一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素A的生物传感器的制作方法

一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器
技术领域
1.本发明属于传感器技术领域，涉及一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器。


背景技术：

2.赭曲霉毒素 a(ochratoxin a， ota)是曲霉属和青霉属等有毒真菌产生的一类次级代谢产物， 是常见污染食品的五大真菌毒素之一， 具有较强的肾毒性、肝毒性、神经毒性和免疫毒性， 以及致畸、致癌和致突变作用。ota 广泛存在于各种谷物及其制品、葡萄与葡萄酒、咖啡等多种食品原料及其成品中， 严重威胁人体健康。
3.针对食品中 ota 的检测， 目前已有许多方法，如薄层色谱法、高效液相色谱法、液相
‑
质谱联用法以及酶联免疫吸附法等。这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应ota检测的方便、快捷、灵敏度等方面的要求。目前急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的检测方法来检测ota的残留。


技术实现要素：

4.为了实现更加灵敏、特异性的检测ota，本技术提出了一种目标与适配体特异性结合释放触发链tr，经链置换触发电极表面dna四面体封闭链释放，进而引发hcr反应使cunp被电极捕获，最终通过hno3溶解cunp导致电位变化构建检测ota的电化学生物传感器。
5.本发明的技术方案如下：一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器，包括赭曲霉毒素a的适配体apt、触发链tr、发夹探针h1、cuso4、mops 缓冲液 、tm缓冲液、发夹探针h2以及形成四面体的dna链s1、s2、s3、s4和封闭链b；所述赭曲霉毒素a的适配体apt的序列为seq id no:1；所述触发链tr的序列为seq id no:2；所述发夹探针h1的序列为seq id no:3；所述发夹探针h2的序列为seq id no:4；所述s1的序列为seq id no:5；所述s2的序列为seq id no:6；所述s3的序列为seq id no:7；所述s4的序列为seq id no:8；所述封闭链b的序列为seq id no:9；所述赭曲霉毒素a的适配体apt的序列为： 5
’‑ꢀ
gatc gggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca
ꢀ‑3’
；所述触发链tr的序列为： 5
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tgtccgatgcggc tttttttttt cacccgatc
ꢀ‑3’
；所述发夹探针h1的序列为： 5
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gggcgcccgcgcg tttttttttt ttttttttttcgcgcggggg
ꢀ‑3’
；
所述发夹探针h2的序列为：5
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gccccccccgcgcgcg tttttttttt tttttttttt cgcg
ꢀ‑3’
；所述s1的序列为：5
’‑ꢀ
ggcgcccgccgcatcggacaacggagaacaaac aacctttgcctggagatacatgcacattacggctttccctattagaaggtctcaggtgcgcgtttcggtaagtagacg
ꢀ‑3’
；所述s2的序列为：5
’‑ꢀ
sh(ch3)6‑ꢀ
cgc gca cct gag acc ttc taa tag gg ttt c ttgctgacagcgaactag aat gcc c ttt gg gct gtt ccg ggt gtg gctcgt cgg
ꢀ‑3’
；所述s3的序列为：5
’‑ꢀ
sh(ch3)6‑ꢀ
ggc cga gga ctc ctg ctc cgc tgc gg ttt g gag aactgg tcc cgt cta ctt acc g ttt cc gac gag cca cac ccggaa cag ccc
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；所述s4的序列为：5
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sh(ch3)6‑ꢀ
gcc gta atg tgc atg tat ctc cag gc ttt c cgc agcgga gca gga gtc ctc ggc c ttt gg gca ttc tagtt
ꢀ‑3’
；所述封闭链b的序列为：5
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cgctgtcagcaaggaagaaaca ttt atgcggcggg tttggaccagttctcc
ꢀ‑3’
；所述的s2、s3、s4链的5
’ꢀ
端修饰有巯基
‑
sh。
6.优选地，赭曲霉毒素a与赭曲霉毒素a的适配体apt特异性结合，释放触发链tr，在电极上依次进行链置换暴露封闭链b、杂交链式反应捕获大量cunp及其溶解导致电位变化产生电化学信号。
7.上述检测赭曲霉毒素a的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：（1）铜纳米颗粒cunp的制备：h1、cuso4在 mops 缓冲液中混合，再加入还原剂抗坏血酸钠，合成铜纳米颗粒h1
‑
cunp；h2、cuso4在 mops 缓冲液中混合，再加入还原剂抗坏血酸钠，合成铜纳米颗粒h2
‑
cunp；（2）对电极进行预处理；（3）dna四面体制备及其修饰到步骤（2）处理的电极表面：将s1、s2、s3、s4和封闭链b在tm缓冲液中混合，得到dna四面体；将制备好的dna四面体与三(2
