用于药物开发研究的培养器具的制作方法

本发明涉及专门用于药物开发研究的、细胞的立体结构体的培养器具。

背景技术

以往，已知一种技术，通过将细胞聚集体(球状体)临时固定在排列为剑山状的针上，制造细胞的立体结构体(专利文献1)。其特征在于，根据该技术，能够只使细胞立体化。

以前，众所周知，球状体培养的细胞活性比普通的平面培养高，但在上述技术中，立体化后的细胞结构体使细胞三维化，所以代谢活性提高，另外细胞直接与培养液接触，所以营养气体交换效率提高。

因此，已经尝试将细胞的立体结构体应用在药物的毒性测试等中，而能够检测出在其它的人肝细胞培养法中不能检测出的药物的人特异性肝毒性(非专利文献1)。另外，针对由心肌细胞构建的立体结构体，也存在作为脉动分析工具而可利用的可能性。

但是，将球状体刺为剑山需要专门的装置(生物3D打印机)，该装置价格昂贵，所以难以得到。

在药物开发研究中，不必使用处理大量球状体的生物3D打印机(规格大)，因为作为球状体的个数，只要九个球状体就可以充分地分析药理活性。

另一方面，为了进行药物开发，需要一次性处理大量的检体。因此，需要能够利用少量的细胞大规模地进行分析的筛选系统。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：专利(日本)第4517125号

非专利文献

非专利文献1：Kizawa et，al BBR 2017

技术实现要素：

发明所要解决的技术问题

为了进行药物开发，需要能够利用少量的细胞大规模进行分析的筛选系统。另外，作为药物开发测试的用途，需要简单且廉价的细胞结构体的制作方法。

用于解决技术问题的技术方案

本发明的发明者为了解决上述问题进行了专心的研究，其结果为，通过使用使底面的中央部为凸状、在中央部与侧壁之间形成有凹部的细胞收纳容器，成功解决上述问题，直至完成本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种细胞培养器具，具有细胞收纳容器、以及在基板配置有针状体的剑山状部件，

所述细胞收纳容器的底面中央部形成凸部，该中央部与侧壁之间形成凹部，并且在该凹部的底面设有所述针状体贯通的贯通孔，

所述针状体与所述贯通孔的位置对应而排列，

使所述针状体的前端侧的一部分从所述细胞收纳容器的底面侧或者上表面侧贯通贯通孔来配置所述剑山状部件。

(2)一种细胞培养器具，具有细胞收纳容器、以及在基板配置有针状体的剑山状部件，

所述细胞收纳容器的底面中央部形成凸部，在该中央部与侧壁之间形成凹部，

所述针状体与所述凹部的底面的位置对应而排列，

使所述剑山状部件从所述细胞收纳容器的上表面侧进行配置，以使所述针状体的前端朝向所述凹部的底面。

(3)如(1)或者(2)所述的细胞培养器具，所述细胞收纳容器及所述剑山状部件以阵列状排列多个。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的细胞培养器具，细胞收纳容器进行过细胞非粘附涂层处理。

