天然三萜-环烯醚萜苷二聚体杂合物及其制备和在制备ACL抑制剂中的用途的制作方法

天然三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物及其制备和在制备acl抑制剂中的用途
技术领域
1.本技术涉及医药技术领域，具体涉及一种天然三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物及其制备和在制备atp
‑
柠檬酸裂解酶(atp
‑
citrate lyase,acl)抑制剂中的用途。


背景技术：

2.atp
‑
柠檬酸裂解酶(atp
‑
citrate lyase,acl)是糖代谢与脂肪酸和胆固醇生物合成的关键酶，其作用底物和产物是糖代谢中的关键中间产物，并可作为脂肪酸合成的底物。人体acl酶蛋白是由4个相同的120kda亚基组成的同源四聚体，每个多肽链含有1101个氨基残基(singh et al,j.biol.chem.1976,251, 5254
‑
5250)。acl是一种胞质酶，催化柠檬酸和辅酶a转化为乙酰辅酶a和草酰乙酸，同时伴随着atp的水解。acl在肝脏、肾脏、胰腺等生脂细胞和胆碱能神经细胞中高度表达(beigneux et al.,j.biol.chem.2004,279,9557
‑
9564)，其催化衍生的乙酰辅酶a也被用于胆固醇的生物合成。作为胞质乙酰辅酶a的主要来源，acl与脂肪酸和胆固醇的合成密切相关，其表达的改变与人类心血管疾病、脂肪肝、2型糖尿病、癌症等密切相关。
3.心血管疾病(cardiovascular diseases,cvds)是世界上最主要的死亡原因，据世界卫生组织(world health organization,who)指出，cvds几乎占全球死亡人数的三分之一(mendis et al,prog.cardiovasc.dis.2010,53,10
‑
14)。寻找预防或治疗cdvs药物已成为全球公共卫生的优先事项。acl是联结营养代谢与胆固醇和脂肪酸合成之间普遍存在的酶，研究表明，胆固醇和甘油三酯代谢紊乱促进人类心血管疾病的发生。新生胆固醇和脂肪酸的生物合成途径都依赖于 acl催化衍生所提供的乙酰辅酶a，acl抑制剂能够有效阻断脂肪酸和胆固醇的从头合成，并降低血脂(burke et al.,curr.opin.lipidol.2017,28,193
–
200； pinkosky et al.,trends mol.med.2017,23,1047
–
1063)。因此，寻找有效的acl 抑制剂对于治疗或预防cdvs的发生有着非常重要的应用前景。此外，甘油三脂酸的代谢异常也增加非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease, nafld)和ii型糖尿病(type ii diabetes mellitus,t2dm)的危险因素，因此， acl还可作为非酒精性脂肪肝和ii型糖尿病的潜在靶点(cohen et al,science2011,332,1519
‑
1523；armstrong et al.,hepatology 2014,59,1174
‑
1197)。
4.研究表明acl还与癌症的发生密切相关。脂类合成的增加为细胞生长和分裂提供必须的脂质，是癌症的重要标志之一，也是肿瘤发生的早期事件(migitaet al,cancer res.2008,68,8547
‑
8554)。乙酰辅酶a是脂肪酸从头合成的重要组成部分，acl作为乙酰辅酶a的主要来源，抑制其基因的表达能显著的抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡。因此，acl作为抗癌的潜在靶点在近年来被广泛研究，寻找其有效的抑制剂有望成为新的抗癌药物(granchi et al.,eur.j.med. chem.2018,157,1276
–
1291；zaidi et al.,cancer res.2012,72:3709
–
3714)。
5.acl作为新的药用靶点已成为近年糖脂代谢紊乱疾病创新药物研究的一个热点。
随着高通量筛选技术的广泛运用，已陆续发现较多种类的acl小分子抑制剂。但目前尚未有acl抑制剂得以成功上市，因此在医药领域竞争十分激烈。bempedoic acid是有效的acl小分子抑制剂，目前处于临床iib试验阶段，用于治疗低密度脂蛋白胆固醇和动脉粥样化性心血管疾病。除bempedoic acid 外，其它acl抑制剂，由于其低细胞穿透力、与acl的低亲和力以及特异性不强等原因，研制受到限制。因此寻找高效、高选择性，同时兼具良好药代动力学性质的小分子acl抑制剂具有重要意义，对于心血管疾病和癌症等疾病的治疗有着广阔的应用前景。


