一种达托霉素的纯化方法与流程

1.本发明属于抗生素生产技术领域，特别涉及一种达托霉素的纯化方法。


背景技术：

2.达托霉素作为一种环脂肽类抗生素，由链霉菌(s.reseosporus)发酵生产，其作为医药中间体，并可用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发型皮肤及皮肤结构感染。具体药理作用为可通过破坏细菌细胞膜、扰乱细胞膜转运氨基酸、改变细胞膜电位等方式实现抗菌、杀菌效果。
3.在现有技术中，传统的醋酸盐缓冲体系在纯化达托霉素的层析过程中，无法去除产品峰前和产品峰后的杂峰，导致在收集液中，达托霉素含量较低，无法满足市场对于达托霉素成品的高质量要求。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：解决传统达托霉素纯化方法收率低的问题。
5.为了解决上述技术问题，本发明提供一种达托霉素的纯化方法，包括含有杂质的达托霉素溶液在ph＝2.6～2.8的磷酸二氢钠缓冲体系中反应，并过聚合物反相层析柱的步骤。
6.本发明的有益效果在于：将含有杂质的达托霉素溶液在ph＝2.6～2.8的磷酸二氢钠的缓冲体系中反应，以通过缓冲体系中的成分与位于达托霉素产品峰前和产品峰后的杂质相结合，改变杂质极性和杂质在聚合物反相层析柱内的吸附速率，从而实现将杂质与达托霉素相分离，提高达托霉素产品粉的质量及收率。
具体实施方式
7.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
8.需要说明的是，在本文中，所述unips40
‑
300购自苏州纳薇科技股份有限公司；所述hz
‑
016购自华震科技有限公司。
9.一种达托霉素的纯化方法，包括含有杂质的达托霉素溶液在ph＝2.6～2.8的磷酸二氢钠缓冲体系中反应，并过聚合物反相层析柱的步骤。
10.优选的，所述达托霉素的纯化方法包括如下步骤：
11.s1、将达托霉素粗粉用去离子水溶解，并上层析柱进行脱盐，获得达托霉素脱盐液；
12.s2、用10％氨水对所述达托霉素脱盐液调节ph＝6.0～6.5，并加入乙醇，获得上柱液；
13.s3、用去离子水配制磷酸二氢钠
‑
磷酸氢二钠缓冲液；
14.s4、在所述磷酸二氢钠
‑
磷酸氢二钠缓冲液中加入乙醇，获得预洗液和洗脱液；
15.其中，所述洗脱液通过磷酸调节ph＝2.6～2.8；
16.s5、将所述上柱液过聚合物反向层析柱，并用所述预洗液对聚合物反向层析柱进行预洗，再用所述洗脱液进行洗脱，以前杂质点d7＜0.3％，后杂质点d8＜0.3％进行收集，获得达托霉素收集液；
17.s6、将所述达托霉素收集液进行赶醇和冻干，获得达托霉素成品粉。
18.优选的，所述洗脱液的ph＝2.71。
19.其中，所述冻干在如下反应条件下进行：
‑
70℃预冻2h，0℃冻干48h，真空度＜100pa。
20.其中，在s2中，所述乙醇为无水乙醇，所述上柱液中含有15vol％乙醇。
21.进一步的，所述达托霉素粗粉用去离子水溶解至达托霉素含量为2～3mau/ml。
22.需要说明的是，在s5中，具体的前杂质点d7和后杂质点d8由参比制剂所定义的，参比制剂为注射用达托霉素克必信，具体收集方式为以收集每倍树脂体积量单独收集取样检测，以检测杂质收集情况和收集合格收集液。
23.具体的，前杂质点d7的保留时间约为22.587min，后杂质点d8的保留时间约为23.993min。
24.进一步的，在s1中，所述层析柱为hz
‑
016。
25.进一步的，在s1中，所述层析柱连接分光光度计，在245nm下检测吸光度值，以吸光度值＞30，开始收集，和在吸光度值＜30，停止收集为标准对达托霉素脱盐液进行收集。
26.优选的，在s1中采用顶洗的方式，以去离子水对层析柱进行脱盐洗脱，以提高层析柱的洗脱效率以及收率。
27.进一步的，所述磷酸二氢钠
‑
磷酸氢二钠缓冲液中磷酸二氢钠的含量的30g/l。
28.进一步的，所述预洗液含有20vol％乙醇。
29.进一步的，所述洗脱液含有45vol％乙醇。
30.进一步的，所述预洗液预洗聚合物反向层析柱3bv；
31.所述洗脱液洗脱聚合物反向层析柱5bv。
