一种文冠果苗再生体系培养基组合及培养方法与流程

1.本发明属于文冠果培育技术领域，涉及一组用于文冠果高效再生体系的培养基配方及培养方法。


背景技术：

2.文冠果，无患子科、文冠果属，中国特有树种，是中国主要木本油料树种之一、列入国家储备林树种之一、“三北”地区重要的乡土生态经济树种。落叶灌木或小乔木，高可达5米；蒴果长达6厘米；种子黑色而有光泽。春季开花，秋初结果。文冠果喜阳，耐半阴，对土壤适应性很强，耐瘠薄、耐盐碱，抗寒能力强，
‑
41.4℃安全越冬；抗旱能力极强，在年降雨量仅150毫米的地区也有散生树木，但文冠果不耐涝、怕风，在排水不好的低洼地区、重盐碱地和未固定沙地不宜栽植，是中国特有的一种食用油料树种。
3.文冠果主要用种子和扦插繁殖，但自然环境下文冠果种子遗传性状不稳定，不利于保持亲本的性状；同时自然环境下文冠果插条生根率较低，扦插材料受季节影响较大，幼苗成活困难。文冠果苗难以快速大量培育限制了文冠果的种植推广。通过对文冠果苗组培快繁技术的研究，可从源头解决文冠果培育及推广困难。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一组文冠果高效再生体系的培养基配方及培养方法，本发明在ms培养基的基础上适当调整，发明了文冠果高效再生体系的培养基配方，包括文冠果诱导愈伤培养基、文冠果愈伤继代培养基、文冠果生芽培养基、文冠果生根培养基，对文冠果进行组织培养，通过文冠果茎段诱导愈伤组织、愈伤继代培养，经过2
‑
3周的培养，愈伤组织增殖系数可达到5.0，可在短时间大批量培养文冠果幼苗，解决了文冠果育苗过程复杂、培养周期长，不可大批量生产的问题。本发明的配方使文冠果繁殖力更强，增殖系数提高，从而年产量增加。
5.本发明第一方面提供了一种文冠果苗再生体系培养基组合，所述培养基组合包括诱导愈伤培养基、生芽培养基和生根培养基；
6.所述诱导愈伤培养基以ms基础培养基为基础培养基，所述诱导愈伤培养基包括0.5
‑
2.0mg/lzt、0.1
‑
0.8mg/liba和300
‑
700mg/l水解酪蛋白；
7.所述生芽培养基以ms基础培养基为基础培养基，所述生芽培养基包括0.5
‑
2.0mg/lkt、0.1
‑
0.4mg/liba和0.2
‑
0.8mg/lga3；
8.所述生根培养基以1/2ms基础培养基为基础培养基，所述生根培养基包括0.1
‑
0.5mg/lnaa和0.5
‑
2.0mg/liba。
9.在一些实施方式中，所述ms基础培养基中还包括：1900mg/l硝酸钾、332mg/l氯化钙、1650mg/l硝酸铵、180.7mg/l硫酸镁、170mg/l磷酸二氢钾、0.025mg/l氯化钴、0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、15.1mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.83mg/l碘化钾、15.12mg/硫酸亚铁、37.3mg/l乙二胺四乙酸二钠、2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.1mg/
lvb1、0.5mg/l烟酸、0.5mg/lvb6。
10.在一些实施方式中，所述1/2ms基础培养基中还包括：950mg/l硝酸钾、332mg/l氯化钙、825mg/l硝酸铵、90.35mg/l硫酸镁、85mg/l磷酸二氢钾、0.025mg/l氯化钴、0.025mg/l硫酸铜、6.2mg/l硼酸、15.1mg/l硫酸锰、0.25mg/l钼酸钠、8.6mg/l硫酸锌、0.83mg/l碘化钾、15.12mg/硫酸亚铁、37.3mg/l乙二胺四乙酸二钠、2.0mg/l甘氨酸、100mg/l肌醇、0.1mg/lvb1、0.5mg/l烟酸、0.5mg/lvb6。
11.在一些实施方式中，所述诱导愈伤培养基还包括6
‑
8g琼脂/l和28
‑
32g/l蔗糖，ph为5.5
‑
6.5。
12.在一些实施方式中，所述诱导愈伤培养基包括0.8
‑
1.2mg/lzt、0.4
‑
0.6mg/liba和450
‑
550mg/l水解酪蛋白。
13.在一些实施方式中，所述诱导愈伤培养基包括1.0mg/lzt、0.5mg/liba和500mg/l水解酪蛋白。