技术实现要素：

6.本技术提供一种天然三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体类杂合物及其药学上可接受的盐，在acl抑制生物学实验中发现该化合物具有显著的acl抑制作用，可用于制备预防、延缓或治疗由acl介导的疾病的药物。
7.结构式如式(1)或式(2)所示的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物或其药学上可接受的盐：
[0008][0009]
本技术对所得三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体类杂合物abelifloroside a和 abelifloroside b进行了atp
‑
柠檬酸裂解酶(atp
‑
citrate lyase,acl)抑制活性实验，表明该化合物具有明显的acl抑制活性，可用于制备由acl所介导疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物，可能对高血脂、动脉粥样硬化、脂肪肝、ii型糖尿病、癌症及其它acl所介导的疾病具有治疗作用，从而在制药领域有巨大的潜在用途。
[0010]
本技术还提供一种如所述的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物在制备atp柠檬酸裂解酶抑制剂中的用途。
[0011]
本技术还提供一种atp柠檬酸裂解酶抑制剂，如所述的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物或其药学上可接受的盐与赋形剂制成片剂、丸剂、胶囊剂或颗粒。
[0012]
本技术还提供一种如所述的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物在制备用于预防、延缓或治疗由atp柠檬酸裂解酶介导疾病的药物中的用途。
[0013]
可选的，所述由atp柠檬酸裂解酶介导疾病包括高脂血症、动脉粥样硬化、非酒精
性脂肪肝、2型糖尿病、癌症或肥胖症。
[0014]
本技术还提供一种药物组合物，包括治疗有效量的所述的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物或其药学上可接受的盐。
[0015]
本技术所述的化合物可单独应用或者合用，亦可与药学上可接受的载体或赋形剂结合，按照常规方法制成口服或者非口服剂型。
[0016]
可选的，治疗有效量的所述的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物或其药学上可接受的盐与赋形剂制成片剂、丸剂、胶囊剂或颗粒。
[0017]
本技术所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。
[0018]
本技术提供一种所述的三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体杂合物的制备方法，包括：
[0019]
(1)大花六道木花蕾干燥后粉碎；75％乙醇溶液室温下提取数次；过滤后合并提取液；减压浓缩后得到总浸膏；
[0020]
(2)总浸膏分散于水中后依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取；萃取液减压浓缩后分别得到石油醚组分、乙酸乙酯组分和正丁醇组分；
[0021]
(3)对其中的乙酸乙酯组分经大孔树脂柱层析并以乙醇
‑
水体积比30:70
→ꢀ
50:50
→
70:30
→
85:15
→
100:0进行梯度洗脱，分别收集不同体积比洗脱液的洗脱组分；
[0022]
(4)对乙醇
‑
水体积比100:0的洗脱组分经sephadex lh
‑
20柱色谱后再经半制备hplc纯化，分别在14.5min和15.9min时得到如权利要求1所述的三萜
‑ꢀ
环烯醚萜苷二聚体杂合物中的abelifloroside a和abelifloroside b。
[0023]
可选的，所述sephadex lh
‑
20柱色谱的洗脱液为meoh；所述半制备hplc 的洗脱液为体积比为88:12的mecn
‑
h2o溶液。
[0024]
本技术经筛选发现化合物abelifloroside a和abelifloroside b对acl呈明显的抑制作用，ic
50
值分别为14.2μm和10.5μm。结果显示，化合物abeliflorosidea和abelifloroside b可能对高脂血症、动脉粥样硬化、脂肪肝、ii型糖尿病、癌症及其它acl所介导的疾病具有治疗作用，从而在制药领域有巨大的潜在用途。
附图说明
[0025]
图1为化合物abelifloroside a的hresims图；
[0026]
图2为化合物abelifloroside a的1h nmr谱；
[0027]
图3为化合物abelifloroside a的
13
c nmr谱；
[0028]
图4为化合物abelifloroside b的hresims图；
[0029]
图5为化合物abelifloroside b的1h nmr谱；
[0030]
图6为化合物abelifloroside b的
13
c nmr谱。
具体实施方式
[0031]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0032]
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
[0033]
