的信息的取得方法进行流体力学半径的预测是可能的，根据使用fccs的本发明的信息取得方法而预测von willebrand因子(von willebrand factor：vwf；分子量约250kda)的分子尺寸。
[0145]
作为阳性样品，调制以终浓度成为25nm的方式将重组体vwf蛋白质(merck、681300
‑
100ugcn)添加到血浆中的样品。作为阴性样品，调制不添加重组体vwf蛋白质而将与重组体vwf蛋白质溶液相同的量的缓冲液添加到血浆中的样品。阳性样品和阴性样品进行接下来显示的同样的处理。
[0146]
向各样品添加alexa fluor(商标)488标记2f2a9抗体(bd biosciences、555849)及alexa fluor(商标)647标记nmc4 fab至终浓度各自成为100nm，暗处于室温，反应5分钟。nmc4 fab从公知的nmc4 fab的氨基酸序列由基因重组制作。根据记载在上述3.的方法而进行fccs的测定。
[0147]
结果示于图8。图8(a)显示基准化前的相互相关g(τ)和延迟时间。图8(b)显示基于本发明的信息取得方法而算出的重组体vwf蛋白质的预测值、理论值、及其差异。
[0148]
在不与抗体反应的状态下，重组体vwf蛋白质的流体力学半径的理论值是16.25nm，是比较大的蛋白质。即使是这样大的蛋白质，预测值和实测值的差异也小至2.3nm，显示高精度地预测是可能的。
[0149]
【v.实施例3】
[0150]
为了证明对于小的尺寸的多肽，由本发明的信息的取得方法进行流体力学半径的预测是可能的，根据使用fccs的本发明的信息取得方法而预测卵清溶菌酶(分子量约14kda；流体力学半径3nm)的流体力学半径。
[0151]
作为阳性样品，调制以终浓度成为100nm的方式将卵清溶菌酶蛋白质(sigma
‑
aldrich、l4919
‑
500mg)添加到血浆中的样品。作为阴性样品，调制不添加卵清溶菌酶蛋白质而将与卵清溶菌酶蛋白质溶液相同的量的缓冲液添加到血浆中的样品。阳性样品和阴性样品进行接下来显示的同样的处理。
[0152]
向各样品添加alexa fluor(商标)488标记cab
‑
lys2 vhh及alexa fluor(商标)647标记d2l24 vhh至终浓度各自成为100nm，暗处于室温，反应5分钟。cab
‑
lys2 vhh及d2l24 vhh从各自公知的cab
‑
lys2 vhh的氨基酸序列及d2l24 vhh的氨基酸序列由基因重组制作。根据记载在上述3.的方法而进行fccs的测定。
[0153]
结果示于图9。图9(a)显示基准化前的相互相关g(τ)和延迟时间。图9(b)显示基于本发明的信息取得方法而算出的卵清溶菌酶蛋白质的预测值、理论值、及其差异。
[0154]
在不与抗体反应的状态下，卵清溶菌酶蛋白质的流体力学半径的理论值是3nm，是比较小的蛋白质。即使是这样小的蛋白质，预测值和实测值的差异也小至0.5nm，显示高精度地预测是可能的。
[0155]
【vi.实施例4及比较例2】
[0156]
在作为水性溶剂而使用pbs的测定系中，评价将本发明的信息取得方法由fccs实施时的预测精度。
[0157]
在实施例4中，使用作为上述3.中所述的水性溶剂而使用pbs的fccs的测定系，使
用被上述的2色彩的荧光染料双标记的参照多肽而制成校准曲线。将各自的参照多肽假定为目标多肽，从校准曲线求出各自的参照多肽的流体力学半径。图10(a)显示在fccs中的各参照多肽的扩散时间(μs)和流体力学半径的预测值。另外，图10(b)显示基于图10(a)而制成的校准曲线。图10(c)显示由实施例4求出的预测值和理论值的差的绝对值和精度。精度(％)通过从100％减去％误差来求出。％误差由100
×
[(差的绝对值)
÷
(理论值)]的式求出。
[0158]
另外，在比较例2中，使用用fccs测定的扩散时间测定值τ
dc
而与比较例1同样地由非专利文献1中记载的比例转换预测流体力学半径。但是，标准品，为了可用fccs测定，使用除了荧光染料之外使alexa fluor(商标)647标记抗bsa抗体、及alexa fluor(商标)488标记抗bsa抗体结合的bsa。另外，测定系以pbs作为水性溶剂使用。双荧光标记bsa的流体力学半径r
hc
是3.5nm，扩散时间测定值τ
dc
是230μs。将双荧光标记的各自的参照多肽假定为目标多肽，根据比较例1的方法而求出各自的参照多肽的流体力学半径。图10(d)显示由比较例2求出的预测值和理论值的差的绝对值和精度。用语的定义与图10(c)同样。
[0159]
比较例2由于作为标准品而使用bsa，差的绝对值成为0、预测精度成为100％，但除此之外，本发明的实施例4的方精度高。
[0160]
【vii.实施例5、参考例及比较例3】
[0161]
在作为水性溶剂而使用pbs的测定系中，评价由fcs实施本发明的信息取得方法时的预测精度。
[0162]
在实施例5中，使用作为上述3.中所述的水性溶剂而使用pbs的fcs的测定系，使用被上述的2色彩的荧光染料标记的参照多肽而制成校准曲线。将各自的参照多肽假定为目标多肽，从校准曲线求出各自的参照多肽的流体力学半径。作为校准曲线，图11(a)显示在fcs中的各参照多肽的扩散时间(μs)和流体力学半径的预测值。另外，图11(b)显示基于图11(a)而制成的校准曲线。
[0163]
参考例是在作为记载在非专利文献2的校准物使用荧光珠的方法中测定的例。如图11(c)所示，用fcs测定各种各样的粒径的荧光珠的扩散时间(m秒)，基于扩散时间和粒径而制成回归式，向此回归式适用荧光标记的目标多肽的fcs中测定的扩散时间。将与alexa fluor(商标)647标记抗体反应的各自的参照多肽假定为目标多肽而求出流体力学半径。
[0164]
比较例3是用与ii中所述的比较例1同样的方法求出流体力学半径的例。作为标准品，使用alexa fluor(商标)647染料。另外，测定系以pbs作为水性溶剂使用。alexa fluor(商标)647染料的流体力学半径r
hc
是0.8nm，扩散时间测定值τ
dc
是49μs。将荧光标记的各自的参照多肽假定为目标多肽，根据比较例1的方法而求出各自的参照多肽的流体力学半径。
[0165]
图12(a)显示实施例5的结果，图12(b)显示参考例的结果，图12(c)显示比较例3的结果。实施例5在使用的参照多肽的范围内，显示良好的精度。参考例及比较例3显示，有在流体力学半径大的范围的精度与实施例5相比不良，流体力学半径比实际小的倾向。
[0166]
图13(a)显示β
‑
淀粉酶的差的绝对值的比较数据。图13(b)显示甲状球蛋白的差的绝对值的比较数据。实施例5在哪方的多肽中，均相比参考例及比较例3，差的绝对值小。
[0167]
异常蛋白质有与正常蛋白质比较而流体力学半径大的情况。这样的情况是，在记载在非专利文献1及非专利文献2的方法中，估计异常蛋白质的流体力学半径比实际小了，被认为有假阴性的风险。