一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法与流程

1.本发明涉及荧光检测标记技术领域，特别涉及一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法。


背景技术：

2.系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，简称sle)，是一种常见的慢性自体免疫性疾病。该病的特征是机体可产生自身抗体，从而导致皮肤损伤和器官功能障碍，可累及的器官包括心脏、肝、肾脏、肺、皮肤、血管、关节以及神经系统等。sle从发病到确诊往往需要几年的时间，虽然目前还不能完全治愈，但早期诊断对减缓其发展是很重要的。由于sle是由多种因素导致的，并常伴随有其它自身免疫性疾病，因此诊断该疾病需要进行多项检测，其中，sle自身抗体的检测具有非常重要的意义。
3.与sle相关的自身抗体主要有抗dsdna抗体和抗sm抗体，此外，还包括抗核糖体p蛋白，抗pcna、u1
‑
nrnp、ss
‑
a、ss
‑
b等抗体。其中，抗dsdna 抗体的靶抗原是双螺旋dna，该抗体可与dna结合成为免疫复合物在肾小球基底膜沉积，或直接作用于肾小球抗原造成肾损伤。目前，抗dsdna抗体具有较高的特异性，且与sle的活动相平行，已被列为sle的诊断标准之一。抗 sm抗体属于抗核抗体，也是一种sle的高特异性抗体。抗核糖体p蛋白抗体是sle的特异性抗体，其他疾病和正常人中很少见。抗pcna抗体(抗增殖细胞核抗原抗体)是一种协调dna复制的核蛋白，对sle的诊断有着很高的价值。抗u1
‑
nrnp抗体(抗小核核糖核蛋白复合物抗体)在30
‑
40％的sle患者中可检出，且大多患者血清中同时伴有抗sm抗体的出现。抗ss
‑
a抗体与各类自身免疫性疾病相关，在100％的新生儿sle患者中可出现。抗ss
‑
b抗体见于10
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20％的女性sle患者。
4.现有技术中多数对自身抗体的检测方法采用学发光分析法、酶联免疫吸附测定、胶体金免疫层析法、免疫荧光分析法、间接免疫荧光法等，其中在临床上应用最为广泛的是间接免疫荧光法，该方法灵敏度高，但其过程包括手工操作和荧光显微镜观察，同时需要丰富的经验，收到多种因素的影响，存在操作时间长的缺陷，酶联免疫吸附测定法也是一种较为常见的临床方法，但与间接免疫荧光法一样，存在耗时较长、影响就医，导致病情恶化，其他方法虽然较为快捷，但在实际应用当中存在较多限制，有些方法并不成熟，需要进一步研究探索，诊断的准确性有待进一步提高，因此，目前对于系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的诊断检测，准确性高的方法耗时较长，有鉴于此，我们提出了一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于提供一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法，可以有效解决背景技术中的问题。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法，主要用于检测抗双链dna 抗体、
次。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
22.本发明公开了一种检测系统性红斑狼疮患者自身抗体的方法，与传统检测方法相比，本发明中双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂可预先进行制备，并且通过添加特定制备的稀释剂，能够提供稳定的液态保存环境，于4℃温度下，有利于对双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂进行长时间保存，在需要进行检测时，只需取出其中部分，将其通过点样仪排布于事先准备好的醋酸纤维素膜上，将待检测患者血清样本进行稀释后，即可进行检测，在较短时间内即可完成自身抗体的检测，效率高；并且通过以3
×
4的阵列方式排布点样，按照三种抗体检测试剂分为三排，每排排布四个检测样点，其中每相邻两个检测样点之间的间距为5
‑
8cm，能够提高检测数量，增加检测结果的可靠性。
具体实施方式
23.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
24.本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式，这里使用的“第一”、“第二”仅用于区别同一技术特征，并不对该技术特征的顺序和数量等加以限定。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。