14.在一些实施方式中，所述生芽培养基还包括6
‑
8g琼脂/l和28
‑
32g/l蔗糖，ph为5.5
‑
6.5。
15.在一些实施方式中，所述生芽培养基包括0.8
‑
1.2mg/lkt、0.16
‑
0.24mg/liba和0.4
‑
0.6mg/lga3。
16.在一些实施方式中，所述生芽培养基包括1.0mg/lkt、0.2mg/liba和0.5mg/lga3。
17.在一些实施方式中，所述生根培养基还包括6
‑
8g琼脂/l和28
‑
32g/l蔗糖，ph为5.5
‑
6.5。
18.在一些实施方式中，所述生根培养基包括0.16
‑
0.24mg/lnaa和0.8
‑
1.2mg/liba。
19.在一些实施方式中，所述生根培养基包括0.2mg/lnaa和1.0mg/liba。
20.在一些实施方式中，所述培养基组合还包括愈伤继代培养基，所述愈伤继代培养基以ms基础培养基为基础培养基，所述愈伤继代培养基包括0.3
‑
1.0mg/l6
‑
ba和0.06
‑
0.5mg/lnaa。
21.在一些实施方式中，所述愈伤继代培养基还包括6
‑
8g琼脂/l和28
‑
32g/l蔗糖，ph为5.5
‑
6.5。
22.在一些实施方式中，所述愈伤继代培养基包括0.4
‑
0.6mg/l6
‑
ba和0.08
‑
0.12mg/lnaa。
23.在一些实施方式中，所述愈伤继代培养基包括0.5mg/l6
‑
ba和0.1mg/lnaa。
24.本发明第二方面提供了一种文冠果苗再生体系培养方法，所述培养方法包括如下步骤：
25.s1：愈伤组织诱导
26.将文冠果外植体接种到本发明第一方面所述的文冠果苗再生体系培养基组合中的所述诱导愈伤培养基，培养形成文冠果愈伤组织；
27.s2：生芽培养
28.将所述文冠果愈伤组织接种到本发明第一方面所述的文冠果苗再生体系培养基组合中的所述生芽培养基，培养形成长有不定芽的文冠果植株；
29.s3：生根培养
30.将所述长有不定芽的文冠果植株接种到本发明第一方面所述的文冠果苗再生体
系培养基组合中的所述生根培养基，形成长有不定芽和根的文冠果植株。
31.在一些实施方式中，所述文冠果外植体为文冠果茎段。
32.在一些实施方式中，所述文冠果茎段长度为1.0
‑
1.5cm的带腋芽茎段。
33.在一些实施方式中，所述文冠果茎段经灭菌处理后进行所述愈伤组织诱导。
34.在一些实施方式中，所述灭菌处理依次包括酒精水溶液浸泡、第1次无菌水冲洗、升汞溶液浸泡、第2次无菌水冲洗。
35.在一些实施方式中，所述第1次无菌水冲洗为4
‑
5次，所述第2次无菌水冲洗为4
‑
5次。
36.在一些实施方式中，所述酒精水溶液的体积浓度为70
‑
80％，酒精水溶液浸泡的时间为5
‑
15s。
37.在一些实施方式中，所述升汞溶液的质量浓度为0.1％
‑
0.2％，升汞溶液浸泡的时间为10
‑
20min。
38.在一些实施方式中，在所述酒精水溶液浸泡之前，将所述文冠果外植体用流动清水冲洗1
‑
2h。
39.在一些实施方式中，在步骤s1中，培养环境为先暗培养再光照培养，所述暗培养时间为10
‑
20天，所述光照培养时间15
‑
25天，光照强度为2000
‑
2500lx，环境温度为24
‑
26℃。
40.在一些实施方式中，在步骤s2中，培养时间为2
‑
3周，光照时间为10
‑
14h/d，光照强度为2000
‑
2500lx，环境温度为24
‑
26℃。
41.在一些实施方式中，在步骤s3中，培养时间为2
‑
3周，光照时间为10
‑
14h/d，光照强度为2000
‑
2500lx，环境温度为24
‑
26℃。
42.在一些实施方式中，将所述文冠果愈伤组织接种到本发明第一方面所述的文冠果苗再生体系培养基组合中的所述愈伤继代培养基，对所述文冠果愈伤组织进行继代培养，再将所述继代培养得到的文冠果愈伤组织接种到本发明第一方面所述的文冠果苗再生体系培养基组合中的所述生芽培养基，培养形成所述长有不定芽的文冠果植株。
43.在一些实施方式中，在所述继代培养中，培养环境为暗培养，培养时间为2
‑
3周，环境温度为24
‑
26℃。
44.在一些实施方式中，所述培养方法还包括如下步骤：
45.将所述长有不定芽和根的文冠果植株的培养瓶瓶盖打开置于自然光照下进行练苗培养，光照时间为10
‑
12h/d，相对湿度55
‑
65％，环境温度为24
‑