‑
羧乙基)膦注入电极，在室温下反应；（4）均相反应产生触发链tr：赭曲霉毒素a的适配体apt和触发链tr，振荡，形成拱形探针ap；灭菌水，5
×
pbs缓冲液，拱形探针ap，赭曲霉毒素a孵育；（5）电极上的链置换、杂交链式反应、cunp的捕获及其溶解反应：将步骤（4）得到的触发链tr、h1
‑
cunp和h2
‑
cunp，滴加到步骤（3）的电极上，反应，清洗。
8.优选地，所述步骤（2）预处理过程为：电极在氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗。
9.优选地，所述步骤（3）dna四面体的制备方法为：将等摩尔量的dna四面体五条链混合在tm缓冲液中，在95℃反应，再逐渐冷却到4℃。
10.优选地，所述步骤（3）将dna四面体修饰到电极表面的过程为：将制备好的dna四面体与三(2
‑
羧乙基)膦（tcep）注入电极，在室温下反应过夜。
11.优选地，所述步骤（2）的电极为金电极。
12.上述制备方法制备的检测赭曲霉毒素a的生物传感器在检测食品、环境中赭曲霉毒素a上的应用。
13.上述的应用，以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，电位设置为
‑
0.2到0.6v，电位增加0.004 v，振幅为50 mv，脉冲宽度0.05 s，脉冲周期为0.5 s，沉积电位
‑
0.5 v，沉
积时间6min；采用差分脉冲溶出伏安法读取cunp电信号的变化，检测待测目标物。
14.上述过程中用到的溶液的制备方法：a. 5
×
pbs缓冲液是由以下方法配制：na2hpo4（10 mm）、nah2po4（10 mm）、nacl（140 mm）、kcl（1 mm）、mgcl2（1 mm），最终溶液的ph值为7.4和7.0。保存于
‑
20℃冰箱，备用。
15.b. 5
×
mops缓冲液是由以下方法配制：mops（50 mm）、nacl（750 mm），最终溶液的ph值为7.6。保存于
‑
20℃冰箱，备用。
16.c. tm缓冲液是由以下方法配制：tris（20 mm）、mgcl2（50 mm），最终溶液的ph值为8.0。保存于
‑
20℃冰箱，备用。
17.c.配置的pbs缓冲液、mops缓冲液、tm缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将pbs和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120 ℃的温度下灭菌20 min。保存于
‑
20℃冰箱，备用。
18.d.电解液的配置：取4 ml 5
×
pbs于16 ml灭菌水中，并加入200 μl，100 mm的h2o2溶液，充分混匀待用。电解液需现用现配。
19.该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。ag/agcl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先进行铜纳米颗粒、dna四面体的制备以及均相反应溶液的准备。然后将dna四面体通过au
‑
s键固定在电极表面。再将均相反应产物、h1
‑
cunp和h2
‑
cunp滴加到电极上，依次进行sda、hcr和铜纳米颗粒的捕获。最后向反应电极上滴加过hno3，继续孵育，用三电极工作体系检测信号峰变化。电位设置为
‑
0.2到0.6v，电位增加0.004 v，振幅为50 mv，脉冲宽度0.05 s，脉冲周期为0.5 s，沉积电位
‑
0.5 v，沉积时间6 min。采用差分脉冲溶出伏安法读取cunp电信号的变化，检测待测目标物。
20.本发明基于ota及其适配体的特异性识别、sda反应、hcr反应以及dna四面体的特殊性质构建了电化学生物传感器。该传感器具有检测速度快，检测限低，特异性高等优点，可以弥补ota现有检测方法的缺陷与不足，实现对其快速、准确的定量检测。
附图说明
21.图1为该发明原理示意图；图2为实施例1 拱形探针ap浓度优化检测结果图；图3为实施例2 h1
‑
cunp浓度优化检测结果图；图4为实施例3 传感器检测ota的工作曲线。
22.本发明的有益效果：1、利用了适配体的特异性识别，具有特异性高的优势；2、过铜纳米颗粒的形成和溶解这个变化过程，导致电位发生变化，从而得以检测，反应条件简单可控，反应时间短，灵敏度高；3、反应的主要过程在电极上进行，操作方便简单，性能稳定；4、制备过程价格低廉，监测速度快，适用于食品和环境中ota检测的产业化实际应用。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1（1）铜纳米颗粒的制备：首先将h1和h2在95℃下加热2 min，再逐渐冷却到室温。取5μl h1（10μm）与75μl 1
×
mops缓冲液（ph=7.6）混合均匀，向混合液中加入10μl 抗坏血酸钠（20 mm ），振荡1 min，加10μl cuso
4 （1 mm），振荡1 min，在室温下进行暗反应10min，得到以h1为模板的铜纳米颗粒h1
‑
cunp。用相同的方法，以h2为模板制备铜纳米颗粒h2
‑
cunp。
24.（2）dna四面体的制备：将5 μl s1、s2、s3、s4和b（终浓度都为100 μm）混合在tm缓冲液中，在95℃反应5 min，放入4℃ 冰箱逐渐冷备用却，使用前需稀释100倍。
25.（3）拱形探针arch probe（ap）的制备：将5 μl apt（10 μm）和5 μl tr（10 μm）加入灭菌的离心管中，振荡30 s，放入95℃的水浴锅中保持5 min形成拱形探针ap后，冷却至室温；如图1所示，目标物ota与适配体特异性结合释放触发链tr，tr经sda反应将dna四面体的封闭区域释放。加入h1
‑
cunp和h2
‑
cunp后进行杂交链式反应，反应后将铜纳米颗粒捕获到电极表面，在加入hno3溶解捕获的cunp，从而产生电化学信号变化。
26.实施例2一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：a.电极预处理：金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；b.将10 μl 1μm 的dna四面体溶液（含3mm tcep）滴加到电极表面，在室温下孵育过夜，以备下一步反应使用。
