一种能降解玉米赤霉烯酮的水解酶的突变体构建方法及其应用与流程

1.本发明涉及一种能降解玉米赤霉烯酮的水解酶的突变体构建方法及其应用，属于生物技术和基因工程技术。


背景技术：

2.玉米赤霉烯酮(zearalenone)是由镰刀菌属产生的一种雌激素二羟基苯甲酸内酯，最早发现于发霉的玉米中，是世界上污染范围最广的一种镰刀菌毒素，在发霉玉米、小麦等谷物及其制品中广泛存在。玉米赤霉烯酮的雌激素毒性可引起猪等家畜的生殖障碍，给饲养业造成巨大损失；玉米赤霉烯酮可通过食物链在人体内蓄积，会增大患乳腺癌、肝癌、食道癌等的发病率，对人类健康造成巨大的威胁。
3.目前，主要采取物理、化学和生物脱毒的方法降低发霉玉米、小麦等谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的毒性。以饲料行业为例，物理法包括高温破坏、紫外线、射线照射和吸附等，缺点是会导致饲料中营养物质的损失和破坏、吸附剂的二次污染及吸附剂成本较高、毒素处理不完全等；化方法包括臭氧解毒，过氧化氢等强氧化剂处理，酸、碱处理，碳酸钠浸泡处理。该方法会改变饲料的营养成分、适口性并对食品安全造成新的危害，不适宜用于大批量处理被玉米赤霉烯酮污染的饲料；生物学方法的原理涉及微生物细胞吸附，微生物本身或其酶降解玉米赤霉烯酮产生无毒产品，因此该方法可有效替代物理化学法用于饲料中玉米赤霉烯酮的去除，这些生物学方法需要安全有效的菌株来吸附或降解玉米赤霉烯酮。微生物降解酶/水解酶被认为是玉米赤霉烯酮解毒的最佳方法，因为酶法处理可以不破坏饲料营养成分，是一种绿色安全的处理方法。
4.目前已经报道了多种微生物具有降解玉米赤霉烯酮的能力，2002年，takahashi等从一株粉红粘帚霉菌(clonostachys rosea)中得到一种内脂水解酶zhd101，能特异性地结合降解玉米赤霉烯酮，zhd101切割玉米赤霉烯酮大环上的内酯键产生具有开放侧链的二羟基苯基衍生物，随后丢失二氧化碳得到一种无毒的烷基间苯二酚产物。后来又有研究者通过定点突变zhd101的相关氨基酸残基(v153h/v158f)获得了降解效果更好的玉米赤霉烯酮水解酶突变体，并命名为zhd101.1。但是该突变体酶的表达是在大肠杆菌中实现的，由于大肠杆菌为一种条件致病菌，因而通过该技术实现的产品并不适合应用在食品、饲料等行业。


技术实现要素：

5.为提高水解酶对玉米赤霉烯酮的降解率，本发明通过分析水解酶zhd101.1结构上的潜在突变热点(即有突变改造价值的氨基酸残基位点)，应用分子生物学技术构建定点突变，并筛选出降解率提高的突变体，进一步推进该玉米赤霉烯酮水解酶的优化改造，为工业化生产和应用奠定基础。
6.本发明提供了对玉米赤霉烯酮降解率提高的玉米赤霉烯酮水解酶的突变体，具有如下至少一个位点的突变：
7.s103a、v172r、g205q或h248e。
8.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸。
9.在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第172位缬氨酸突变为精氨酸。
10.在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第205位甘氨酸突变为谷氨酰胺。
11.在一种实施方中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第248位组氨酸突变为谷氨酸。
12.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第172位缬氨酸突变为精氨酸。
13.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第248位组氨酸突变为谷氨酸。
14.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将将第172位缬氨酸突变为精氨酸，并第205位甘氨酸突变为谷氨酰胺。
15.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第172位缬氨酸突变为精氨酸，并将第248位组氨酸突变为谷氨酸。
16.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第172位缬氨酸突变为精氨酸，并将第248位组氨酸突变为谷氨酸。
17.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第172位缬氨酸突变为精氨酸，并将第205位甘氨酸突变为谷氨酰胺。
18.在一种实施方式中，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体是在seq id no.1所示氨基酸序列的基础上，将第103位丝氨酸突变为丙氨酸，并将第172位缬氨酸突变为精氨酸，并将第205位甘氨酸突变为谷氨酰胺，并将第248位组氨酸突变为谷氨酸。
19.本发明还提供一种降解率提高的降解玉米赤霉烯酮水解酶突变体的构建方法，步骤包括：
20.1)利用专业软件计算玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的关键氨基酸残基位置，作为潜在突变热点/位点，选择一个或多个位点进行突变设计；
21.2)对玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的核酸序列进行分析，设计拟突变位点的pcr用引物(正向引物f、逆向引物r)，并确保突变位点采用的密码子是针对乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化的；