26℃，培养时间为5
‑
6天。
46.在一些实施方式中，所述培养方法还包括如下步骤：
47.将炼苗后的文冠果植株从瓶中取出，移栽至土壤中，环境温度为24
‑
28℃，相对湿度为55
‑
65％。
48.本发明与现有技术相比有益效果：
49.利用本发明的文冠果高效组培再生体系中涉及的文冠果外植体诱导愈伤培养基、文冠果愈伤继代培养基、文冠果生芽培养基、文冠果生根培养基，可显著提高文冠果苗生产能力，扩繁系数高，达到短时间、大批量工厂化生产文冠果幼苗的目的。
附图说明
50.图1为本发明实施例1愈伤培养情况的照片。
51.图2为本发明实施例1愈伤继代培养情况的照片。
52.图3为本发明实施例1生芽培养情况的照片。
53.图4为本发明实施例1生根培养情况正面的照片。
54.图5为本发明实施例1生根培养情况底面的照片。
具体实施方式
55.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
56.本发明没有详细描述的步骤均为本领域常规操作，没有详细记录的材料均为本领域常规材料。
57.实施例1
58.(一)培养基的配制
59.一组文冠果高效再生体系的培养基配方，包括文冠果诱导愈伤培养基、文冠果愈伤继代培养基、文冠果生芽培养基和文冠果生根培养基，具体配方如下所示。
60.表1.ms培养基基础配方
61.[0062][0063]
表2. 1/2 ms培养基基础配方
[0064][0065][0066]
(1)文冠果诱导愈伤培养基
[0067]
该培养基以ms培养基为基础，ms培养基的基础配方如上表1，每1l文冠果诱导愈伤培养基中还包括：6.8g琼脂、30g蔗糖500mg水解酪蛋白；ph6.0
±
0.1；配制培养基的水为纯水。第一组培养基中的激素为zt和iba，激素的含量分别参见表3。第二组培养基中的激素为naa和6
‑
ba，激素的含量分别参见表4。
[0068]
(2)文冠果愈伤继代培养基
[0069]
该培养基以ms培养基为基础，ms培养基的基础配方如上表1，每1l文冠果愈伤继代培养基中还包括：6.8g琼脂、30g蔗糖；ph6.0
±
0.1；配制培养基的水为纯水。培养基中的激素为naa和6
‑
ba，激素的含量分别参见表5。
[0070]
(3)文冠果生芽培养基
[0071]
该培养基以ms培养基为基础，ms培养基的基础配方如上表1，每1l文冠果生芽培养基中还包括：6.8g琼脂、30g蔗糖；ph6.0
±
0.1；配制培养基的水为纯水。第一组培养基中的
激素为kt、iba和ga3，激素的含量分别参见表6。第二组培养基中的激素为6
‑
ba和naa，激素的含量分别参见表7。
[0072]
(4)文冠果生根培养基
[0073]
该培养基以1/2ms培养基为基础，1/2ms培养基的基础配方如上表2；每1l文冠果生根培养基中还包括：6.8g琼脂、30g蔗糖；ph6.0
±
0.1；配制培养基的水为纯水。培养基中的激素为naa和iba，激素的含量分别参见表8。
[0074]
(二)诱导愈伤培养：
[0075]
外植体的选择：母株选择温室培养的文冠果植株，选取母株上生长力强且健康的嫩枝条，用枝剪剪下枝条。
[0076]
外植体的预处理：先用流动清水冲洗枝条1～2h，然后置于无菌室中的超净工作台上，剪成长度约10cm的带腋芽茎段，往后的操作在超净工作台上进行无菌操作。
[0077]
外植体的消毒：用75v/v％的酒精水溶液浸泡茎段10s，再用无菌水冲洗茎段3次，再用0.1w/w％的升汞溶液浸泡茎段15min，消毒后用无菌水冲洗茎段5次，用无菌纸吸干水分，用无菌剪刀将茎段剪为1.0
‑
1.5cm左右长度备用(茎段带腋芽)。
[0078]
愈伤组织诱导：将消毒处理过的外植体分别接种到装有表3所述6种第一组文冠果茎段诱导培养基的若干个培养瓶，以及装有表4所述6种第二组文冠果茎段诱导培养基的若干个培养瓶，每瓶1
‑
2个茎段。
[0079]
将上述外植体暗室中培养14天，环境温度为25
±
1℃，观察外植体诱导情况以及长势。
[0080]
将上述经暗室培养14天的外植体置于光照时间为10
‑
14h/d、光照强度为2000
‑
2500lx、环境温度为25
±
1℃培养室培养20天，观察外植体愈伤形成情况及长势。愈伤诱导率参见表3和表4。
[0081]
由此可见，第一组文冠果诱导诱导培养基总体上明显优于第二组文冠果诱导诱导培养基，愈伤诱导率可达92％。
