中药材质量综合评价方法与流程

1.本发明涉及中药材质量评价领域，具体涉及中药材质量综合评价方法，尤其是基于中医传统质量观、全过程生产规范性的现代质量观、现代药理功效评价为基础的多质量指标确立，用于建立中药材质量评价体系以评价中药材质量优劣。


背景技术：

2.中药材质量评价方法主要包括性状评价、化学评价以及生物评价等。性状评价是中药材质量评价的传统方法，包括外观形状、颜色、大小、长短、质地、气味等，通过眼看、手摸、口尝、鼻闻等方式评价中药材质量。化学评价是依据指标性成分定性及定量检测评价中药材质量，为目前中药材质量控制的主要评价方法。生物评价是在特定的试验条件下，利用离体组织、器官、微生物和细胞以及相关生物因子等生物体系评价供试药物的生物效应。
3.近年来许多研究团队都在开展中药材质量综合评价研究，有的学者提出了中药材质量生物评价模式，以生物评价为核心，将多指标化学成分与生物效应评测相结合，采用多元统计分析评价中药材质量，其研究内容主要包括：中药材“道地指数”评价、中药材效应成分指数评价、基于组分敲除敲入的中药材药效物质筛选评价、基于生物效价检测评价等，这种评价方法解决了中药材质量评价难以反映其临床药效和安全性的关键问题，弥补了化学评价和性状评价的不足，但从生产规范性的角度对中药材质量属性的形成考虑有所欠缺。有的学者从质量要素的传递与溯源、化学成分与“药性”及“药效”两方面传统功效的关联关系、基于植物亲缘学及生源途径的成分特有性分析等角度，提出以中药材质量标志物研究为核心的中药材质量评价模式。这种评价方法着眼于中药材生产、体内全过程的物质基础的特有差异、动态变化和质量传递性、溯源性，有利于建立中药材全程质量控制及质量溯源体系，但如何寻找和确立质量标志物，未提出有效方案和路径。
4.《中国药典》作为国家药品标准，是中药材质量控制和评价的基准，侧重于真伪，优劣评价不足。中药材商品规格等级是传统中药材等级评价方式，1984年，原卫生部提出了76种药材商品规格标准，随着时代变迁，该标准规定的各项指标已不再满足现实需求，为此，2018年，中华中医学会推出了226种中药材商品规格等级。这些行业标准和团体标准侧重于药材外观性状的评定，内在质量指标不足。
5.目前，现有的中药材等级评价标准指标主观性强、可追溯性较差，真正的内在指标不够明确，特别是和质量相关性强的指标未确立，质量指标的权重和综合质量评价方法未建立。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的在于提供一种中药材质量综合评价方法。本发明提供的中药材质量综合评价方法是基于质量属性形成的内在质量指标的发现以及多指标、多权重的综合质量指数评定，能够客观地、科学地对中药材进行质量评价。
7.具体地，本发明提供了一种中药材质量综合评价方法，该方法包括确立中药材的
质量指标的过程，其中中药材的质量指标包括药理活性指标和质量属性相关指标，确立中药材的质量指标的过程包括：
8.确定药理活性指标；
9.确定质量属性相关指标，其中包括至少以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素确定质量属性相关指标；所述质量属性相关指标包括外观性状指标、浸出物考察指标、总提取物考察指标、特征图谱考察指标、含量测定评价指标中的一种或多种。
10.本发明中，除特别注明及依据上下文含义能明确确定外，在同一方案中描述步骤的先后并不代表限定了这些步骤的先后顺序。例如，上述本发明的中药材质量综合评价方法中“确定药理活性指标”与“确定质量属性相关指标”的过程并未限定先后顺序。
11.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，确定药理活性指标的过程可以参照现有技术的方法进行。本发明优选的确定药理活性指标的过程包括：采用网络药理学方法找寻中药材的活性成分群，并验证活性成分的药理活性，从而确定药理活性指标。即，将中药材的活性成分群中具有药理活性的化学成分特别是主要化学成分作为药理活性指标。
12.本发明中，所述采用网络药理学方法找寻中药材的活性成分群的过程可以参照所属领域的常规技术进行。
13.本发明中，验证活性成分的药理活性时，可以理解，如果时间、经济等条件允许，优选选择较多的活性成分进行验证。实际情况中，当采用网络药理学方法找寻到的中药材的活性成分群中的活性成分(即中药材化学活性成分)较多时，例如8种以上、10种以上、20种以上、50种以上、或者80种以上甚至100种以上时，可以按照网络药理学预测生物活性排名选取前90％位、优选排名前80％位、更优选排名前70％位、进一步优选排名前50％位、最优选排名前20％位的化学成分作为主要化学成分，验证其药理活性。当仅选取中药材的活性成分群中的部分活性成分验证其药理活性时，所选取的药理活性成分优选不低于1种，更优选不低于2种。
14.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，所确定的药理活性指标符合以下条件：
15.于中药材的活性成分群中在网络药理学预测生物活性排名前90％位、优选排名前80％位、更优选排名前70％位、进一步优选排名前50％位、最优选排名前20％位；以及
16.能够被定量(即领域中通常所称的可定量化学成分)。
17.优选地，所确定的药理活性指标还符合以下条件：
18.采用体外细胞实验验证具有药理活性。
19.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，所述确立质量属性相关指标中的外观性状指标的过程包括：以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分别考察直径、长度、厚薄、重量、支数、条数、目数、个数、形状、颜色、质地、气味、口感中的一种或多种与考察因素的关联性，选择与至少一种考察因素关联性显著的一项或多项外观性状作为外观性状指标。举例而言，如果在多个中药材样品中，直径与产区道地性显著相关(本发明中所述“显著”即达到统计学意义上的p＜0.05即可)，则将直径作为外观性状指标之一。在选择直径、长度、厚薄、重量、支数、条数、目数、个数、形状、颜色、质地、气味、口感等外观性状中的一种或多种时，可以根据中药材的具体种类而定。