22.3)利用所述f和r引物，采用一定的pcr反应体系和一系列温度控制，通过pcr扩增玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1所在质粒的序列全长；
23.4)上述pcr扩增产物经过dpni酶消化处理后，转化到大肠杆菌宿主菌dh5α中进行扩增、抽提质粒，通过酶切、测序验证等方法获得发生预期突变的突变体质粒；
24.5)将上述突变体质粒转化到乳酸克鲁维酵母宿主菌gg799中，得到重组酵母转化子，通过抽提重组酵母转化子全基因组序列、测序验证等方法，获得整合有突变体基因的重
组酵母菌株；
25.6)对上述整合有突变体基因的重组酵母菌株使用yepd培养基培养，使用yepg培养基诱导目标酶蛋白的分泌表达，从分泌表达上清液中分离、浓缩水解酶突变体；
26.7)通过检测和计算分泌表达上清液中水解酶突变体对玉米赤霉烯酮的降解率，筛选降解率提高的突变体。
27.本发明的核酸序列通常可以用pcr扩增法、基因重组或人工合成中的一种或几种方法获得。之后再将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
28.本发明还提供了编码所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体的基因。
29.本发明还提供了携带所述基因的表达载体。
30.在本专利实施方式中，所述重组微生物细胞以乳酸克鲁维酵母为宿主，以质粒pklac1为表达载体，是将seq id no.2所示基因序列克隆到pklac1中得到重组质粒pklac1
‑
zhd101.1。
31.在一种实施方式中，所述方法是将重组微生物细胞在培养基中培养至od
600
达到1.0时，转接至yepg诱导培养基中，于28～30℃、150～300rpm诱导72～120h产酶；所述yepg诱导培养基含有10g/l酵母粉，20g/l蛋白胨，20g/l半乳糖，其中起诱导作用的成分是培养基中含有的半乳糖。
32.在一种实施方式中，所述方法还包括通过离心法收集重组酵母培养液的上清液，并进行浓缩。
33.本技术所用的术语“转化”是基因工程领域技术人员熟知的方法：将含有目的基因的表达载体导入宿主细胞内，转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化、采用氯化钙、deae
‑
葡聚糖或其他物质的转染、微粒轰击、脂质体转染、感染等。本发明中较佳的方法为电转化法；随后，在适宜的培养条件下繁殖转化子细胞。
34.本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基配方、培养温度、诱导物、诱导剂量和时间等条件。采用本领域常规检测手段，如uplc
‑
ms检测方法可以检测出玉米赤霉烯酮水解酶突变体对玉米赤霉烯酮的降解率。本发明还采用常规的蛋白分离纯化技术，进行玉米赤霉烯酮水解酶的处理，其包括离心、过滤、浓缩等过程；具体地，本发明提供的玉米赤霉烯酮水解酶分离浓缩方法是采用10kda的超滤浓缩管进行超滤浓缩。
35.本发明还提供了所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体在降解玉米赤霉烯酮中的应用。
36.在一种实施方式中，所述应用是将所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体(或含所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体的分泌表达上清液，或上清液的浓缩液)加入至含玉米赤霉烯酮的反应体系中，在30～50℃下反应20～40min，达到降解玉米赤霉烯酮的效果。
37.本发明的有益效果：
38.1.本发明提供的玉米赤霉烯酮水解酶突变体，是在下列实施例中限定的实验条件下进行的，是在未经过任何工艺优化前提下，本发明中突变体相对于未突变的水解酶具有相似或较高的催化活性，本发明重组表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体相比未突变的水解酶，对于玉米赤霉烯酮的降解率显著提高。
39.2.本发明通过分析，有针对性地对玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的氨基酸残基或结构进行改进，通过基因工程方法来获得突变体，所得突变体对玉米赤霉烯酮的降解效率
显著提高的特性使得突变体酶更加适应工业化应用。
40.3.本发明与其他已报道的结果相比，是在食品级酵母菌乳酸克鲁维酵母中实现了酶的分泌表达，表达产物具有食品级安全性，适合在食品和饲料等行业中应用。
附图说明
41.图1：分泌表达玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的单点突变体的重组乳酸克鲁维酵母的发酵上清液对玉米赤霉烯酮的降解率对比图。
42.图2：分泌表达玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的组合突变体的重组乳酸克鲁维酵母的发酵上清液对玉米赤霉烯酮的降解率对比图。
具体实施方式
43.下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制发明的范围。
44.本发明生物材料的来源的一般性说明：
45.1、引物合成：本发明中所使用的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