32.进一步的，所述赶醇为利用截留分子量为300的纳滤膜对达托霉素收集液进行水洗过滤，至纳滤膜出水端的电导率＜100为止。
33.优选的，所述赶醇具体为：用截留分子量为300的纳滤膜对达托霉素收集液浓缩至体积一半后，加水对达托霉素收集液进行水洗并赶醇，在水洗和赶醇过程中，保持加水量与纳滤流量一致，至纳滤膜出水端的电导率小于100，即酒精度为零时，压缩达托霉素收集液至150ml。
34.需要说明的是，在本文中，所用到的试剂，如乙醇、氨水等至少为分析纯。
35.实施例1
36.一种达托霉素的纯化方法，包括如下步骤：
37.s1、取达托霉素粗粉5g用去离子水溶解至200ml，待达托霉素粗粉充分溶解后获得溶解液，所述溶解液中达托霉素的浓度为2mau/ml，将所述溶解液上100mlhz
‑
016树脂填充的层析柱进行脱盐，并将层析柱接入分光光度计，在245nm的波长下检测吸光度值，以吸光度值＞30，开始收集，和在吸光度值＜30，停止收集为标准对达托霉素脱盐液进行收集，获得达托霉素脱盐液；
38.s2、用10％氨水调节达托霉素脱盐液的ph为6.0，加无水乙醇配制成含有15vol％乙醇的上柱液；
39.s3、称取150g磷酸二氢钠和150g磷酸氢二钠溶解于去离子水，充分搅拌溶解后，配制成10l的缓冲盐溶液；
40.s4、取1l的缓冲盐溶液，加入0.25l的无水乙醇配制1.25l的20vol％乙醇的预洗液；剩下的9l缓冲盐溶液，加入7.36l无水乙醇配制成16.36l的45vol％乙醇的洗脱剂，并在所述洗脱剂内加入磷酸调节洗脱剂ph为2.71；
41.s5、取上柱液上柱600mlunips40
‑
300，用预洗液预洗柱3bv，再用洗脱剂进行洗脱5bv，以每倍树脂体积量单独收集取样检测，以检测杂质情况并以收集纯度前杂质点d7＜0.3％，后杂质点d8＜0.3％为标准对达托霉素进行收集，获得达托霉素收集液；
42.s6、将上述达托霉素收集液用小膜机(型号jmd1812
‑
1，大连屹东膜工程设备有限公司，220v，50hz)进行赶醇浓缩，其中小膜机选用截留分子量300的纳滤膜，通过纳滤膜将达托霉素收集液浓缩至体积一半后，加水对达托霉素收集液进行水洗并赶醇，在水洗和赶醇过程中，保持加水量(5l/h)与纳滤流量一致，至纳滤膜出水端的电导率小于100，即酒精度为零时，压缩达托霉素收集液至150ml；将压缩后的达托霉素收集液进行冻干，在前述冻干条件下冻干，获得达托霉素成品粉末。
43.经检测，所述达托霉素成品粉末的纯度为98.22％，收率为72.08％。
44.实施例2
45.一种达托霉素的纯化方法，包括如下步骤：
46.s1、取达托霉素粗粉5g用去离子水溶解至200ml，待达托霉素粗粉充分溶解后获得溶解液，所述溶解液中达托霉素的浓度为2.5mau/ml，将所述溶解液上100mlhz
‑
016树脂填充的层析柱进行脱盐，并将层析柱接入分光光度计，在245nm的波长下检测吸光度值，以吸光度值＞30，开始收集，和在吸光度值＜30，停止收集为标准对达托霉素脱盐液进行收集，获得达托霉素脱盐液；
47.s2、用10％氨水调节达托霉素脱盐液的ph为6.5，加无水乙醇配制成含有15vol％乙醇的上柱液；
48.s3、称取150g磷酸二氢钠和150g磷酸氢二钠溶解于去离子水，充分搅拌溶解后，配制成10l的缓冲盐溶液；
49.s4、取1l的缓冲盐溶液，加入0.25l的无水乙醇配制1.25l的20vol％乙醇的预洗液；剩下的9l缓冲盐溶液，加入7.36l无水乙醇配制成16.36l的45vol％乙醇的洗脱剂，并在所述洗脱剂内加入磷酸调节洗脱剂ph为2.6；
50.s5、取上柱液上柱600mlunips40
‑
300，用预洗液预洗柱3bv，再用洗脱剂进行洗脱5bv，以每倍树脂体积量单独收集取样检测，以检测杂质情况并以收集纯度前杂质点d7＜0.3％，后杂质点d8＜0.3％为标准对达托霉素进行收集，获得达托霉素收集液；
51.s6、将上述达托霉素收集液用小膜机(型号jmd1812
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1，大连屹东膜工程设备有限公司，220v，50hz)进行赶醇浓缩，其中小膜机选用截留分子量300的纳滤膜，通过纳滤膜将达托霉素收集液浓缩至体积一半后，加水对达托霉素收集液进行水洗并赶醇，在水洗和赶醇过程中，保持加水量(5l/h)与纳滤流量一致，至纳滤膜出水端的电导率小于100，即酒精度为零时，压缩达托霉素收集液至150ml；将压缩后的达托霉素收集液进行冻干，在前述冻