20.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，所述确立质量属性相关指标中的浸出物考察指标的过程包括：以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分别考察不同溶剂浸出物与考察因素的关联性，选择与至少一种考察因素关联性显著的一种或多种浸出物作为浸出物考察指标。在本发明的更具体实施方案中，所述不同溶剂浸出物至少包括水溶性浸出物、醇溶性浸出物。举例而言，如果在多个中药材样品中，水溶性浸出物、醇溶性浸出物均与生长年限显著相关(浸出物的总量具有显著差异)，则将水溶性浸出物、醇溶性浸出物均作为浸出物考察指标。
21.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，所述确立质量属性相关指标中的总提取物考察指标的过程包括：以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分别考察分子结构类别相同的化合物总含量与考察因素的关联性，选择与至少一种考察因素关联性显著的一种或多种分子结构类别相同的化合物总含量作为总提取物考察指标。其中，分子结构类别包括苯丙素类、醌类、黄酮类、萜类、三萜及其苷类、甾体及其苷类、生物碱类、多糖等中的一种或多种，具体可根据中药材的种类及所含的主要化合物分子结构类别而进行考察。举例而言，对于某一具体的中药材例如甘草，可依据其主要生物活性成分选择黄酮类化合物，考察总黄酮含量(实际为提取量)是否与至少一种考察因素显著相关。
22.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，所述确立质量属性相关指标中的特征图谱考察指标的过程包括：以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分别考察不同检测波长下的高效液相特征图谱与考察因素的关联性，选择与至少一种考察因素关联性显著的一种或多种波长下的高效液相特征图谱作为特征图谱考察指标。本发明中，考察高效液相特征图谱与考察因素的关联性时，是分析高效液相特征图谱的相似度。举例而言，如果在某一特定波长下的高效液相特征图谱相似度与生长年限显著相关，则选择该波长下的高效液相特征图谱作为特征图谱考察指标。
23.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，确立质量属性相关指标中的含量测定评价指标的过程包括：
24.以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分析考察因素改变的多个样品中的中药材内在化学成分，选择在至少一种考察因素改变的不同样本中具有差异性的化学成分作为中药材内在差异性化学成分；
25.以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分别考察中药材内在差异性化学成分及中药材中具有生物活性的化学成分与考察因素的关联性，选择与至少一种考察因素关联性显著且能够被定量的一种或多种化学成分作为含量测定评价指标。
26.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，确立质量属性相关指标中的含量测定评价指标的过程中，中药材内在化学成分即中药材本身实际所含有的化学成分。可以依据现有技术报道选择所有化学成分含量排名至少前90％位、优选排名前80％位、更优选排名前70％位、进一步优选排名前50％位、最优选排名前20％位的内在化学成分进行分析。也可以采用质谱进行定性分析以确定哪些中药材内在化学成分在至少一种考察因素改变的多个样本中具有差异性。在本发明的一些具体实施方案中，是采用质谱进行分析，并以分析以waters masslynx
tm
(v.4.1)及progenesis qi应用软件对质谱数据进行分析处理。具体包括：对中药材样品内在化学成分进行lc
‑
ms分析，得到中药材样品总离
子流色谱图；用progenesis qi操作软件将lc
‑
ms数据中每一个数据点转换成精确质量
‑
保留时间(an exact mass retention time,简称emrt)数据对，并在waters masslynx
tm
(v.4.1)操作软件上对数据标准化后进行主成分分析；制作基于opls
‑
da的样品数据s
‑
plot图。从s
‑
plot图中即可定性判断哪些中药材内在化学成分在至少一种考察因素改变的多个样本中具有差异性。
27.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，确立质量属性相关指标中的含量测定评价指标的过程中，以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，分别考察中药材内在差异性化学成分及中药材中具有生物活性的化学成分与考察因素的关联性时，中药材中具有生物活性的化学成分即采用网络药理学方法找寻到的中药材的活性成分群的化学成分。在选择中药材中具有生物活性的化学成分时，如果成分较多时，例如8种以上、10种以上、20种以上、50种以上、或者80种以上甚至100种以上时，可以按照网络药理学预测生物活性排名选取前90％位、优选排名前80％位、更优选排名前70％位、进一步优选排名前50％位、最优选排名前20％位的化学成分。当仅选取中药材的活性成分群中的部分活性成分时，所选取的药理活性成分优选不低于2种，进一步优选不低于5种。本发明中，需要考察中药材内在差异性化学成分及中药材中具有生物活性的化学成分的集合中的化学成分与考察因素的关联性，这些集合中的化学成分的种类应通常为5
‑
100种。
28.本发明的中药材质量综合评价方法，基于中医传统质量观、全过程生产规范性的现代质量观、现代药理功效评价为基础，能够确立中药材的质量指标，包括药理活性指标和质量属性相关指标。本发明的中药材质量综合评价方法，更具体可以说是一种综合确立中药材的质量指标的方法。在确立药理活性指标和质量属性相关指标后，即可基于这些指标进一步用于评价中药材质量优劣。
29.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，还可进一步包括基于确立的质量指标构建中药材质量综合评价模型以计算中药质量综合评价指数(tcm qcei)的过程。本发明所确立的质量指标是作为候选指标用于构建中药材质量综合评价模型，其中，质量指标中的药理活性指标可以是将所确立的药理活性成分的含量总和作为构建中药材质量综合评价模型的候选指标之一。具体实施时，可以采用领域中已知的建模方法或软件等构建中药材质量综合评价模型。