(5)一种细胞结构体的制造方法，其特征在于，在(1)～(4)中任一项所述的细胞培养器具的细胞收纳容器中投入细胞悬浮液后，以细胞环绕于针状体的方式使细胞聚集。

(6)如(5)所述的方法，细胞为肝细胞或者心肌细胞。

(7)一种细胞测试方法，其特征在于，使被检物质与通过(5)或者(6)所述的方法制造出的细胞结构体接触，测试对该细胞的毒性或者该细胞的代谢活性。

(8)如(7)所述的方法，细胞为肝细胞或者心肌细胞。

(9)一种细胞测试装置，包括(1)～(4)中任一项所述的细胞培养器具。

(10)如(9)所述的装置，细胞为肝细胞或者心肌细胞。

发明的效果

根据本发明，能够进行简单且廉价的细胞结构体的制造，由此，能够进行细胞毒性等药物开发测试。

附图说明

图1是表示本发明的细胞培养器具的一个方式的图。

图2是本发明的细胞培养器具的中央剖视图。

图3是表示细胞环绕于针状体、并形成球状体的方式的图。

图4是表示使用本发明的细胞培养器具来制造细胞结构体的方式的图。

图5是表示使细胞收纳容器在针状体的长度方向上滑动的方式的图。

图6是表示细胞结构体在针状体的前端部形成为环状并保持的方式的图。

图7是表示使剑山状部件的针状体的前端从细胞收纳容器的上表面朝向凹部进行配置的方式的图。

图8是表示使多个本发明的细胞培养器具配置为阵列状的方式的图。

图9是表示包括本发明的细胞培养器具的细胞测试装置的图。

图10是通过实施例表示制造细胞结构体的例子的图。

具体实施方式

本发明提供一种细胞培养器具，该细胞培养器具具有：细胞收纳容器、以及在基板配置有针状体的剑山状部件，

所述细胞收纳容器的底面中央部形成凸部，该中央部与侧壁之间形成凹部，并且在该凹部的底面设有所述针状体贯通的贯通孔，

所述针状体与所述贯通孔的位置对应而排列，

使所述针状体的前端侧的一部分从所述细胞收纳容器的底面侧或者上表面侧贯通贯通孔来配置所述剑山状部件。

图1表示本发明的细胞培养器具的一个方式。

图1A是本发明的细胞培养器具的立体图，细胞培养器具1具有：细胞收纳容器10、以及在基板20配置有针状体21的剑山状部件2。

细胞收纳容器10的底面的中央形成凸部11，在与侧壁12之间形成凹部13。因为底面中央部为凸部、在与侧壁之间形成凹部的形状与所谓的墨西哥草帽相似，所以，在本说明书中，将细胞收纳容器10也称为“墨西哥草帽型培养容器”或者简单称为“草帽型培养容器”。

图1B是从上方观察细胞培养器具10的俯视图，在该方式中，在基板20配置10根针状体21，使针状体21贯通细胞收纳容器10的贯通孔14(后面叙述)(针状体21的配置对应于贯通孔14的位置)。

图2是细胞培养器具1的中央剖视图。在图2A中，在细胞收纳容器10的底面13设有剑山状部件2的针状体21贯通的贯通孔14。因此，针状体21例如在基板20的法线方向且与贯通孔14的位置对应地配置在基板20上。图2B表示剑山状部件2从细胞收纳容器10的底面部使针状体21的一部分在贯通孔14中贯通的方式。

在本发明中，细胞收纳容器10的凹部13形成收纳细胞的细胞收纳部，当在凹部13投下细胞悬浮液时，细胞自然地聚集而环绕于针状体，并且形成球状体。

图3是细胞环绕于针状体并且形成球状体的方式的示意图。

图3A是表示不存在针状体21时的球状体形成的方式的图，细胞悬浮液31中零散的细胞32自然地聚集，形成球状体33。在本发明中，如图3B所示，通过使用针状体21，细胞32环绕于针状体21并且形成球状体33。针状体21例如以等间隔排列有多根，所以，形成的球状体33彼此融合，制造出细胞结构体34。

在此，在本发明中使用的细胞的种类未特别限定，可以使用形成球状体的任意的细胞。作为形成球状体的细胞，可以例举干细胞(ES细胞、脐带血来源细胞、未分化间充质干细胞、成体间充质干细胞等)等未分化细胞或者其分化细胞。上述细胞来源的组织例如可以例举关节软骨、骨、脂肪组织、韧带、肌腱、牙齿、耳廓、鼻子、肝脏、胰腺、血管、神经、心脏等，其中优选肝脏细胞、心肌细胞等。另外，球状体不一定作为单一种类的细胞聚集体而形成，只要形成球状体，也可以由多种细胞种(例如混合有肝脏细胞与血管内皮细胞的细胞种)形成。

另外，培养直至形成球状体及细胞结构体的培养时间根据细胞培养器具1的大小而不同，在一般的培养条件(例如37℃，5％的CO2环境气体下)下大概为2日～4日。

作为针状体21的原材料，可以使用不锈钢制、聚丙烯制、尼龙制等材料，但不限于此。

另外，细胞收纳容器10优选由氟等进行过细胞非粘附涂层(例如聚二甲基硅氧烷制)。但是，除了进行氟加工以外，也可以使用进行了聚甲基丙烯酸羟乙酯聚合物加工的材料，此外，也可以使用丙烯酸树脂、ABS树脂、聚酯树脂、聚碳酸酯树脂、聚丙烯、聚乙烯、聚缩醛、聚醚醚酮、尼龙制的材料等。

图4表示基于图3B中说明的细胞结构体34的形成机制，使用本发明的细胞培养器具1制造细胞结构体34的方式。

首先，将培养液浸泡在比本发明的细胞培养器具1大的容器40中，并在其中放置细胞培养器具1。培养器具1为剑山状部件2的针状体21的前端侧的一部分贯通细胞收纳容器10的贯通孔14的方式。当在细胞收纳容器10的凹部13中投入细胞悬浮液31时，细胞环绕于针状体21且形成球状体，并且球状体彼此融合而形成细胞结构体34。在图1及图4中，细胞收纳容器10的外周形状为圆形，凹部13将底面中央部的凸部11的周围包围成圆形状。因此，制造出的细胞结构体的形状为环状。