天然产物具有结构复杂性和结构多样性的特点，是新药发现的重要来源。天然产物及其衍生物独特的化学结构，使其具有高药效和对特定靶点高选择性的优点以及潜在的独特的作用机制等优点(newman et al.,nat.prod.rep.2000, 17,215
–
34；newman et al.,j.nat.prod.2016,79:629
–
661；tiago et al.,nat.chem. 2016,8:531
‑
541)。因此从天然活性成分中寻找开发新型、高效的acl抑制剂具有重要的研究价值。
[0034]
大花六道木(abelia
×
grandiflora)是忍冬科(caprifoliaceae)六道木属 (abelia)的一种常绿灌木，主要分布于我国华东、西南及华北地区。该植物为糯米条(a.chinensis)和蓪梗花(a.uniflora)的一个杂交种，高可达1.8米，幼枝光滑呈红褐色，叶片倒卵形，墨绿有光泽，花为白色呈钟形，似漏斗状，花期从5 月到11月持续盛开。目前，其花蕾的化学成分及相关的生物活性尚未见报道。本技术首次从大花六道木花蕾的75％乙醇提取物中分离得到化合物abelifloroside a和abelifloroside b。
[0035][0036]
经多次药理试验研究表明，该类化合物具有显著的acl抑制活性，可用于制备由acl所介导疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物，可能对高血脂、动脉粥样硬化、脂肪肝、ii型糖尿病、癌症及其它acl所介导的疾病具有治疗作用，从而在制药领域有巨大的潜在用途。
[0037]
本技术所述的化合物可通过从植物中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。
[0038]
以下以具体的实施例进行说明：
[0039]
大花六道木花蕾采自浙江省台州市，经阴干后粉碎制成粉末；比旋光测试通过rudolf autopol iv旋光仪于21℃下完成；紫外和红外光谱数据分别由 hitachi u
‑
2900e型紫外光谱仪和thermo scientific nicolet is5 ft
‑
ir型红外光谱仪测试获得；低分辩质谱(esi
‑
ms)和高分辨质谱(hr
‑
esi
‑
ms)分别由agilent 1100lc/msd型质谱仪和ab sciex triple tof 5600型质谱仪获得，使用esi离子源同时获得正负离子模式；nmr从bruker avanceii400型核磁共振仪和brukeravanceⅱ600型核磁共振仪获得，化学位移参照未氘代的残余溶剂峰，用δ(ppm) 表示；分析所用的薄层层析板(tlc)购自烟台康比诺公司，使用
uv(λ:254nm, 365nm)和硫酸
‑
香草醛溶液显色；柱色谱主要使用mci微孔树脂chp 20p (mitsubishi chemical industries,75
‑
150μm)，凝胶sephadex lh
‑
20(ge healthcarebiosciences ab)；分析及半制备型液相waters e2695配备waters 2998photodiodearray detector(pda)和waters 2424evaporative light
‑
scattering detector(elsd) 检测器以及waters sunfire柱(5μm,250
×
10mm)；实验所用分析纯溶剂甲醇、乙醇等购自上海泰坦化学有限公司，色谱级甲醇和乙腈由北京百灵威公司采购。
[0040]
实施例1：化合物abelifloroside a和abelifloroside b的制备
[0041]
将0.4kg大花六道木(a.
×
grandiflora)花干燥后粉碎，用75％乙醇溶液室温下提取5次，每次2l 24小时。过滤合并提取液，减压浓缩后得到总浸膏67g (semi
‑
dry)。总浸膏用1l水分散后，依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次。萃取液减压浓缩后得到石油醚组分(17.2g)、乙酸乙酯组分(16.3 g)和正丁醇组分(20.6g)。
[0042]
乙酸乙酯组分(16.3g)经大孔树脂柱层析以乙醇
‑
水(30:70
→
50:50
→
70:30
ꢀ→
85:15
→
100:0；v/v)梯度洗脱，收集所得下柱液，通过tlc薄层色谱进行显色检识，合并具有相同斑点的下柱液，最终根据tlc显色分为5个组分fr.1
–ꢀ
fr.5。组分fr.5(乙醇
‑
水100:0洗脱组分)经sephadex lh
‑
20(meoh)柱色谱后再经半制备hplc(mecn
‑
h2o,88:12；v/v,3ml/min)纯化，得到化合物 abelifloroside a(1.7mg,t
r
＝14.5min)和abelifloroside b(1.2mg,t
r
＝15.9min)。
[0043][0044]
化合物的理化数据如下：
[0045]
abelifloroside a白色无定型粉末；[α]
d21
‑
64.3(c 0.1,meoh)；uv(mecn) λ
max
(logε)231(1.49)nm；ecd(c0.51
×
10
‑3m,meoh)λ
max
(δε):221(
‑
17.5),246 (3.0)；ir(kbr)v
max
3454,3301,2967,2925,2850,1683,1639,1539,1452,1382, 1250,1205,1142,1080,1025,970,771,629cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表1； esims m/z 981[m h]