30.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，中药材质量综合评价模型的构建过程包括采用机器学习模型整合所确立的中药材的多种质量指标。即，将本发明所确立的质量指标作为候选指标，通过机器学习进行进一步的筛选整合，从而构建中药材质量综合评价模型。利用所构建的评价模型对中药材质量进行评价，可以得出中药质量综合评价指数(tcm qcei)，该中药质量综合评价指数融合了传统性状评价与主流化学评价，同时关联了药理活性，为科学客观评价中药材质量优劣提供了技术支持与示范。
31.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法中，中药材质量综合评价模型的构建过程可以包括：
32.估计95％的置信边界，作为合格样本的判断依据；
33.通过网格优化的方法优化径向基支持向量机的参数；
34.依次从原始数据中移除第i个变量，计算dj值；
35.确定中药材质量评价关键指标；
36.基于训练集样本的得分用s型函数拟合模型后验概率，并进行尺度放大。
37.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，其中，估计95％的置信边界的方法包括通过hotelling’st2计算。
38.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，其中，计算dj值的方法为dj(i)＝(1/2)a
t
ha
‑
(1/2)a
t
h(
‑
i)a，其中，
‑
i表示原始测量矩阵第i个变量被移除，alpha为支持向量系数，h＝y
i
y
j
k(x
i
,x
j
)，k(x
i
,x
j
)为核函数，y为样本类别belong to{1,
‑
1}。
39.根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，其中，s型函数拟合模型为：
[0040][0041]
其中，sj表示由支持向量机模型计算的样本j的得分，a,b分别为拟合得到模型系数。
[0042]
根据本发明的一些具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，还可包括通过十折交叉验证估计得到综合得分。通常情况下，可以将得分为86
‑
100的中药材为一等品，得分为70
‑
85的中药材为二等品，得分小于70分的中药材为三等品。
[0043]
根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，其中，该方法还包括采用体外细胞实验验证中药质量综合评价指数(tcm qcei)的合理性的过程。
[0044]
根据本发明的具体实施方案，本发明的中药材质量综合评价方法，适用于各种中药材，确立相关质量指标从而进行质量优劣的评价。所述中药材例如可以为植物药，优选为多年生草本植物药，进一步优选为根茎类植物药，例如甘草等。
[0045]
综上所述，本发明提供了一种中药材质量综合评价方法，特别是一种为构建中药材质量综合评价模型而确立中药材的质量指标的方法，以及基于中药材的质量指标构建中药材质量综合评价模型的方法。本发明的方法适用于对多种中药材质量进行综合评价，基于中药材质量属性形成的内在质量指标，同时辅以活性评价，最终能够确立多指标和权重相结合的综合质量指数。中药质量综合评价指数(tcm qcei)融合了传统性状评价与主流化学评价，同时关联了药理活性，为科学客观评价中药材质量优劣提供了技术支持与示范。
附图说明
[0046]
图1为甘草清热解毒功效团的关键药效物质及其核心靶标网络图。
[0047]
图2为甘草uplc
‑
qtof
‑
ms/ms bpi总离子流图，图中，1：夏佛塔苷；2：新甘草苷；3：芹糖甘草苷；4：毛蕊异黄酮葡萄糖苷；5：甘草苷；6：芹糖异甘草苷；7：异甘草苷；8：芒柄花苷；9：新异甘草苷；10：甘草查耳酮b；11：甘草素；12：毛蕊异黄酮；13：柚皮素；14：刺甘草查耳酮；15：山柰酚；16：异甘草素；17：芒柄花素；18：甘草酸；19：甘草黄酮a；20：甘草香豆素；21：华良姜素；22：甘草黄酮c；23：甘草异黄酮a；24：甘草利酮；25：甘草查耳酮a；26：甘草酚；27：甘草黄酮醇；28：甘草异黄酮b；29：18α
‑
甘草次酸；30：18β
‑
甘草次酸。
[0048]
图3为甘草及其代表性药效物质对细胞上清中炎症因子的抑制作用。
[0049]
图4为甘草及其代表性药效物质对pi3k/akt/nf
‑
κb信号通路的调控作用。
[0050]
图5为甘草特征图谱参照图谱(250nm)，图中：6：芹糖甘草苷，7：甘草苷，10：芹糖异
甘草苷，12：异甘草苷，13：新异甘草苷，17：甘草素，25：甘草皂苷g2，27：异甘草素，28：芒柄花素，30：甘草香豆素，32：半甘草异黄酮b，34：甘草异黄酮a，38：甘草异黄酮b。
[0051]
图6为甘草特征图谱参照图谱(330nm)，图中，6：佛来心苷，8：芹糖甘草苷，10：甘草苷，15：芹糖异甘草苷，17：异甘草苷，18：新异甘草苷，20：甘草素，22：异甘草素，23：甘草香豆素，24：半甘草异黄酮b，27：甘草异黄酮a，28：甘草酚，30：甘草黄酮醇，31：甘草异黄酮b。
[0052]
图7a为混合对照品溶液与供试品溶液hplc色谱图(250nm)；图7b为混合对照品溶液与供试品溶液hplc色谱图(262nm)；图7c为混合对照品溶液与供试品溶液hplc色谱图(275nm)；图7d为混合对照品溶液与供试品溶液hplc色谱图(360nm)。
[0053]
图8为甘肃2
‑
5年生秋季采挖甘草药材主成分分析图。
[0054]
图9为甘肃2
‑
5年生秋季采挖甘草药材opls图。
[0055]
图10为甘肃2
‑
5年生秋季采挖甘草药材vip图。
[0056]
图11为中药质量综合评价指数计算机预测模型建立流程图。
[0057]
图12为十折交叉验证估计得到综合得分图。
[0058]
图13为甘草w2批次最佳给药剂量筛选。
[0059]
图14为w1与w2抗炎作用对比研究。
[0060]
图15为w2抗炎药效考察图。
[0061]
图16为甘草对pi3k/akt信号通路的调控作用。
[0062]
图中，*,**,***,****,p＜0.05,0.01,0.001,0.0001,与空白对照组相比；#,##,###,####,p＜0.05,0.01,0.001,0.0001,与lps诱导组相比。