干条件下冻干，获得达托霉素成品粉末。
52.经检测，所述达托霉素成品粉末的纯度为96.41％，收率为69.14％。
53.实施例3
54.一种达托霉素的纯化方法，包括如下步骤：
55.s1、取达托霉素粗粉5g用去离子水溶解至200ml，待达托霉素粗粉充分溶解后获得溶解液，所述溶解液中达托霉素的浓度为3mau/ml，将所述溶解液上100mlhz
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016树脂填充的层析柱进行脱盐，并将层析柱接入分光光度计，在245nm的波长下检测吸光度值，以吸光度值＞30，开始收集，和在吸光度值＜30，停止收集为标准对达托霉素脱盐液进行收集，获得达托霉素脱盐液；
56.s2、用10％氨水调节达托霉素脱盐液的ph为6.3，加无水乙醇配制成含有15vol％乙醇的上柱液；
57.s3、称取150g磷酸二氢钠和150g磷酸氢二钠溶解于去离子水，充分搅拌溶解后，配制成10l的缓冲盐溶液；
58.s4、取1l的缓冲盐溶液，加入0.25l的无水乙醇配制1.25l的20vol％乙醇的预洗液；剩下的9l缓冲盐溶液，加入7.36l无水乙醇配制成16.36l的45vol％乙醇的洗脱剂，并在所述洗脱剂内加入磷酸调节洗脱剂ph为2.8；
59.s5、取上柱液上柱600mlunips40
‑
300，用预洗液预洗柱3bv，再用洗脱剂进行洗脱5bv，以每倍树脂体积量单独收集取样检测，以检测杂质情况并以收集纯度前杂质点d7＜0.3％，后杂质点d8＜0.3％为标准对达托霉素进行收集，获得达托霉素收集液；
60.s6、将上述达托霉素收集液用小膜机(型号jmd1812
‑
1，大连屹东膜工程设备有限公司，220v，50hz)进行赶醇浓缩，其中小膜机选用截留分子量300的纳滤膜，通过纳滤膜将达托霉素收集液浓缩至体积一半后，加水对达托霉素收集液进行水洗并赶醇，在水洗和赶醇过程中，保持加水量(5l/h)与纳滤流量一致，至纳滤膜出水端的电导率小于100，即酒精度为零时，压缩达托霉素收集液至150ml；将压缩后的达托霉素收集液进行冻干，在前述冻干条件下冻干，获得达托霉素成品粉末。
61.经检测，所述达托霉素成品粉末的纯度为97.926％，收率为70.12％。
62.检测例1
63.新工艺与现有工艺的对达托霉素产品峰前杂质(d7＜3％)和产品峰后杂质(d8＜3％)的去除率和达托霉素的收率对比。
64.实验方法：
65.新工艺：采用实施例1的达托霉素纯化方法。
66.现有工艺：与实施例1的区别在于，磷酸二氢钠
‑
磷酸氢二钠缓冲液替换为醋酸缓冲液。
67.取达托霉素粗粉进行色谱分析，分别获得产品峰前杂质(d7＜3％)和产品峰后杂质(d8＜3％)的峰面积，并分别对新工艺和现有工艺生产的达托霉素成品粉进行色谱分析，分别获得在两种工艺下的产品峰前杂质(d7＜3％)和产品峰后杂质(d8＜3％)的峰面积，经计算获得杂质峰除去率数据和收率数据，数据如表1所示。
68.表1
[0069][0070][0071]
从表1可以看出，新工艺对峰前杂(产品峰前杂质)和峰后杂(产品峰后杂质)的去除率分别为45.70％和70.52％，相较于现有工艺的8.66％和10.23％具有显著的提升，并且新工艺的收率可达到72.08％，而现有工艺仅有65.35％，即表明本技术所提供的达托霉素的纯化方法，相较于现有工艺(醋酸缓冲液体系)而言，可有效通过去除峰前杂和峰后杂以提高达托霉素产品粉的质量，以及提高达托霉素的收率。
[0072]
综上所述，本发明所提供的达托霉素纯化方法，将含有杂质的达托霉素溶液在ph＝2.6～2.8的磷酸二氢钠的缓冲体系中反应，以通过缓冲体系中的成分与位于达托霉素产品峰前和产品峰后的杂质相结合，改变杂质极性和杂质在聚合物反相层析柱内的吸附速率，从而实现将杂质与达托霉素相分离，提高达托霉素产品粉的质量及收率。
[0073]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。