Lsa-MIR408基因及其在调控生菜产量及种子大小中的应用的制作方法

lsa-mir408基因及其在调控生菜产量及种子大小中的应用
技术领域
1.本发明涉及lsa-mir408基因及其在调控生菜产量及种子大小中的应用。


背景技术：

2.生菜(lactuca sativa l.)为全球消费量最大的叶用蔬菜之一，在世界大多地区被广泛种植。生菜因发生病虫害几率低，农药残留少等特征，满足了目前大众对无公害蔬菜的青睐而深受大众喜爱。近年来，在我国市场对生菜需求量急剧增加，种植面积也不断扩大，生菜产量低，市场供应不足等问题很突出。因此，寻找提高生菜产量的关键基因至关重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种lsa-mir408基因及其在调控生菜产量及种子大小中的应用。
4.本发明提供一种mirna，命名为lsa-mir408，来源于美国大速生菜，如seq id no.1所示。本发明还保护一种rna(lsa-mir408的前体，简称lsa-mir408前体)，如序列表的序列seq id no.3所示。
5.编码所述lsa-mir408的dna分子也属于本发明的保护范围。
6.所述dna分子具体可为如下(a1)或(a2)或(a3)：
7.(a1)seq id no.2所示的dna分子；
8.(a2)在严格条件下与(a1)限定的dna序列杂交且具有相同功能的dna分子；
9.(a3)与(a1)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有相同功能的dna分子。
10.编码所述lsa-mir408前体的dna分子也属于本发明的保护范围。
11.所述dna分子具体可为如下(b1)或(b2)或(b3)：
12.(b1)seq id no.4所示的dna分子；
13.(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna序列杂交且具有相同功能的dna分子；
14.(b3)与(b1)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有相同功能的dna分子。
15.上述严格条件可为用0.1
×
sspe(或0.1
×
ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
16.含有以上任一所述dna分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
17.所述重组载体可为在植物表达载体的多克隆位点或重组位点插入以上任一所述dna分子得到重组质粒。所述重组载体具体可为将植物表达载体pjim19的xbai和xhoi之间的小片段取代为seq id no.5得到的重组质粒。
18.本发明还保护本发明还保护所述lsa-mir408、所述lsa-mir408前体或以上任一所述dna分子的应用，为如下(c1)、(c2)、(c3)或(c4)：
19.(c1)调控植物生长速度；
20.(c2)调控植物产量；
21.(c3)促进植物生长；
22.(c4)提高植物产量。
23.所述调控植物产量具体可体现为调控植物叶片面积和/或叶柄长度和/或种子长度和/或鲜重。所述提高植物产量具体可体现为提高植物叶片面积和/或叶柄长度和/或种子长度和/或鲜重。所述调控植物生长速度具体可体现为调控同一时间植物的叶片面积和/或叶柄长度和/或种子长度和/或鲜重的增加速度。所述促进植物生长具体可体现为同一时间生长的植物叶片面积大和/或叶柄长大和/或种子长度大和/或鲜重大。
24.本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将特异dna分子导入出发植物，得到产量增加的转基因植物；所述特异dna分子为如下(1)-(5)中的任一种：
25.(1)seq id no.2所示的dna分子；
26.(2)seq id no.4所示的dna分子；
27.(3)seq id no.5所示的dna分子；
28.(4)在严格条件下与(1)或(2)或(3)限定的dna序列杂交且具有相同功能的dna分子；
29.(5)与(1)或(2)或(3)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有相同功能的dna分子。
30.本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：将特异dna分子导入出发植物，得到生长速度加快转基因植物；所述特异dna分子为(1)-(5)中的任一种：
31.(1)seq id no.2所示的dna分子；
32.(2)seq id no.4所示的dna分子；
33.(3)seq id no.5所示的dna分子；
34.(4)在严格条件下与(1)或(2)或(3)限定的dna序列杂交且具有相同功能的dna分子；
35.(5)与(1)或(2)或(3)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有相同功能的dna分子。
36.以上任一所述dna分子可通过重组表达载体导入所述出发植物。所述重组表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点或重组位点插入以上任一所述dna分子得到重组质粒。所述重组载体具体可为将植物表达载体pjim19的xbai和xhoi之间的小片段取代为seq id no.5得到的重组质粒。
37.本发明还保护下述任一在植物育种中的应用；
38.(a)以上任一所述方法；
39.(b)所述lsa-mir408；
40.(c)编码所述lsa-mir408的dna分子；
41.(d)lsa-mir408的前体；
42.(e)编码所述lsa-mir408前体的dna分子；
43.(f)以上任一所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