具体实施方式
[0063]
下面结合具体的实施例对本发明方法做进一步的详细说明，以使本领域技术人员更加清楚地理解本发明。以下内容用于说明本发明，不应理解为是对本发明的保护范围的限制。根据本发明的教导，结合现有技术对本发明技术方案的改进是显然的，均属于本发明保护的范围。实施例中未详细注明的方法及操作条件，均可参照所属领域的常规技术进行。
[0064]
实施例
[0065]
本实施例以甘草药材为例，进行中药材质量综合评价，评价方法主要包括基于质量属地形成的内在质量指标的发现以及多指标、多权重的综合质量指数评定。
[0066]
一、质量指标的确立
[0067]
1.药理活性指标的确立
[0068]
1.1采用网络药理学方法找寻甘草活性成分群a
[0069]
1.1.1传统功效或疾病、症状和表型基因找寻
[0070]
(1)从tcmip v2.0平台中获取与“免疫
‑
炎症”失调、部分精神疾病症状有关的基因集作为清热解毒药效对应的疾病/症状基因集；
[0071]
(2)根据以上入选原则，共收集到1054个疾病/症状基因。
[0072]
1.1.2中药材候选靶标的预测
[0073]
运用tcmsp及tcmid数据库找寻甘草化学成分。运用ncbi pubchem及scifinder scholar数据库找寻化合物2d结构；若上述数据库无相关化合物结构，运用chembiodraw ultra 12.0软件绘制成分2d结构图。将上述2d结构图上传至tcmip(v2.0)数据库，将其与已
知活性化合物结构相似度阈值设置为＞0.80(similar score＞0.80，阈值的设定可以由本领域技术人员根据实际情况需要进行设定)，有106个化学成分符合该阈值并获得241个甘草候选靶标基因。
[0074]
1.1.3传统功效或对应疾病/症状基因
‑
中药材候选靶标基因相互作用网络分析
[0075]
(1)基于string数据库，收集上述清热解毒对应疾病/症状基因和甘草候选靶标的相互作用信息，选取experimentally determined interaction score和combined score均大于相应中位数的相互作用信息，构建“清热解毒对应疾病/症状基因
‑
甘草候选靶标”相互作用网络，共得到985个节点和3974条边。
[0076]
(2)计算节点的三个拓扑特征值(degree、betweenness、closeness)，选取三个均大于相应中位数的节点为核心基因，共得到299个核心基因。
[0077]
(3)甘草所含化学成分及其与核心基因的对应关系，和生物学意义阐释如下：
[0078]
甘草所含的27种化学成分，通过作用于其核心靶标，分别参与调节机体“炎症
‑
免疫”系统平衡、神经系统异常、和能量代谢异常和细胞功能异常的相关通路(如图1所示)。
[0079]
1.2采用体外细胞实验验证主要活性成分的药理活性
[0080]
1.2.1验证甘草活性化学成分群a
[0081]
1.2.1.1仪器与试药
[0082]
仪器：waters acquity
tm
超高效液相色谱仪，waters synapt
tm g2
‑
s qtof ms四级杆串联飞行时间质谱仪，waters masslynx
tm v.4.1工作站，progenesis qi工作站。昆山市超声仪器有限公司kq
‑
250de型医用数控超声波清洗器；梅特勒
‑
托利多仪器公司mettler toledo xse 205du电子天平。
[0083]
试剂：甲酸、乙腈均为色谱纯；纯净水为milli
‑
q超纯水，其他试剂均为分析纯。
[0084]
对照品甘草酸铵、甘草苷、芒柄花素、夏佛塔苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、山柰素、柚皮苷、齐墩果酸、熊果酸、槲皮素及异芒柄花素来自中国食品药品检定研究院；光甘草定、芒柄花苷、甘草素、毛蕊异黄酮、异甘草素、光甘草酚、刺甘草查耳酮、异甘草苷、新异甘草苷、华良姜素、甘草香豆素、18α
‑
甘草次酸、18β
‑
甘草次酸、柚皮素、新甘草苷、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、甘草黄酮a、甘草黄酮b、甘草查耳酮a、甘草查耳酮b、佛来心苷及牡荆素购自成都普瑞法科技开发有限公司；甘草异黄酮b、甘草酚、及甘草异黄酮a、新西兰牡荆苷及异夏佛塔苷购自成都普思科技股份有限公司；光甘草酮、甘草黄酮c、美迪紫檀素葡萄糖苷、维斯体素、葡萄糖基甘草苷及甘草查耳酮e购自上海源叶生物科技有限公司；甘草黄酮醇、黄甘草苷及半甘草异黄酮b购自成都曼思特生物科技有限公司；甘草利酮、光甘草素及7，4
’‑
二羟基黄酮购自南京道斯夫生物科技有限公司；甘草皂苷a3、甘草皂苷g2、南酸枣苷及甘草芳香豆素购自成都植标化纯生物技术有限公司；甘草内酯购自上海博湖生物科技有限公司；甘草皂苷e2购自赫澎(上海)生物科技有限公司。
[0085]
1.2.1.2方法与结果
[0086]
1.2.1.2.1液相条件：色谱柱为acquity uplc hss t3 c
18
(2.1mm
×
100mm,1.8μm),流动相a为乙腈，b为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱(0～1min,5％a；1～3min,5％a
→
18％a；3～13min,18％a
→
30％a；13～18min,30％a
→
45％a；18～21min,45％a
→
50％a；21～29min,50％a
→
75％a；29～31min,75％a
→
95％a；31～31.2min,95％a；31.2～35min,95％a
→
5％a)；流速为0.4ml/min；柱温为40℃；进样量为2μl。
[0087]
1.2.1.2.2质谱条件：离子化模式为esi

，毛细管电压为3kv，锥孔电压为30v，除溶剂温度为500℃，除溶剂气体为600l/h。离子源温度为120℃。采用ms
e
采集方式，采集时间35min，扫描范围500～1200da，扫描时间为0.2s。碰撞能量：低能量为0v，梯度高能量为20～50v。碰撞气体为高纯氩气。
[0088]
1.2.1.2.3样品处理：取样品粉末(过3号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25ml，密塞，称量，超声(超声功率300w，频率40khz)处理30min，放冷，再称量，用70％甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0089]
