香豆素类化合物在苹果树腐烂病防治中的应用的制作方法

1.本发明属于苹果病害防治技术领域，具体涉及香豆素类化合物在苹果树腐烂病防治中的应用。


背景技术：

2.苹果树腐烂病俗称“烂皮病”，是一种危害苹果枝干的病害，主要病原菌为苹果壳囊孢(cytospora mali)。苹果壳囊孢是一种典型的弱致病菌，其发病程度由树体自身抗性水平决定。苹果树腐烂病发生严重时可造成主要枝干大面积腐烂，整树枯死，甚至造成毁园，因此被称为“苹果树癌症”。腐烂病的发生严重影响苹果产量和质量。目前，苹果树腐烂病防治主要以病斑刮除结合涂抹农药、药剂喷淋枝干等的防治技术，导致药物在植物体内残留，可能造成果品和环境污染。因此，开发环境友好的新型药物，对苹果树腐烂病的防治具有重要意义。
3.植物在与病原菌对抗中，进化出先天免疫系统。除了病程相关蛋白等抗菌蛋白外，植物还合成小分子次级代谢物用以限制病原菌侵染。香豆素类次级代谢物是一类植物重要次生代谢产物，在植物防卫反应中起到重要的作用。如东莨菪内酯在体外可有效抑制病原菌菌丝的生长，帮助植物抵御病原菌侵染。香豆素是广泛存在于植物中的一种以苯并吡喃酮为骨架的内脂类化合物，具有抗癌、抑菌、抗氧化等重要的生物活性。香豆素作为天然植物内源代谢物不仅具有抗菌活性，还具有环境友好的优点，可作为开发新型抗菌药物的基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供香豆素类化合物在苹果树腐烂病防治中的应用，可有效提高苹果树腐烂病的防治效果。
5.本发明所采用的技术方案是，香豆素类化合物在苹果树腐烂病防治中的应用。
6.本发明的特点还在于，
7.香豆素类化合物为香豆素、4
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羟基香豆素、7
‑
羟基香豆素和7
‑
甲氧基香豆素中的任意一种。
8.香豆素类化合物能抑制苹果树腐烂病菌菌丝的生长。
9.本发明所采用的另一技术方案是，治疗或预防苹果树腐烂病的药物，药物中含有香豆素类化合物。
10.本发明的有益效果是：本发明提供的香豆素、4
‑
羟基香豆素、7
‑
羟基香豆素和7
‑
甲氧基香豆素在苹果树腐烂病防治中的应用，为树体抵抗苹果腐烂病提供了新的资源。4
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羟基香豆素不仅直接抑制腐烂菌的生长，增强树体抗性。同时，4
‑
羟基香豆素可以进一步激活植物病程相关蛋白的表达，增强植物自身对病原菌的免疫力。
附图说明
11.图1为本发明实施例4中4
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羟基香豆素体外抑制腐烂菌生长结果；其中，a为空白对照组，b为1μg/g 4
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羟基香豆素组，c为10μg/g4
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羟基香豆素组，d为15μg/g 4
‑
羟基香豆素组；
12.图2为本发明实施例3中7
‑
羟基香豆素体外抑制腐烂菌生长结果；其中，a为空白对照组，b为1μg/g 7
‑
羟基香豆素组，c为10μg/g7
‑
羟基香豆素组，d为15μg/g 7
‑
羟基香豆素组；
13.图3为本发明实施例2中7
‑
甲氧基香豆素体外抑制腐烂菌生长结果；其中，a为空白对照组，b为10μg/g 7
‑
甲氧基香豆素组，c为50μg/g 7
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甲氧基香豆素组，d为100μg/g 7
‑
甲氧基香豆素组。
14.图4为本发明实施例1中香豆素体外抑制腐烂菌生长结果；其中，a为空白对照组，b为50μg/g香豆素组，c为100μg/g香豆素组，d为200μg/g香豆素组；
15.图5为本发明实施例5中外源喷施4
‑
羟基香豆素后苹果树腐烂病发病程度；以清水处理组为对照，病斑长度代表病斑大小，“**：p<0.05”；
16.图6为本发明实施例6中4