[0082]
将上述经暗室及光照培养34天的外植体置于超净工作台中，用无菌手术刀将形成的愈伤组织分切成长宽高约为0.5cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小的愈伤团，置于愈伤诱导培养基中，每瓶4
‑
5块愈伤团，采用第一组文冠果诱导诱导培养基形成的愈伤组织其中一瓶的照片参见图1。
[0083]
由此可见，本发明的方法能够有效地诱导文冠果外植体生成愈伤组织。
[0084]
(三)愈伤组织继代培养：
[0085]
愈伤组织的选择：选择步骤(二)中4号培养基培养的长势好、生长力强、组织蓬松的愈伤组织，置于无菌室超净工作台上，往后的操作在超净工作台上进行无菌操作。
[0086]
将选取的愈伤组织用无菌手术刀分切成长宽高约为0.5cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小的愈伤团，分别植入表5所示6种文冠果愈伤组织继代培养基中，进行继代增殖培养。
[0087]
暗室中将上述愈伤组织进行继代培养2
‑
3周，环境温度为25
±
1℃，观察愈伤组织增殖状态，其中一瓶的照片参见图2。增殖系数参见表5。由此可见2号培养基增殖系数最大，达到5.0。
[0088]
由此可见，本发明的方法能够有效地将愈伤组织继代培养。
[0089]
(四)不定芽诱导
[0090]
选取步骤(二)中4号培养基培养的长势良好的愈伤组织于无菌超净工作台中，用无菌手术刀适当分切成长宽高约为0.5cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小的愈伤团，分别移至表6所示6种第一组文冠果生芽培养基以及表7所示3种第二组文冠果生芽培养基中，每瓶2
‑
3个，在环境温度25
±
1℃、光照12h/d、光照强度2000
‑
2500lx的条件下培养20天左右，观察记录生芽率以及生芽后幼苗的长势，其中一瓶的照片参见图3，生芽率参见表6和7。
[0091]
由此可见，本发明的第一组文冠果生芽培养基能够更有效地诱导文冠果愈伤组织生成不定芽，生芽率可达93.5％。
[0092]
(五)生根诱导
[0093]
将步骤(四)中4号培养基培养的长势茁壮的生芽小苗切割后，将其分别移至表8所示6种文冠果生根培养基中，每瓶2株，在环境温度25
±
1℃、光照12h/d、光照强度2000
‑
2500lx的条件下培养15
‑
20天，观察小苗生根状况并记录生根率。其中一瓶的正面照片参见图4，底面照片参见图5，生根率参见表8。
[0094]
由此可见，本发明的方法能够有效地诱导文冠果不定芽植株生根。
[0095]
(六)练苗
[0096]
将所述长有不定芽和根的文冠果苗培养瓶瓶盖打开置于自然光照下进行练苗培养，环境温度为26
±
2℃，光照时间为8h/d，光照较强时可适当遮荫，相对湿度控制在60
±
5％，培养时间为5
‑
6天。
[0097]
(七)移栽
[0098]
将经5
‑
6天炼苗后的文冠果植株从瓶中取出，洗掉根部培养基，移栽至温室大棚土壤中，基质采用国产泥炭土、珍珠岩和凹凸棒土(重量比例为10：1：0.1)，环境温度控制在25
±
1℃，相对湿度控制在60
±
5％。
[0099]
结果：当优化条件后，最终愈伤诱导率为92％，愈伤生芽率93.5％、生根率94.1％，幼苗成活率93％。
[0100]
表3.第一组文冠果诱导诱导培养基中的激素含量及愈伤培养结果
[0101][0102]
表4.第二组文冠果诱导诱导培养基中的激素含量及愈伤培养结果
[0103][0104]
表5.文冠果愈伤继代培养基中的激素含量及继代培养结果
[0105]
编号naa(mg/l)6
‑
ba(mg/l)增殖系数10.11.02.820.10.55.030.10.13.940.51.02.450.50.54.160.50.13.7
[0106]
表6.第一组文冠果生芽培养基中的激素含量及生芽培养结果
[0107][0108]
表7.第二组文冠果生芽培养基中的激素含量及生芽培养结果
[0109][0110]
表8.文冠果生根培养基中的激素含量及生根培养结果
[0111][0112]
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。