1.2.1.2.4数据分析：以waters masslynx
tm v.4.1及progenesis qi应用软件对质谱数据进行分析。结果如图2所示，基于网络药理学所预测到的甘草主要活性化学成分可被uplc
‑
qtof
‑
ms/ms检出。
[0090]
1.2.2确立拟进行体外细胞实验验证的候选活性成分
[0091]
选择甘草活性化学成分群a中在网络药理学预测生物活性排名前50％位并且经1.2.1uplc
‑
qtof
‑
ms/ms实验验证质谱信号峰强度排名前50％位的化合物，作为体外细胞实验验证的候选活性成分：芹糖甘草苷、甘草素、芹糖异甘草苷及甘草酸。
[0092]
1.2.3采用体外细胞实验验证候选活性成分的药理活性
[0093]
1.2.3.1实验材料
[0094]
细胞培养：dmem高糖培养基、双抗、血清、超纯水、pbs缓冲液；
[0095]
检测抗体如表1所示。
[0096]
表1
[0097][0098]
1.2.3.2实验方法
[0099]
1.2.3.2.1实验用细胞：raw 264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，购自中国科学院细胞库；培养条件：dmem高糖培养基，90％；优质胎牛血清，10％。气相：空气，95％；二氧化碳，5％。温度：37℃。
[0100]
1.2.3.2.2药物配制：
[0101]
1)甘草溶液：精密称取适量甘草醇提取物，加入一定量超纯水完全溶解，配制为浓度为20μg/μl甘草醇提取物贮备液，分装
‑
20℃冻存；
[0102]
2)甘草代表性药效物质溶液：分别精密称取芹糖甘草苷、甘草素、芹糖异甘草苷及甘草酸，加入适量dmso(体外细胞给药不超过总体积的1
‰
)，并加入一定量超纯水至完全溶解，配制为溶度为2mg/ml单一对照品贮备液，分装
‑
20℃冻存；
[0103]
3)lps诱导剂：精密称取1mg lps粉末，加入1ml超纯水，配制为1mg/ml lps贮备液，分装
‑
80℃冻存。
[0104]
1.2.3.2.3给药方式：种板细胞密度为1.6
×
105个细胞，长到70
‑
80％后，不同浓度甘草预给药1h后，加入1μg/ml lps，24h后收集细胞上清及沉淀。
[0105]
1.2.3.3实验结果
[0106]
1.2.3.3.1甘草及其代表性药效物质可显著抑制lps诱导raw264.7细胞上清中炎症因子的表达
[0107]
结果显示，与空白对照组(con)相比，lps诱导组细胞上清中il
‑
1β及tnf
‑
α含量显著上调(均p＜0.01)，在甘草(liquorice)、芹糖甘草苷(liquiritin apioside,la)、甘草素(liquiritigenin,liq)、芹糖异甘草苷(isoliquiritin apioside,ia)及甘草酸(glycyrrhizin,gly)给药后均可不同程度降低二者的异常高表达(如图3所示)。
[0108]
1.2.3.3.2甘草及其代表性药效物质可显著抑制p
‑
pi3k/pi3k、p
‑
akt1/akt1及p
‑
nfκb
‑
p65/nfκb
‑
p65的表达
[0109]
如图4所示，与空白对照组相比，lps诱导组中p
‑
pi3k/pi3k、p
‑
akt1/akt1及p
‑
nfκb
‑
p65/nfκb
‑
p65蛋白的表达均显著上调(均p＜0.0001)，在甘草(liquorice)、芹糖甘草苷(liquiritin apioside,la)、甘草素(liquiritigenin,liq)、芹糖异甘草苷(isoliquiritin apioside,ia)及甘草酸(glycyrrhizin,gly)给药后，可分别不同程度地下调上述蛋白分子的表达。
[0110]
pi3k/akt通路与增殖、分化和凋亡密切相关，调节细胞代谢、生长和增殖，在肿瘤的迁移、粘附、血管生成和外基质中发挥重要作用；nf
‑
κb信号通路nf
‑
κb是属于rel家族的转录因子,参与调节与机体免疫、炎症反应、细胞分化有关的基因转录；三者磷酸化的高表达代表了pi3k/akt/nf
‑
κb通路的激活，而甘草及其代表性药效物质可显著抑制该通路的激活。
[0111]
1.2.3.4实验结论
[0112]
1)实验发现甘草、芹糖甘草苷、甘草素、芹糖异甘草苷及甘草酸均可显著抑制lps诱导的炎症，表现出明显的抗炎作用，具有药理活性；将这些活性成分作为药理活性指标b；
[0113]
2)甘草及其代表性药效物质可能是通过pi3k/akt/nfκb通路，抑制下游il
‑
1β及tnf
‑
α炎症因子的表达，从而发挥抗炎的药效作用。
[0114]
2.质量属性相关指标的确立
[0115]
基于药材质量属性形成的关键(道地产区、规范种植)，重点对产区道地性、生长年限、采收季节等关键因素和质量指标的相关性进行研究，考察指标包括外观性状c，浸出物d，化学成分e，总黄酮f以及相似度g。
[0116]
2.1外观性状指标确立
[0117]
2.1.1样品信息
[0118]
以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，收集相关甘草药材样品，详见表2。
[0119]
表2外观性状指标样品信息
[0120][0121]
2.1.2以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，并以表2样品作为考察对象，分别考察直径、质地、长度、粉末颜色与考察因素的关联性。
[0122]
2.1.2.1直径
[0123]
以甘草药材顶端直径为测定指标，测定表2样品。
[0124]
顶端直径采用游标卡尺测定芦头下2厘米处直径，重复三次，取平均值。
[0125]
2.1.2.2质地
[0126]
以甘草药材质地为测定指标，测定表2样品。
[0127]
采用随机取10根样品，测定总重量，并重复三次，取平均值。
[0128]
2.1.2.3长度
[0129]
以甘草药材长度为测定指标，测定表2样品。
[0130]
采用随机取10根样品，测定长度，并重复三次，取平均值。
[0131]
2.1.2.4粉末颜色
[0132]
粉末颜色采用台式分光测色仪，杭州彩谱cs
‑
820型，测定样品总色差(de*ab)。
[0133]