27.c.均相反应：取30 μl灭菌水，10 μl 5
×
pbs缓冲液，5 μl拱形探针（0 μm、0.01 μm、0.05 μm、0.1 μm、0.2 μm、0.3 μm、0.4 μm、0.5 μm），5 μl浓度为500 μm的赭曲霉毒素a于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h，得到触发链tr；d.电极反应：取c步中的tr溶液5 μl，2.5 μl h1
‑
cunp（4 μm）和2.5 μl h2
‑
cunp（4 μm）滴加到电极表面，孵育1.5 h进行hcr反应。反应完成后，加入100 μl的hno3（5 m）反应10 min。
28.e.将修饰好的电极用pbs缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；f.制备好的电极以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，电位设置为
‑
0.2到0.6v，电位增加0.004 v，振幅为50 mv，脉冲宽度0.05 s，脉冲周期为0.5 s，沉积电位
‑
0.5 v，沉积时间6min。采用差分脉冲溶出伏安法读取cunp电信号的变化，检测待测目标物。
29.结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着拱形探针的浓度在0
‑
0.1 μm区间内增大而增大，当浓度超过0.1 μm后，电流趋于稳定，所以ap的最佳浓度为0.1 μm。
30.实施例3一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：a.电极预处理：金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；b.将10 μl 1μm 的dna四面体溶液（含3mm tcep）滴加到电极表面，在室温下孵育过夜，以备下一步反应使用。
31.c.均相反应：取30 μl灭菌水，10 μl 5
×
pbs缓冲液，5 μl拱形探针（0.1 μm），5 μl浓度为500 μm的赭曲霉毒素a于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h，得到触发链tr；d.电极反应：取c步中的tr溶液5 μl，2.5 μl h1
‑
cunp（0 μm、0.5 μm、1 μm、2 μm、3 μm、4 μm、5 μm、6 μm）和2.5 μl h2
‑
cunp（4 μm）滴加到电极表面，孵育1.5 h进行hcr反应。反应完成后，加入100 μl的hno3（5 m）反应10 min。
32.e.将修饰好的电极用pbs缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；f.制备好的电极以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，电位设置为
‑
0.2到0.6v，电位增加0.004 v，振幅为50 mv，脉冲宽度0.05 s，脉冲周期为0.5 s，沉积电位
‑
0.5 v，沉积时间6min。采用差分脉冲溶出伏安法读取cunp电信号的变化，检测待测目标物。
33.结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着h1
‑
cunp的浓度在0
‑
6 μm区间内增大而增大，当浓度超过100 nm后，电流趋于稳定，所以环状模板ct的最佳浓度为4 μm。
34.实施例4一种基于铜纳米颗粒的检测赭曲霉毒素a的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：a.电极预处理：金电极首先在0.3和0.05 μm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；b.将10 μl 1μm 的dna四面体溶液（含3mm tcep）滴加到电极表面，在室温下孵育过夜，以备下一步反应使用。
35.c.均相反应：取30 μl灭菌水，10 μl 5
×
pbs缓冲液，5 μl拱形探针（0.1 μm），5 μl浓度为（0 ng
·
l
‑1、1 ng
·
l
‑1、10 ng
·
l
‑1、50 ng
·
l
‑1、100 ng
·
l
‑1、500 ng
·
l
‑1）的赭曲霉毒素a于灭菌的离心管中，振荡30 s，放入37℃的水浴锅中孵育2 h，得到触发链tr；d.电极反应：取c步中的tr溶液5 μl，2.5 μl h1
‑
cunp（4 μm）和2.5 μl h2
‑
cunp（4 μm）滴加到电极表面，孵育1.5 h进行hcr反应。反应完成后，加入100 μl的hno3（5 m）反应10 min。
36.e.将修饰好的电极用pbs缓冲液和超纯水清洗三遍，在氮气流下干燥；f.制备好的电极以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，电位设置为
‑
0.2到0.6v，电位增加0.004 v，振幅为50 mv，脉冲宽度0.05 s，脉冲周期为0.5 s，沉积电位
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0.5 v，沉积时间6min。采用差分脉冲溶出伏安法读取cunp电信号的变化，检测待测目标物。
37.结果见图4。从图4a中可以看出，检测到的电流信号随着目标物浓度在1 ng
·
l
‑1ꢀ‑
500 ng
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l
‑1区间内增大而增大，图4b显示ota浓度的对数与电流峰值大小呈正比关系，拟合曲线：i= 8.616 0.720 lgc（相关系数是0.983，其中c代表了ota的浓度），由此计算优化后的生物传感器的检测限为2 pg
·
l
‑1。
38.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。