46.2、实验中所使用的所有限制性内切酶购于thermo fisher scientific公司。pcr产物纯化试剂盒、胶回收产物纯化试剂盒、质粒小量提取试剂盒、真菌基因组提取试剂盒、dna限制性内切酶、phusion酶、t4 dna连接试剂盒、protein ladder、dna marker、超滤浓缩管、bca蛋白定量试剂盒等购于thermo fisher scientific公司。序列测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
47.3、下述实施例中可能涉及的培养基成分如下：
48.lb液体培养基：5g/l酵母粉、10g/l胰蛋白胨、10g/l nacl；
49.yepd液体培养基：10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨、20g/l葡萄糖；
50.yepg诱导培养基：10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨、20g/l半乳糖；
51.ycb平板培养基：3.4g/l ynb、10g/l葡萄糖、15g/l琼脂粉、5.0mmol/l乙酰胺。
52.4、酶活的定义：一个单位的玉米赤霉烯酮降解酶活性定义为在测定条件下每分钟降解1μg玉米赤霉烯酮所需的酶量。酶活性(u/mg)的计算公式为：
[0053][0054]
其中x为底物降解量，底物降解量等于初始底物量减去反应后的残留底物量，单位为μg。
[0055]
5、玉米赤霉烯酮的uplc
‑
ms检测方法：
[0056]
(1)色谱条件：柱：c18；流速：0.30ml/min；柱温：40℃；流动相：0.1％甲酸水(a相)和乙腈(b相)；梯度洗脱程序如表1所示。
[0057]
表1玉米赤霉烯酮液相色谱检测的梯度洗脱程序表
[0058][0059][0060]
(2)质谱条件：离子源：电喷雾离子源；质谱扫描方式：多重反应监测模式(mrm)；锥孔电压：3.0kv；加热气温度：500℃；离子源温度：150℃；脱溶剂气：800l/h；质谱参数见表2所示。
[0061]
表2玉米赤霉烯酮检测的质谱参数表
[0062][0063]
注：*表示定量离子。
[0064]
6、玉米赤霉烯酮降解率的计算方法：
[0065][0066]
其中，上文中所述底物即指玉米赤霉烯酮。
[0067]
实施例1玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1突变位点的选择和突变方法
[0068]
所述玉米赤霉烯酮水解酶的未突变酶序列如seq id no.1所示。通过分析确定该酶的突变热点，选取并进行了该酶的如下突变：q45v、s103a、h125r、h125e、h134d、h134a、v172r、v172t、p188d、p188h、g205q、w210d、w210e、t211a、h248d、h248e、d250h。
[0069]
具体步骤为：设计上下游引物，采用pcr扩增法，采用如下所述的一定的pcr反应体系和一系列温度控制，以重组质粒pklac1
‑
zhd101.1(质粒的构建方法公开于论文《玉米赤霉烯酮降解酶zhd101的突变改造、分泌表达及应用研究》)为模板进行pcr反应，例如，以重组质粒pklac1
‑
zhd101.1为模板，以pri
‑
q45v
‑
f和pri
‑
q45v
‑
r为引物引入q45v突变。pcr扩增产物用dpni限制性内切酶进行酶切、回收后，转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布氨苄青霉素抗性平板，37℃过夜培养。在抗性平板上挑取阳性克隆，用bglii、sali双酶切验证，并将验证正确的质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序后发生上述突变的质粒和含该质粒的大肠杆菌菌株进行保存。组合突变的步骤是在单点突变序列的基础上，依次用对应于其它突变位点的引物，对已获得的突变体继续进行pcr反应，从而引入更多突变位点，直至获得目标组合突变体。
[0070]
本实施例中所述的pcr突变反应体系及程序如表3所示，dpni酶切反应体系如表4所示，具体突变引物如表5所示。
[0071]
表3 pcr突变反应体系及程序表
[0072][0073][0074]
表4 dpni酶切反应体系表
[0075][0076]
表5玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1突变引物序列
[0077][0078][0079]
实施例2表达玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1突变体的重组酵母菌的构建
[0080]
用sacii限制性内切酶对实施例1中获得的突变体重组质粒进行线性化，采用pcr产物纯化试剂盒纯化回收酶切产物。制备乳酸克鲁维酵母gg799感受态细胞并用电脉冲法将线性化的质粒转化到乳酸克鲁维酵母gg799感受态细胞中。电击后的酵母细胞立即加入1.0ml预冷的山梨醇溶液，30℃孵育1～3h，离心收集酵母菌体，留100μl重悬菌体，均匀涂布在含有乙酰胺的ycb平板上，于30℃培养3～5d。挑取转化后平板上多个生长良好的单一菌
落，接种于10.0ml yepd液体试管中，于30℃、200rpm过夜培养。离心收集菌体，采用真菌基因组抽提试剂盒抽提重组菌基因组。在测定基因组dna浓度后，以此dna作为模板，进行pcr验证。将验证成功的pcr产物及对应的重组酵母菌送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序验证正确、携带突变体基因的重组酵母菌保存于