结果表明，质地和顶端直径二者在不同生长年限、不同地域以及不同采挖季节甘草样品中具有显著性差异，结果如表3所示。
[0134]
表3
[0135][0136]
对质地与顶端直径进行相关性分析，不同生长年限、不同地域以及不同采挖季节甘草样品中均具有相关性。结果如表4所示。
[0137]
表4
[0138]
[0139]
与质地相比，顶端直径具有测量便捷，易于判断的优点，同时也是传统甘草质量优劣评价指标，综上所述，本研究选择顶端直径作为外观性状指标。
[0140]
2.2浸出物指标确立
[0141]
以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，并以表1样品作为考察对象，分别考察醇溶性浸出物和水溶性浸出物与考察因素的关联性。
[0142]
参照《中国药典》2015年版(四部)通则2201项下的热浸法，分别用水及稀乙醇作溶剂，测定质量评价研究样品，并进行统计学分析。
[0143]
结果表明，醇溶性浸出物的量在不同生长年限、不同地域以及不同采挖季节甘草样品中均具有显著性差异，结果如表5所示。故选择醇溶性浸出物作为浸出物考察指标。
[0144]
表5
[0145][0146]
2.3甘草总黄酮测定
[0147]
参照文献方法(周斌，常军，刘可越等.紫外分光光度法测定甘草中总黄酮的含量[j].安徽农业科学，2009，37(31)：15246
‑
15247.)，以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，并以表2样品作为考察对象，分别考察甘草总黄酮与考察因素的关联性，确认甘草总黄酮的量与考察因素显著相关。本发明中，选择黄酮总含量作为甘草总提取物考察指标。
[0148]
2.4甘草高效液相色谱特征图谱相似度计算
[0149]
2.4.1仪器与试药
[0150]
仪器：waters e2695高效液相色谱仪(2998pda检测器、empower网络版工作站)；昆山市超声仪器有限公司kq
‑
250de型医用数控超声波清洗器；梅特勒
‑
托利多仪器公司mettler toledo xse 205du电子天平；科迈恩(北京)科技有限公司chempattern化学计量学软件。
[0151]
试剂：磷酸、乙腈均为色谱纯；纯净水为milli
‑
q超纯水，其他试剂均为分析纯。
[0152]
对照品甘草酸铵、甘草苷、芒柄花素、芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷(、甘草素、甘草香豆素，佛来心苷，新异甘草苷、异甘草素、甘草酚、甘草异黄酮a、甘草异黄酮b、半甘草异黄酮b、甘草黄酮醇、甘草皂苷g2。以上对照品的来源于纯度同1.2.1.1。
[0153]
以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，并以表2样品作为考察对象。
[0154]
2.4.2方法与结果
[0155]
2.4.2.1液相条件色谱柱为shiseido capcell pak mg c
18
(4.6mm
×
250mm,5μm)，流动相a为乙腈，b为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～60min,5％a
→
95％a；60～65min,95％a；65～65.2min,95％a
→
5％a；65.2～75min,5％a)；流速为1ml/min；柱温为40℃；进样量为10μl；检测波长为250nm及330nm。
[0156]
2.4.2.2对照品溶液的制备
[0157]
精密称取甘草皂苷g2、甘草酸铵、芒柄花素、半甘草异黄酮b、甘草异黄酮a、甘草异
黄酮b、芹糖甘草苷、甘草苷、甘草素、佛来心苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷、新异甘草苷、异甘草素、甘草香豆素、甘草酚及甘草黄酮醇对照品适量，加甲醇溶解并稀释成46.26、182.20、4.16、11.63、3.54、9.17、116.05、90.44、15.70、5.47、36.54、19.96、11.36、4.62、8.06、14.00、4.40μg/ml的对照品混合溶液，即得。
[0158]
2.4.2.3供试品溶液的制备同2.3.2.3。
[0159]
2.4.2.4相似度分析利用chem pattern软件，分别在250nm及330nm波长下，以甘草hplc特征图谱共有模式为参照图谱，采用夹角余弦法计算各样品相似度。详见图5、图6。
[0160]
本发明中，确认250nm及330nm波长下的高效液相特征图谱相似度均与考察因素显著相关，因此选择这两个波长下的特征图谱相似度作为特征图谱考察指标。
[0161]
2.5基于质量属性形成的甘草指标性内在化学成分(中药材内在差异性化学成分)找寻
[0162]
2.5.1仪器与试药同1.2.1.1
[0163]
以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，并以表6样品作为考察对象。
[0164]
表6样品收集信息
[0165][0166]
2.5.2方法与结果
[0167]
2.5.2.1液相条件同1.2.1.2.1
[0168]
2.5.2.2质谱条件同1.2.1.2.2
[0169]
2.5.2.3样品处理同1.2.1.2.3
[0170]
2.5.2.4数据分析以waters masslynx
tm v.4.1及progenesis qi应用软件对质谱数据进行分析。
[0171]
2.5.2.4.1主成分分析以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，对甘草样品化学成分进行lc
‑
ms分析，得到甘草样品总离子流色谱图。用progenesis qi操作软件将lc
‑
ms数据中每一个数据点转换成精确质量
‑
保留时间(an exact mass retention time,简称emrt)数据对，并在waters masslynx
tm v.4.1操作软件上对数据标准化后进行主成分分析。
[0172]
2.5.2.4.2基于产区道地性、生长年限、采收季节甘草特征峰的确认
[0173]
运用主成分分析法对表6样品进行分析，可在得分图上有效区分不同产地、不同生长年限以及不同采收季节的甘草。接着再对数据进行正交偏最小二乘法判别分析(opls
‑
da)，
[0174]