25.实施例1
26.对鼠抗人免疫球蛋白进行荧光标记：
27.将1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液、f1
‑
y030微球溶液、n
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀并在35℃下反应20分钟，然后加入naoh 溶液，在ph计的检测下将混合溶液的ph值调整到7.2
‑
7.4之间，按照所需标记比例将向混合溶液中加入待标记的鼠抗人免疫球蛋白，在30℃下反应30 分钟，反应后加入nh4cl溶液，同样在30℃下静置15分钟，以终止反应，然后进行pbs缓冲液透析并回收混合溶液。
28.本实施例中，1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液、f1
‑
y030 微球溶液、n
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液、鼠抗人免疫球蛋白和nh4cl溶液之间的质量比为：2.5
‑
3∶1
‑
2∶1:2
‑
3:0.1
‑
0.2，其中所采用的nh4cl溶液的浓度为 0.3
‑
0.4mol/l。
29.需要说明的是，pbs是磷酸盐缓冲盐溶液，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为 na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl，由于na2hpo4和kh2po4有二级解离，缓冲的ph值范围很广，而nacl和kcl主要作用为增加盐离子浓度，如有需要pbs 还可以补加1mmol/l cacl2和0.5mmol/l mgcl2，以提供二价
阳离子，具体的制备方法为：称取8.0g nacl、0.2g kcl、1.44g na2hpo4、0.24g kh2po4 溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可得0.01m pbs缓冲液；n
‑
羟基琥珀酰亚胺溶液是合成肽、抗生素、氨基酸、蛋白质等重要原料，于本实施例中用于制备活性酯，在肽偶联时抑制其外旋光作用的发生。
30.另外，本实施中，1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐在本实施例中是作为半抗原的偶联剂使用，对鼠抗人免疫球蛋白进行荧光标记始终处于37℃条件下进行，完成后于该温度下保存。
31.实施例2
32.制备双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂：
33.具体为，取粒径为0.05μm
‑
0.1μm甲苯磺酰基纳米磁珠悬浮液，磁分离后去除上清液，分装与三个容器中，分别加入双链dna抗原、sm抗原和核小体抗原，然后均加入浓度为5mmol/l
‑
10mmol/l的硼酸铵溶液，于37℃下混悬 24
‑
36h，再次进行磁分离，去除上清液，即分别得到所述的双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂。
34.本实施例中，始终处于37℃条件下进行，完成后于该温度下保存，其中浓度为5mmol/l
‑
10mmol/l的硼酸铵溶液可以用硼酸盐进行代替。
35.另外，本实施例中，在制备双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂之前，除利用粒径为0.05μm
‑
0.1μm甲苯磺酰基纳米磁珠悬浮液先制备双链dna抗原包被的磁微粒、sm抗原包被的磁微粒和核小体抗原包被的磁微粒以外，还可以利用羧基磁珠悬浮液替代甲苯磺酰基纳米磁珠悬浮液，羧基修饰的超顺磁性磁颗粒具有具有超顺磁性、快速磁响应性、丰富羧基官能团、非常高的比表面积，单分散性和亚微米尺度粒径，长期稳定性好，批间重复性好等特点能够在特殊化学试剂(如edc)的作用下将多肽、蛋白、寡聚核苷酸等生物配体共价偶联到微球表面。
36.实施例3
37.制备稀释剂：
38.向tris
‑
hcl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液)中依次加入天冬氨酸、牛血清白蛋白、二硫苏糖醇、表面活性剂、氯化钠溶液、防腐剂、酶抑制剂，混合后制得所述稀释剂；
39.本实施例中，按照如下重量费对上述稀释剂进行制备：天冬氨酸5％
ꢀ‑
10％、牛血清白蛋白2％
‑
8％、二硫苏糖醇0.05％
‑
0.1％、表面活性剂0.1％