‑
80℃超低温冰箱。
[0081]
实施例3玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的单点突变体的分泌表达及其对玉米赤霉烯酮的降解应用
[0082]
(1)取出实施例2保存的测序验证正确、携带单点突变体的重组酵母菌进行活化。挑取单菌落于10.0ml yepd培养基中，30℃下200rpm，培养18～22h至od
600
达到1.0时，以1％的接种量转接至yepg诱导培养基中，于30℃、200rpm诱导72h分泌表达产酶。发酵结束后以8000rpm离心，收集发酵上清液，并用截留分子量为10kda的超滤离心管浓缩。用蛋白质定量试剂盒对浓缩后的发酵上清液进行蛋白质定量。
[0083]
(2)利用含玉米赤霉烯酮水解酶突变体蛋白的上述重组乳酸克鲁维酵母分泌表达的上清液(或浓缩的上清液)降解玉米赤霉烯酮，具体反应体系为：1ml总反应体系，反应缓冲液为tris
‑
hcl缓冲液(ph 8.0)，反应体系中加入终浓度为20.0μg/ml的玉米赤霉烯酮，并加入含玉米赤霉烯酮水解酶(未突变的酶或突变体)的步骤(1)制备的分泌表达上清液(或浓缩的上清液)，使得反应体系中含蛋白质的终浓度为0.1mg/ml，于35℃下反应30min。反应结束后，加入1.0ml甲醇以终止反应。反应物用0.22μm滤膜过滤后，通过uplc
‑
ms检测分析剩余玉米赤霉烯酮的含量。
[0084]
经uplc
‑
ms检测，单点突变的玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1突变体对玉米赤霉烯酮的降解率结果如表6所示。
[0085]
表6玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的单点突变体对玉米赤霉烯酮的降解率
[0086][0087]
从表6可以看出，单点突变体s103a、v172r、g205q、h248e对玉米赤霉烯酮的降解率有显著的提高，降解率分别达到90.74％、95.32％、91.26％、94.73％。
[0088]
实施例4玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的两点组合突变体对玉米赤霉烯酮的降解应用
[0089]
根据实施例2～3得到的单点突变的有效突变位点，在单点突变s103a、v172r、g205q、h248e的基础上，对玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1进行两点组合突变。组合突变的步骤为：以含有单点突变的重组质粒为模板，依次用对应于其它突变位点的引物，对已获得的含单点突变的重组质粒继续进行pcr反应，从而引入更多突变位点，直至获得含组合突变基
因的重组质粒。pcr反应条件如实施例1中所述。按照实施例3中所述相同方法在乳酸克鲁维酵母中进行了突变体酶的分泌表达。用得到的培养上清液进行玉米赤霉烯酮降解试验，具体反应过程及参数如实施例3所述。反应物用0.22μm滤膜过滤后，通过uplc
‑
ms检测分析剩余玉米赤霉烯酮的含量。
[0090]
经uplc
‑
ms检测，两点组合突变的玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1突变体对玉米赤霉烯酮的降解率结果如表7所示。
[0091]
表7玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的两点组合突变体对玉米赤霉烯酮的降解率
[0092][0093][0094]
从表7可以看出，突变体组合s103a/h248e和s103a/v172r对玉米赤霉烯酮的降解率都超过了97％。
[0095]
实施例5玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的多位点组合突变体对玉米赤霉烯酮的降解应用
[0096]
根据实施例4得到的组合突变结果，在此基础上，对玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1进行多位点组合突变，组合突变的步骤是：以含有实施例4所述组合突变的重组质粒为模板，依次用对应于其它突变位点的引物，对已获得的突变体继续进行pcr反应，从而引入更多突变位点，直至获得目标组合突变体。pcr反应条件如实施例1中所述。按照实施例3中所述的相同方法在乳酸克鲁维酵母中进行了突变体酶的分泌表达。用得到的培养上清液进行玉米赤霉烯酮降解试验，具体反应过程及参数如实施例3所述。反应物用0.22μm滤膜过滤后，通过uplc
‑
ms检测分析剩余玉米赤霉烯酮的含量。
[0097]
经uplc
‑
ms检测，多位点组合突变的玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1突变体对玉米赤霉烯酮的降解率结果如表8所示。
[0098]
表8玉米赤霉烯酮水解酶zhd101.1的多位点组合突变体对玉米赤霉烯酮的降解率
[0099][0100]
从表8可以看出，组合突变体s103a/v172r/h248e对玉米赤霉烯酮的降解率最高，
降解率达到99.28％。而组合突变体s103a/v172r/g205q/h248e尽管对4个较好的突变位点同时进行了突变，但对玉米赤霉烯酮的降解效果并不如组合突变体s103a/v172r/h248e。
[0101]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。