将不同产地、不同生长年限以及不同采收季节甘草样品分别进行两两比较，得到基于opls
‑
da的样品数据s
‑
plot图。散点距离中心点越远，代表该点对区分不同样品之间的差异贡献越大，即为区别不同产地、生长年限以及采收季节的特征碎片离子。
[0175]
分别对不同产地、不同生长年限以及不同采收季节甘草样品特征碎片离子的质谱裂解规律进行解析，并采用对照品进行验证，指认出11个化学成分，分别是甘草苷，芹糖甘草苷，芹糖异甘草苷，异甘草苷，芒柄花素，甘草酸，甘草素，芒柄花苷，甘草香豆素，甘草酚，甘草异黄酮a。这些化学成分即作为中药材内在差异性化学成分。
[0176]
2.6含量测定评价指标的确立
[0177]
2.6.1甘草生物活性成分与基于质量属性形成的内在化学成分验证
[0178]
2.6.1.1仪器与试药
[0179]
仪器：waters acquity
tm
超高效液相色谱仪，waters xevo
tm tq
‑
s micro三重四极杆质谱仪，waters masslynx
tm v.4.1工作站。昆山市超声仪器有限公司kq
‑
250de型医用数控超声波清洗器；梅特勒
‑
托利多仪器公司mettler toledo xse 205du电子天平。瑞典umetrics公司simca13.0化学计量学软件。
[0180]
试剂及对照品同1.2.1.1
[0181]
以产区道地性、生长年限、采收季节作为考察因素，并以表7样品作为考察对象。
[0182]
表7甘草药材活性成分与化学成分验证样品信息表
[0183][0184]
2.6.1.2方法与结果
[0185]
2.6.1.2.1液相条件同1.2.1.2.1
[0186]
2.6.1.2.2质谱条件离子化模式为esi

，进行多反应监测。毛细管电压为3kv，锥孔电压为40v，除溶剂温度为550℃，除溶剂气体为800l/h，离子源温度为150℃。
[0187]
2.6.1.2.3样品处理取1.2.1.2.3项下供试品溶液，精密量取1ml，置50ml量瓶中，加70％甲醇溶液至刻度，摇匀，即得。
[0188]
2.6.1.2.4样品测定以所建立的方法测定表8样品，34个化学成分在甘草样品中可被检出。不同化学成分在样品中的含量分布有所不同，详见表8。
[0189]
表8甘草药材化学成分含量分布表
[0190]
序号化学成分含量％序号化学成分含量％1甘草酸≥2％18甘草黄酮醇0.01
‑
0.08％2甘草皂苷g20.2％
‑
0.6％19甘草利酮0.002
‑
0.02％3甘草苷≥0.50％20甘草香豆素0.02
‑
0.1％4芹糖甘草苷≥0.50％21甘草酚0.01
‑
0.03％5甘草素0.10％
‑
0.30％22甘草芳香豆素0.004
‑
0.014％6异甘草苷0.10％
‑
0.20％23甘草查耳酮b0.05
‑
0.25％7新异甘草苷0.01％
‑
0.05％24甘草黄酮c0.006
‑
0.01％8芹糖异甘草苷0.10％
‑
0.50％25甘草查耳酮a0.07
‑
0.2％9异甘草素0.02
‑
0.2％26毛蕊异黄酮0.0002
‑
0.001％
10黄甘草苷0.002
‑
0.02％27毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.0005
‑
0.003％11芒柄花苷0.03
‑
0.1％28b甘草次酸0.0005
‑
0.002％12甘草异黄酮a0.01
‑
0.04％29异芒柄花素0.0002
‑
0.003％13佛来心苷0.01
‑
0.04％30牡荆素0.0005
‑
0.004％14芒柄花素0.01
‑
0.05％31新甘草苷0.02
‑
0.08％15刺甘草查耳酮0.001
‑
0.02％32柚皮素0.003
‑
0.01％16甘草异黄酮b0.002
‑
0.1％33维斯体素0.002
‑
0.03％17半甘草异黄酮b0.01
‑
0.07％34华良姜素0.008
‑
0.015％
[0191]
2.6.2含量测定指标测定方法建立
[0192]
经uplc
‑
qqq ms法验证可知，甘草药材中不同化学成分含量分布差异较大。以产区道地性、生长年限、采收季节、生物活性以及含量高低作为筛选条件，最终确立17个化学成分作为含量测定指标，并建立高效液相色谱含量测定方法。
[0193]
2.6.2.1仪器与试药同2.4.1
[0194]
2.6.2.2方法与结果
[0195]
2.6.2.2.1液相条件同2.4.2.1。检测波长为250nm，262nm，275nm及360nm。
[0196]
2.6.2.2.2对照品溶液的制备同2.4.2.2
[0197]
2.6.2.2.3供试品溶液的制备同2.4.2.3
[0198]
2.6.2.2.4样品测定取表6样品，分别按2.6.2.2.3项下方法制备供试品溶液，按3.2.2.1项下色谱条件进样，测定峰面积，外标法计算含量。色谱图见图7a
‑
图7d。
[0199]
2.6.2.2.5化学计量学分析及主要含量测定指标的确立
[0200]
以甘肃2
‑
5年生秋季采挖甘草药材为例，利用simca13.0化学计量学软件将样品测定数据标准化后进行主成分分析(pca)，见图8。第一主成分(pc1)的贡献率为51.4％，第二主成分(pc2)的贡献率为22.2％，第三主成分(pc3)的贡献率为9.99％，累计达83.5％，说明其能较全面地反映样品间的差异。主成分分析散点图显示，不同生长年限的甘草样品基本可以各自聚为一类。
[0201]
利用simca 13.0化学计量学软件将样品测定数据标准化后进行正交偏最小二乘法分析(opls)，获得相应模型，不同生长年限甘草药材样品分离显著，见图9。其模型质量参数r2x为0.732，r2y为0.879，q2为0.867。为进一步找寻对分类贡献较大的主要变量，得到了opls模型的变量重要性投影值(variable importance in projection,vip)，见图10。以vip值大于1.0为界限进行筛选，芹糖甘草苷、芹糖异甘草苷、异甘草苷
*
(*表示异构体)、甘草异黄酮b、甘草黄酮醇、半甘草异黄酮b、芒柄花素以及佛来心苷是影响甘肃2
‑
5年生秋季采挖甘草药材质量差异的主要含量测定指标。
[0202]
同样的方法，对不同产地，不同生长年限以及不同采挖季节甘草药材分别进行pca分析和opls
‑
da分析，找到相应的主要含量测定指标，详见表9。
[0203]
表9甘草药材质量评价主要含量测定指标
[0204]
序号化学成分序号化学成分序号化学成分1甘草酸6异甘草苷
*