ꢀ‑
0.3％、氯化钠溶液10％
‑
20％、防腐剂0.05％
‑
0.15％、酶抑制剂0.1％
ꢀ‑
0.2％、余量为tris
‑
hcl缓冲液，其中氯化钠溶液的浓度为0.3
‑
0.4mol/l。
40.需要说明的是，在本实施例中，天冬氨酸是作为渗透物质加入其中，其当然可用甲胺类物质进行替换，用于形成助溶剂，增大表面张力，二硫苏糖醇可采用三(2
‑
羧乙基)膦进行等量替换，在本实施例中作为还原剂；
41.酶抑制剂为蛋白酶抑制剂或rna酶抑制剂中的任意一种，酶抑制剂能够一定程度改善耦合物的稳定性，天然抗核抗体靶抗原是从动物组织或细胞中直接提取，对各种水解酶极度敏感，因此，加入一定浓度的酶抑制剂对于耦合物的液态保存具有重要作用。
42.所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠和亚硝酸钠中的任意一种，能够抑制溶液中微
生物的生长和繁殖，以延长试剂的保存时间。
43.氯化钠溶液可采用相同浓度的氯化钾溶液进行等量替换，盐类提供离子环境，合适的离子环境有利于维持溶液渗透式平衡，中和抗原抗体表面的电荷，破坏水层，促进抗原抗体复合物的紧密结合。
44.牛血清白蛋白可用络蛋白、凝胶或者鱼皮凝胶进行替换，用作蛋白保护剂，可以一定程度降低耦合物的降解与失活。其中，水解酪蛋白作为蛋白保护剂可以减轻一些不利环境如加热、表面张力及化学因素等引起的蛋白变性。
45.上述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂中的至少一种。
46.另外，二硫苏糖醇可采用三(2
‑
羧乙基)膦进行等量替换，在本实施例中作为还原剂，用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。
47.经过实验证明，以本实施例公开的方法制备的稀释剂，能够提供稳定的液态保存环境，于4℃温度下，有利于对双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂进行长时间保存。
48.实施例4
49.制备进行检测的醋酸纤维素膜：
50.准备醋酸纤维素膜，将其裁剪为30cm
×
40cm，然后采用点样仪将s3中加入稀释剂后的双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂按照阵列排布点制在醋酸纤维素膜上，将s4中稀释后的血清样本点滴在醋酸纤维素膜上对应的检测样点处，静置15
‑
20min；
51.本实施例中，点样仪采用德国biostep点样仪，于30cm
×
40cm醋酸纤维素膜上的以3
×
4的阵列方式排布点样，按照三种抗体检测试剂分为三排，每排排布四个检测样点，其中每相邻两个检测样点之间的间距为5
‑
8cm；并且每个检测样点应当重复进行点样3
‑
4次，需要注意的是，本实施例中，进行点样之前，需要将加入稀释剂后的双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂恢复至37℃。
52.需要说明的是，醋酸纤维素，是指以醋酸作为溶剂，醋酐作为乙酰化剂，在催化剂作用下进行酯化而得到的一种热塑性树脂，是纤维素衍生物中最早进行商品化生产并且不断发展的纤维素有机酸酯。醋酸纤维素作为多孔膜材料，具有选择性高、透水量大、加工简单等特点。
53.实施例5
54.抗体检验：
55.取待检测患者血清样本，将其按照1∶500的比例稀释，点滴在醋酸纤维素膜上对应的检测样点处，静置15
‑
20min，于荧光检测仪器下进行检测，即可获得待检测患者血清样本中的双链dna抗体、抗sm抗体和抗核抗体情况。
56.综合以上实施例，可以看出的是，本发明中双链dna抗体检测混合制剂、 sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂可预先进行制备，并且通过添加特定制备的稀释剂，能够提供稳定的液态保存环境，于4℃温度下，有利于对双链dna抗体检测混合制剂、sm抗体检测混合制剂和抗核抗体检测混合制剂进行长时间保存，在需要进行检测时，只需取出其中部分，将其通过点样仪排布于事先准备好的醋酸纤维素膜上，将待检测患者血清样本进
行稀释后，即可进行检测，在较短时间内即可完成自身抗体的检测，效率高；并且通过以3
×
4的阵列方式排布点样，按照三种抗体检测试剂分为三排，每排排布四个检测样点，其中每相邻两个检测样点之间的间距为5
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8cm，能够提高检测数量，增加检测结果的可靠性。
57.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。