在本发明中，细胞收纳容器10的外周形状不限于圆形，可以为四边形、五边形、六边形、八边形等多边形。另外，针状体21的根数(贯通孔14的数量)也未限定，例如可以为2根～20根。在细胞收纳容器10为圆形的情况下，其直径及凹部13的直径也未特别限定，例如可以为0.6mm～30.0mm。

图5表示在本发明的细胞培养器具1中使细胞收纳容器10在针状体21的长度方向上滑动的方式。

如图5A所示，当培养细胞时，使针状体21的前端侧的一部分在贯通孔14中略微突出地配置细胞收纳容器10。在构建了细胞结构体34后，使细胞收纳容器10向下方(基板20侧)滑动(图5B)。由此，细胞结构体34在针状体21的前端部形成为环状并被保持(图6)。这样，通过使细胞收纳容器10向下方滑动，细胞结构体34在细胞收纳容器10的设置面积减小，能够立即对细胞结构体34进行分析。例如在图6所示的细胞结构体34的状态下，在细胞收纳容器10及/或培养容器40内投入被检物质后，能够测试细胞结构体34的活性及动向、或者对细胞结构体34的毒性等。

图1、图2等是使剑山状部件2的针状体21从细胞收纳容器10的底面侧贯通凹部13的方式，而图7是使剑山状部件2的针状体21的前端从细胞收纳容器10的上表面朝向凹部13进行配置的方式。在该情况下，不需要设置贯通孔14，但是否设置贯通孔14则是任意的。但是，为了使针状体21固定，也可以是在细胞收纳容器10的凹部13设置未贯通程度的孔(未图示)、在该孔中插入针状体21的方式。如图7A所示，在将剑山状部件2与图1的方式反向配置来投入细胞悬浮液、形成球状体、并使细胞结构体34形成后，将剑山状部件2的方向恢复为原来的方向(向上)，由此能够形成为在针状体21的前端部保持有细胞结构体34的方式。需要说明的是，在该情况下可以除去基板20。

图8是表示将本发明的细胞培养器具1以阵列状配置多个的方式的图。

在图8中，细胞收纳容器10的形状为方形，针状体21在四个位置(四角)的凹部贯通。这样，通过使本发明的多个细胞培养器具1为阵列状配置，能够大量制造细胞结构体34，可以一次进行各种测试。需要说明的是，阵列状的配置可以一体成型。

图9是表示包括本发明的细胞培养器具1的细胞测试装置9的图，在细胞测试装置9中，将细胞培养器具1设置在基板90，并且设置有细胞培养液供给部91、被检物质供给部92。细胞测试装置9中，也可以将电极(未图示)与针状体21连接。

由此，能够三维测试细胞结构体的代谢活性、及心肌细胞的脉动等。

因此，本发明提供一种细胞测试方法，其特征在于，使被检物质与细胞结构体接触，测试对该细胞的毒性或者该细胞的代谢活性。

被检物质可以例示为天然或者人工合成的各种肽、蛋白质(包括酶及抗体)、核酸(多核苷酸(DNA、RNA)、低聚核苷酸(siRNA等)、肽核酸(PNA)等)、低分子化合物、或高分子有机化合物等。

另外所谓的“接触”，是指使被检物质与本发明的细胞结构体接触，可以例举如下，即，将被检物质投入含有细胞结构体的培养容器中、以及在含有被检物质的培养基中培养细胞结构体等。

实施例

下面，通过实施例进一步具体地说明本发明。但是，本发明的范围并非由上述实施例来限定。

[第一实施例]

方法

在由聚二甲基硅氧烷(PDMS)树脂制作的草帽型容器(直径为4mm)中设置4根针(0.17mm)(图10A)，投入细胞悬浮液(细胞数：5×10⁶个)(图10B)。细胞使用人成纤维细胞。

三天后，显示出细胞聚集并环绕针的样子(图10C)。

通过使草帽型容器向下滑动，环状的细胞结构体保持在针的前端部(图10D、图E)。在本发明中，在该状态下可以用于药理测试，但如图10F所示，也可以将细胞结构体从针上取下来进行药理测试，或者也可以制作病理组织。

附图标记说明

1 本发明的细胞培养器具；2 剑山状部件；9 细胞测试装置；10 细胞收纳容器；11 凸部；12 侧壁；13 凹部；14 贯通孔；20 基板；21 针状体；31 细胞悬浮液；32 细胞；33 球状体；34 细胞结构体；40 培养容器；90 基板；91 细胞培养液供给部；92 被检物质供给部。