44.所述育种的目的具体可为培育生长速度快和/或产量高的植物。所述产量高具体可体现为植物叶片面积和/或叶柄长度和/或种子长度和/或鲜重的数值大。所述生长速度
快具体可体现为同一时间生长的植物叶片面积大和/或叶柄长大和/或种子长度大和/或鲜重大。
45.以上任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为菊科植物。所述菊科植物具体可为生菜，更具体可为美国大速生菜。
46.本发明利用高通量测序技术对生菜进行了系统地小rna测序，通过基因工程手段将候选基因lsa-mir408过表达到生菜中，观察了生菜的表型，研究结果表明，过表达lsa-mir408可促进生菜营养生长、提高生菜产量及改变生菜种子大小。本发明对于生菜产量提高及生菜育种有重要意义。
附图说明
47.图1为生菜遗传转化过程。a:消毒后播种在ms培养基上的生菜种子；b:7天生菜幼苗子叶；c:愈伤诱导；d:芽诱导；e：生根诱导；f:驯化后的植株。
48.图2为过表达lsa-mir408植株与野生型的表型比较。(a)萌发后12天的过表达株系与野生型；(b)过表达株系与野生型的叶片比较；(c)生长到50天生菜的过表达株系与野生型表型比较；(d)叶柄长度统计分析；(e)生长到50天的生菜鲜重统计。
49.图3为pcr鉴定转基因阳性苗的检测结果。m:dna分子标记；1-18：阳性苗；p:过表达载体，作为阳性对照；wt:野生型生菜dna，作为阴性对照。
50.图4为转基因生菜与野生型生菜种子形态比较。(a)转基因生菜种子与野生型生菜种子的形态比较；(b)转基因生菜种子与野生型生菜种子长度统计分析。
具体实施方式
51.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
52.美国大速生菜：购自北京市农林科学院蔬菜所。
53.植物表达载体pjim19：购自北京全式金生物技术有限公司。
54.农杆菌eha105：京华越洋生物科技有限公司。
55.实施例1、lsa-mir408基因的发现
56.提取美国大速生菜品种的总rna，构建srna测序文库并测序，经过大量序列分析和功能验证，得到lsa-mir408，如seq id no.1所示，其编码序列如seq id no.2所示。lsa-mir408的前体序列如seq id no.3所示，前体序列的编码序列seq id no.4所示。
57.实施例2、lsa-mir408的应用
58.一、过表达载体的构建
59.将植物表达载体pjim19的xbai和xhoi位点间的片段替换为了seq id no.5(在seq id no.4前后各延伸了160bp)所示的dna分子，得到过表达载体(已经测序验证)。
60.二、重组菌的制备
61.将步骤一得到的过表达载体导入农杆菌eha105，得到重组菌。
62.三、生菜遗传转化
63.1、取美国大速生菜的种子于2ml离心管，用75％乙醇消毒45s，之后快速用无菌水清洗2-3遍。
64.2、加入15％的次氯酸钠，置于涡旋仪，慢速涡旋清洗20min。
65.3、用无菌水清洗种子5-6遍。
66.4、用灭过菌的镊子将种子从离心管夹出种植于ms基本培养基上。
67.ms基本培养基：ms 4.4g/l 蔗糖30g/l 琼脂粉8g/l。
68.5、种子置于光照培养箱培养7d(光照16h，黑暗8h光照强度2000lux)。
69.6、用手术刀切取7d生菜幼苗子叶，每个叶片横向切两刀，置于ms1培养基培养24h。
70.ms1培养基：ms基本培养基 0.2mg/lnaa 0.2mg/l 6-ba。
71.7、将步骤二制备的重组菌摇至od600在0.6-0.8之间，5000rpm离心10min，倒掉上清液，用ms0培养基悬浮菌体，调整od600于0.6-0.8之间。
72.ms0培养基：ms 4.4g/l 蔗糖30g/l。
73.8、用步骤7准备好的菌液浸泡生菜子叶30min，每间隔5min摇晃几次。
74.9、侵染结束后，将生菜子叶用镊子夹出，用滤纸擦干，置于ms1培养基暗培养12h。
75.10、暗培养结束后，将生菜子叶转移至ms2愈伤及芽诱导培养基，于组培室正常培养，约10d可见愈伤形成，15-20d可见芽的出现。
76.ms2愈伤及芽诱导培养基：ms基本培养基 0.2mg/l naa 0.2mg/l 6-ba 300mg/l特美汀。
77.11、待芽长出约1cm左右时，用手术刀切下，转移至ms3生根培养基诱导生根，约15d左右可见根出现。
78.ms3生根培养基：1/2ms基本培养基 300mg/l特美汀。
79.12、根长到3-5cm时，将组培苗轻轻从组培瓶移出，用蒸馏水清洗根部，无培养基残留，之后将苗移栽在混合营养土中。(营养土:蛭石：珍珠岩＝9:3:1)。
80.13、待植物长到一定程度，取少量叶片提取基因组dna，采用引物hyg-f和引物hyg-r组成的引物对进行pcr阳性苗检测，阳性苗的扩增产物大小约为400bp。
81.hyg-f：5
’-
tacacaggccatcggtccaga-3’；
82.hyg-r：5
’-
taggagggcgtggatatgtc-3’。
83.结果见图3。
84.上述遗传转化过程见图1。
85.将经pcr鉴定为阳性苗的t0代转基因植株自交得到t1代植株，将t1代植株自交得到t2代植株，将t2代植株自交得到t3代转基因株系用于后续实验。
86.四、过表达植株表型检测
87.待测植株：野生型美国大速生菜(wt)，t3代转基因株系(oe-2、oe-5、oe-6)。
88.每个株系检测5个植株。
89.将待测植株种子播种后，在20℃、光照16h/黑暗8h，光照强度约200μmol
·
m-2
·
s-1的条件下培养，观察植株表型。结果如图2所示。结果显示，过表达lsa-mir408促进生菜营养生长、提高生菜产量及改变生菜种子大小，与野生型相比，过表达lsa-mir408的转基因生菜叶片增大，叶柄伸长，三个转基因株系(oe-2，oe-5，oe-6)叶柄长度分别增加了15.7％，11.7％和12.9％，鲜重分别提高了27.1％，26.7％和28.3％，种子长度分别增加了8.7％，
9.3％和10.0％。