11甘草异黄酮b2芹糖甘草苷7甘草素12新异甘草苷3甘草苷8半甘草异黄酮b13甘草皂苷g2
4芹糖异甘草苷9甘草酚14芒柄花素5异甘草苷10甘草黄酮醇15佛来心苷
[0205]
二、中药质量综合评价指数(tcm qcei)的确立
[0206]
1.基于中药材质量属性形成的关键(道地产区、规范种植)，依照生长年限、产地、采收季节作为评价因素，将甘草分为一等、二等及三等品三个等级(由于中药材的复杂性，等级划分涉及的因素很多，本实施例只列出一个大致的参考标准，非绝对标准。一等品：生长年限长(4
‑
5年)，道地产区(甘肃/内蒙古)，传统采收季节(秋季采收)；二等品：生长年限短(3年)，产区不固定，采收季节不固定；三等品：对生长年限、产地和采收季节不再另行要求，符合药典规定即可。本领技术人员可以根据实际情况对上述等级划分进行适当调整)。
[0207]
2.建模候选指标的确立
[0208]
依据第一部分质量指标选择的研究结果，将21个指标作为建立甘草质量等级评价模型的候选指标，详见表10。
[0209]
表10甘草质量等级评价计算机模型候选指标信息表
[0210][0211]
3.中药质量综合评价指数(tcm qcei)计算机预测模型建立，流程如图11所示。
[0212]
3.1通过hotelling’st2的计算，估计95％的置信边界，作为三等合格样本的判断依据；
[0213]
3.2通过网格优化的方法在[1e
‑
5,1e5]和[1e
‑
5,1e5]范围内优化径向基支持向量机的参数，最优模型参数：c为7.5552，γ为510.89，10折交叉验证准确率为88.4％；
[0214]
3.3依次从原始数据中移除第i个变量，计算dj值；
[0215]
3.4选择贡献较大的变量作为关键质量参数重新训练模型，得到模型参数c和γ分别为15.758，14332，10折交叉验证准确率为87.6％；确定变量芹糖甘草苷，甘草酸、甘草苷、甘草素、直径、药理活性指标含量总和、总黄酮、250nm及330nm波长下的高效液相特征图谱相似度9个指标为甘草药材质量评价关键指标；
[0216]
3.5基于训练集样本的得分用s型函数拟合模型后验概率，并进行尺度放大。通过十折交叉验证估计得到综合得分，甘草一等品qcei得分(86
‑
100)，二等品qcei得分(70
‑
85)，详见图12所示。
[0217]
4.采用体外细胞实验验证中药质量综合评价指数(tcm qcei)的合理性
[0218]
4.1比对实验甘草样品的选择
[0219]
依据《七十六种药材商品规格标准》【国药联材字(84)第72号文附件】以及《中药材
材商品规格等级(226种)》(t/cacm 1021
‑
2018)等团体标准的分类标准，选择同属一等品的两批次甘草，但经本评价方法判定为不同质量等级的甘草。结果如表11。
[0220]
表11
[0221][0222]
4.2通过构建细胞模型，对比中药材a与b的药效。具体方式为：
[0223]
4.2.1实验材料
[0224]
细胞培养：dmem高糖培养基、双抗、血清、up水、pbs缓冲液；
[0225]
检测抗体情况：同1.2.3.1。
[0226]
4.2.2实验方法
[0227]
4.2.2.1实验用细胞：raw 264.7小鼠单核巨噬细胞白血病细胞，购自中国科学院细胞库；培养条件：dmem高糖培养基，90％；优质胎牛血清，10％。气相：空气，95％；二氧化碳，5％。温度：37℃。
[0228]
4.2.2.2药物配制：
[0229]
1)甘草溶液：精密称取适量不同批次甘草(w1及w2)，加入一定量超纯水完全溶解，配制为浓度为20μg/μl甘草贮备液，分装
‑
20℃冻存；
[0230]
2)lps诱导剂：精密称取1mg lps粉末，加入1ml超纯水，配制为1mg/ml lps贮备液，分装
‑
80℃冻存。
[0231]
4.2.2.3给药方式：种板细胞密度为1.6
×
105个细胞，长到70
‑
80％后，不同浓度甘草预给药1h后，加入1μg/ml lps，24h后收集细胞上清及沉淀。
[0232]
4.2.3实验结果
[0233]
4.2.3.1w2甘草醇提取物最佳给药剂量筛选
[0234]
实验结果如图13所示，与空白对照组(con)相比，lps诱导组细胞上清中il
‑
1β含量显著上调(p＜0.0001)，在0.08、0.4、2、10、50及250μg/ml甘草给药后均可不同程度降低其异常高表达，其中10、50、250μg/ml剂量下具有显著性差异。因此筛选出w2三个给药剂量分别为10、50、250μg/ml。
[0235]
4.2.3.2w1及w2两批甘草药效对比研究
[0236]
通过对比上述三个剂量下，w1及w2两个批次甘草的抗炎作用，结果如图14、图15所示，与空白对照组(con)相比，lps诱导组细胞上清中il
‑
1β及tnf
‑
α含量均显著上调(均p＜0.0001)；在0、50、250μg/ml的w2给药后，可呈剂量依赖性降低il
‑
1β的含量(均p＜0.001)，在相同剂量的w1给药后，尚未检测到其对il
‑
1β的抑制作用；在0、50、250μg/ml的w2给药后，显著降低tnf
‑
α的含量(均p＜0.0001)，在相同剂量下的w1给药后，亦可显著降低tnf
‑
α的含量(均p＜0.0001)。基于上述结果来看，w2批次甘草的药效较好。
[0237]
4.2.3.3甘草w2可显著抑制p
‑
pi3k/pi3k及p
‑
akt1/akt1的表达
[0238]
如图16所示，与空白对照组相比，lps诱导组中p
‑
pi3k/pi3k及p
‑
akt1/akt1蛋白的表达均显著上调，在10、50及250μg/ml甘草给药后，可分别不同程度地下调上述蛋白分子的表达。pi3k/akt通路与增殖、分化和凋亡密切相关，调节细胞代谢、生长和增殖，在肿瘤的迁移、粘附、血管生成和外基质中发挥重要作用。二者磷酸化的高表达代表了pi3k/akt通路的激活，而甘草可显著抑制pi3k/akt通路的激活。
[0239]
4.2.4实验结论
[0240]
4.2.4.1w1及w2两批次甘草抗炎的药效对比，发现w2的药效最佳；
[0241]
4.2.4.2甘草可通过抑制pi3k/akt通路的激活，抑制下游il
‑
1β及tnf
‑
α炎症因子的表达，发挥抗炎作用。
[0242]
实验结果表明，经tcm qcei评价为一等品甘草质量优于二等品甘草质量，体外抗炎药效结果与qcei评定结果一致。与现行方法相比，本发明建立的方法可更加客观、准备的评价甘草质量。