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羟基香豆素对苹果树体病程相关蛋白的诱导作用结果；“*:p<0.05”。
具体实施方式
17.下面结合具体实施方式和附图对本发明做进一步的详细说明。
18.本发明通过实验证明香豆素、4
‑
羟基香豆素、7
‑
羟基香豆素和7
‑
甲氧基香豆素能够显著抑制苹果树腐烂病菌菌丝的生长，香豆素类化合物作为植物内源次生代谢物，对环境和人体无害，具有绿色无公害的优点，且结构简单，较易合成，使用成本较低。同时，可有效提高苹果树腐烂病的防治效果。
19.本发明通过试验证明，4
‑
羟基香豆素还可诱导苹果树内源性病程相关蛋白的表达，提高内源性抗菌蛋白(如pr2，pr3和pr4)的表达水平，增强树体先天性免疫防御力以抵御病原菌的侵染。基于此，本发明提供了香豆素，4
‑
羟基香豆素，7
‑
羟基香豆素和7
‑
甲氧基香豆素用于防治苹果树腐烂病的应用。
20.下述实施例中所使用的实验方法在无特殊备注说明的情况下，均为常规实验方法。所用的仪器、试剂等，均可从商业途径获得。实验案例中的数据统计分析均通过spss 22.0(美国芝加哥spss公司)完成。
21.实施例1体外香豆素对腐烂病菌菌丝生长的抑制活性
22.1、所选菌种为苹果壳囊孢(cytospora mali)由西北农林科技大学植物保护学院真菌实验室提供。在马铃薯固体培养基活化腐烂病菌，以作备用。
23.2、将上述2mg/ml的香豆素母液加入马铃薯固体培养基中，分别配制成含有50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml香豆素的马铃薯固体培养基。同时，以加入等体积dmso的马铃薯固体培养基作为对照。将等体积的两种马铃薯培养基倒入培养皿，每组三个重复，冷却凝固后备用。
24.3、用5mm打孔器将活化好的腐烂病菌制成大小均匀的菌饼，并接种于上述马铃薯固体培养基平板上。观察菌丝在含有不同浓度香豆素的培养皿与空白培养皿上生长菌落大
小的变化。菌落大小的结果表明，香豆素可有效抑制腐烂病菌的生长，具有良好的抑菌活性。同时，如图4所示，随着香豆素浓度的升高，菌丝生长受到的抑制作用越明显，菌落越小。当香豆素浓度达到10μg/g时，即可对腐烂菌达到50％以上的抑制效果。
25.4、进一步通过计算香豆素的抑菌标准曲线得出，腐烂菌菌丝生长和香豆素含量成显著负相关关系，表明香豆素的抑菌活性具有剂量依赖效应。同时，通过抑菌标准曲线得出香豆素的ec
50
为107.7μg/g。结果说明，香豆素具有良好的植物源抗菌药物开发价值。
26.实施例2体外香豆素衍生物，7
‑
甲氧基香豆素对腐烂病菌菌丝生长的抑制活性
27.1、选取香豆素衍生物7
‑
甲氧基香豆素，进一步验证7
‑
甲氧基香豆素的体外抑菌活性。按上述方法，分别配置含有10μg/ml、50μg/ml和100μg/ml 7
‑
甲氧基香豆素的马铃薯固体培养基，同样以加入等体积dmso的马铃薯固体培养基做对照。
28.2、采用上述相同方法，将大小均匀的腐烂病菌菌饼接种于配置好的马铃薯固体培养基中央，观察菌丝生长状况。实验结果显示，7
‑
甲氧基香豆素具有较好的抑制腐烂菌生长效果。如图3所示，随着培养基中7
‑
甲氧基香豆素浓度的升高，腐烂菌的菌落大小明显减小，表明腐烂菌的生长受到抑制。
29.3、通过计算7
‑
甲氧基香豆素的抑菌标准曲线得出，腐烂菌菌落大小和7
‑
甲氧基香豆素含量成显著负相关关系，即7
‑
甲氧基香豆素的抑菌活性同样具有剂量效应。计算抑菌标准曲线后得出，7
‑
甲氧基香豆素的ec50为87.2μg/g。结果说明，7
‑
甲氧基香豆素具有良好的植物源抗菌药物开发价值。
30.实施例3体外香豆素衍生物，7
‑
羟基香豆素对腐烂病菌菌丝生长的抑制活性
31.1、选取香豆素衍生物7
‑
羟基香豆素，验证7
‑
羟基香豆素的体外抑菌活性。按上述方法，分别配置含有1μg/ml、10μg/ml和15μg/ml7
‑
羟基香豆素的马铃薯固体培养基，同样以加入等体积dmso的马铃薯固体培养基为对照。
32.2、采用上述相同方法，进一步将大小均匀的腐烂病菌菌饼接种于配置好的马铃薯固体培养基中央，观察菌丝生长状况。实验结果显示，7
‑
羟基香豆素具有较好的抑制腐烂菌生长效果。如图2所示，随着培养基中7
‑