；hresims m/z 981.5600[m h]

(calcd for c
55
h
80
o
15
, 981.5570,δ＝3.0ppm)。
[0046]
表1.化合物abelifloroside a的1h和
13
c nmr(in cd3od)数据
a
.
[0047][0048][0049]
a
assignmentswere made by a combination of 1d and 2d nmr experiments.
[0050]
abelifloroside b白色无定型粉末；[α]
d21
‑
31.7(c 0.1,meoh)；uv(mecn) λ
max
(logε)233(3.47)nm；ecd(c 3.21
×
10
‑3m,meoh)λ
max
(δε):223(
‑
16.6),247 (3.9)；ir(kbr)v
max 3423,3312,2970,2918,2827,1718,1644,1509,1443,1379, 1268,1194,1142,1077,803,771,674cm
‑1；1h和
13
c nmr数据见表2；esims m/z1039[m h]

；hresims m/z 1039.5644[m h]

(calcd for c
57
h
82
o
17
,1039.5625, δ＝1.9ppm)。
[0051]
表2.化合物abelifloroside b的1h和
13
c nmr(in cd3od)数据
a
.
[0052][0053][0054]
a
assignmentswere made by a combination of 1d and 2d nmr experiments.
[0055]
实施例2：acl抑制活性测试
[0056]
实验方法：本实验中atp依赖的柠檬酸裂解酶acl能将柠檬酸催化转变为乙酰辅酶a，进而产生脂肪酸合成的前体分子－丙二酸单酰辅酶a。该反应伴随着atp的消耗，因此可以使用adp
‑
glo激酶检测试剂盒检测atp的变化，来间接反应化合物对acl酶活性的抑制作用。
[0057]
具体来说，初筛选择实施例1分离纯化得到的化合物浓度为20μg/ml时对 acl酶活性的百分抑制率进行考察，试验结果表明abelifloroside a和 abelifloroside b的抑制率分别为96.4％和84.1％。
[0058]
进一步测定ic
50
值：样品临用前溶于dmso配成合适浓度，3倍稀释，7 个稀释度，三复孔，取2μl样品溶液加入到标准的测活体系(40mm tris,ph 8.0, 10mm mgcl2,5mm dtt,
atp,coa,柠檬酸钠和acl)，37℃下孵育30min。而后，体系内加入25μl adp
‑
glo试剂，室温下孵育30min，以终止反应，并消耗完剩余的atp。再加入激酶检测试剂孵育30min后，其荧光信号由envision 读出，其动力学曲线一级反应的斜率作为酶的活性指标。
[0059]
以相对活性对化合物浓度作图，经公式v/v0＝100/(1 b*[i]/ic
50
)拟合得到 ic
50
值，实验重复三次，结果取三次的平均值。阳性对照bms303141的ic
50
值为0.46μm。
[0060]
表3.大花六道木花蕾中abelifloroside a和abelifloroside b的acl抑制活性数据
[0061][0062]
三萜
‑
环烯醚萜苷二聚体类杂合物(实施例1分离得到的abelifloroside a和 abelifloroside b)抑制acl的ic
50
值见表3，测试结果表明上述两个化合物均对 acl表现出显著的抑制活性，表明本技术的化合物可用于制备治疗高脂血症、动脉粥样硬化、脂肪肝、ii型糖尿病、癌症及其它acl所介导的疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物。
[0063]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。