羟基香豆素浓度的升高，腐烂菌的菌落大小明显减小，表明腐烂菌的生长受到抑制。
33.3、通过计算7
‑
羟基香豆素的抑菌标准曲线得出，腐烂菌菌落大小和7
‑
羟基香豆素含量成显著负相关关系，即7
‑
羟基香豆素的抑菌活性同样具有剂量效应。计算抑菌标准曲线后得出，7
‑
羟基香豆素的ec50为14.12μg/g。结果同样说明，7
‑
羟基香豆素具有良好的植物源抗菌药物开发价值。
34.实施例4体外香豆素衍生物，4
‑
羟基香豆素对腐烂病菌菌丝生长的抑制活性
35.1、选取香豆素衍生物4
‑
羟基香豆素，进一步验证4
‑
羟基香豆素的体外抑菌活性。按上述方法，分别配置含有1μg/ml、10μg/ml和15μg/ml 4
‑
羟基香豆素的马铃薯固体培养基，同样以加入等体积dmso的马铃薯固体培养基为对照。
36.2、采用上述相同方法，进一步将大小均匀的腐烂病菌菌饼接种于配置好的马铃薯固体培养基中央，观察菌丝生长状况。实验结果显示，4
‑
羟基香豆素具有较好的抑制腐烂菌生长效果。如图1所示，随着培养基中4
‑
羟基香豆素浓度的升高，腐烂菌的菌落大小明显减小，表明腐烂菌的生长受到抑制。
37.3、通过计算4
‑
羟基香豆素的抑菌标准曲线得出，腐烂菌菌落大小和4
‑
羟基香豆素
含量呈显著负相关关系，即4
‑
羟基香豆素抑菌活性同样具有剂量效应。计算抑菌标准曲线后得出，4
‑
羟基香豆素的ec
50
为9.85μg/g。结果说明，相较于其他三种香豆素类化合物，4
‑
羟基香豆素对腐烂菌抑制活性最强，具有更好的植物源抗菌药物开发价值。
38.表1为本发明实施例1
‑
4中香豆素、4
‑
羟基香豆素、7
‑
羟基香豆素和7
‑
甲氧基香豆素抑菌标准曲线及相应化合物的ec
50
；“r2>0.95”。
39.表1实施例1
‑
4中香豆素类化合物抑菌标准曲线
[0040][0041]
实施例5外源喷施4
‑
羟基香豆素影响苹果树腐烂病的发病程度
[0042]
1、田间选取5棵长势一致的苹果树，品种为富士。
[0043]
2、将20mg 4
‑
羟基香豆素溶解于10ml dmso中，配置成2mg/ml的母液做备用。将母液加入1l无菌水中，并加入1ml的吐温20，得到4
‑
羟基香豆素喷施溶液。对苹果树2年生枝条分别喷施20μg/ml的4羟基香豆素溶液和不含4
‑
羟基香豆素的水溶液作为对照。每次处理间隔3天，共三次。
[0044]
3、对上述处理后的三组苹果树枝条进行离体接种，观察每组枝条上腐烂病斑大小差异。接种方法为打孔有伤接种。如图5所示，接种结果显示，20μg/ml 4
‑
羟基香豆素溶液处理的枝条腐烂病斑大小明显小于水溶液处理的枝条，4
‑
羟基香豆素显著增强树体对腐烂病菌的抗性。
[0045]
实施例6外源喷施4
‑
羟基香豆素提高苹果树体病程相关蛋白基因的表达水平
[0046]
1、收集外源喷施20μg/ml 4
‑
羟基香豆素的枝条韧皮部，
‑
80℃保存备用。通过液氮研磨法将收集样品研磨成均匀粉末状，采用rneasy试剂盒(艾德莱)提取rna，rna提取按照产品说明书进行(该方法利用dna去除柱去除dna，保证最终提取物只存在rna)，rna在
‑
80℃下储存。
[0047]
2、将提取后的rna样品直接用于反转录rt
‑
pcr，利用quantitec逆转录试剂盒(takara)将rna生成第一链cdna(按照产品说明书进行)，将cdna在
‑
20℃下储存。rt
‑
pcr扩增反应为25μl体系；rt
‑
pcr反应条件包括：25℃孵育10分钟，42℃孵育15分钟，85℃加热5秒，最终获得基因组cdna。
[0048]
3、以反转录rt
‑
pcr后获得的cdna样品为模板，通过sybr@green方法测定苹果树多种合成病程相关蛋白的基因的表达水平，以actin基因作为内参基因。所用引物具体信息见表2；
[0049]
表2引物信息
[0050]
[0051][0052]
实验结果表明，相较于清水处理后的苹果树体，对苹果树体喷施外源4
‑
羟基香豆素后，可进一步激活苹果树体内合成病程相关蛋白基因(pr2、pr3和pr4)的表达。定量结果显示，在经过4羟基香豆素处理后的枝条中，如图6所示，病程相关蛋白pr2，pr3和pr4的表达量分别提高了3.46、3.12和4.22倍。表明，外源喷施4羟基香豆素可激活植物自身免疫相关反应，增强树体抗性。