使用具有亚末端羟化酶活性的细胞色素P450酶生物合成生产γ-内酯和δ-内酯的制作方法

使用具有亚末端羟化酶活性的细胞色素p450酶生物合成生产
γ
‑
内酯和
δ
‑
内酯
1.对相关申请的交叉引用本技术要求于2019年3月21日提交的美国临时申请序列号62/821,894的优先权，其公开内容通过引用以其整体并入本文。
发明领域
2.本发明的领域涉及通过改良的微生物培养物生产γ
‑
内酯和δ
‑
内酯的方法和工艺。更具体地，本公开内容涉及通过酶促转化从相应的脂肪酸底物生产具有5
‑
8个碳原子的γ
‑
内酯和δ
‑
内酯。
3.发明背景存在对具有令人愉悦的味道和气味的食品、芳香剂和化妆品的普遍需求。在许多情况下，令人愉悦的气味和味道的这些性状通过具有期望的芳香特征和风味特征的各种内酯化合物(包括各种γ
‑
内酯和δ
‑
内酯)来提供。目前对内酯化合物的需求主要通过化学合成或从植物中提取的方法来解决。以植物提取为基础的生产具有明显的缺点，诸如天气对感兴趣的化合物的强度和丰度的影响、植物病害和/或歉收的风险、化合物的稳定性、产量增加对环境的影响和贸易限制。工业生产可能引起环境损害，可能使用危险的前体，并且其自身可能由于关键底物的成本而遇到成本增加的问题。
4.因此，本领域需要在没有植物提取和化学合成所造成的限制的情况下经济地且可靠地生产γ
‑
内酯和δ
‑
内酯的新方法。
5.发明概述根据本发明，可以通过使用微生物诸如细菌和/或酵母的基因修饰和发酵技术以高收率可靠地生产内酯。这些微生物能够从头合成内酯或通过脂肪酸的生物转化合成内酯，以提供商业上显著的收率。因此，本文提供了新的生产方法来降低γ
‑
内酯和δ
‑
内酯生产的成本并且减少可以从中提取这些内酯化合物的天然来源的大规模培养以及处理的环境影响。
6.更具体地，本公开内容涵盖通过微生物发酵制备内酯的方法和组合物，其中所述微生物发酵包括表达异源细胞色素p450 (cyp450)蛋白的细胞系统。
7.本公开内容部分地基于以下发现：某些cyp450蛋白及其功能变体在特定亚末端碳原子位置具有羟化酶活性。具体地，已经鉴定某些cyp450蛋白在与末端(ω)碳原子邻近的第一(ω
‑
1)、第二(ω
‑
2)和/或第三(ω
‑
3)碳原子处造成直链脂肪酸的羟基化。通过在经修饰的微生物系统中过表达这些cyp450蛋白并将直链脂肪酸作为底物供给所述经修饰的微生物系统，产生co
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1、co
‑
2和co
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3羟基脂肪酸，然后它们可以以高效价有效地转化成各种γ
‑
内酯和δ
‑
内酯。因此，本公开内容提供了用于从直链脂肪酸生产γ
‑
内酯和δ
‑
内酯的经济且可靠的方法，而没有如上所述的与化学合成或植物提取相关的缺点。
8.因此，本公开内容的一个方面提供了一种制备内酯的方法，其包括(a)将表达异源cyp450蛋白的细胞系统与包含直链脂肪酸的培养基一起温育以产生亚末端羟基脂肪酸，并
且将所得的亚末端羟基脂肪酸与细胞培养物一起温育，随后酸处理以产生一种或多种γ
‑
内酯和δ
‑
内酯。
9.在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与来自嗜热毁丝霉（myceliophthora thermophile）的cyp450的氨基酸序列具有至少90%(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与来自嗜热毁丝霉的cyp450的氨基酸序列具有至少95%(例如，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述来自嗜热毁丝霉的cyp450蛋白包含seq id no: 3的氨基酸序列。
10.在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与来自深黄伞形霉（umbelopsis isabellina）的cyp450的氨基酸序列具有至少90%(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与来自深黄伞形霉的cyp450的氨基酸序列具有至少95%(例如，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述来自深黄伞形霉的cyp450蛋白包含seq id no: 6的氨基酸序列。
11.本文描述的任何方法可以进一步包含在所述细胞系统中表达异柠檬酸脱氢酶(led)蛋白(例如，异源led)。在某些实施方案中，所述led蛋白包含与来自大肠杆菌（e.coli）的led的氨基酸序列具有至少90%(例如，至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述led蛋白包含与来自大肠杆菌的led的氨基酸序列具有至少95%(例如，至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述来自大肠杆菌的led蛋白包含seq id no: 4的氨基酸序列。
12.在某些实施方案中，所述直链脂肪酸包含5个碳原子至40个碳原子。在优选的实施方案中，所述直链脂肪酸包含7个碳原子至20个碳原子。在某些实施方案中，所述脂肪酸选自月桂酸、十三烷酸或其组合。在某些实施方案中，所述亚末端羟基脂肪酸包含羟基化的月桂酸、羟基化的十三烷酸或其组合。在某些实施方案中，所述亚末端羟基脂肪酸包含在选自ω
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1、ω
‑
2和ω
‑
3的位置处的羟基。
13.在某些实施方案中，所述细胞系统可以包含生长中的细胞。在某些实施方案中，所述细胞系统可以包含冻干的细胞。在某些实施方案中，所述细胞系统可以包含细菌细胞、酵母细胞、不天然产生目标内酯的植物细胞、藻类细胞、真菌细胞或其组合，其中一种或多种已被转化以过表达本文描述的蛋白。在某些实施方案中，所述细胞系统可以包含选自以下的细菌和/或酵母细胞：埃希氏菌属（escherichia）；沙门氏菌属（salmonella）；芽孢杆菌属（bacillus）；不动杆菌属（acinetobacter）；链霉菌属（streptomyces）；棒杆菌属（corynebacterium）；甲基弯曲菌属（methylosinus）；甲基单胞菌属（methylomonas）；红球菌属（rhodococcus）；假单胞菌属（pseudomonas）；红细菌属（rhodobacter）；集胞蓝细菌属（synechocystis）；酵母属（saccharomyces）；接合酵母属（zygosaccharomyces）；克鲁维酵母属（kluyveromyces）；假丝酵母属（candida）；汉逊酵母属（hansenula）；德巴利酵母属（debaryomyces）；毛霉菌属（mucor）；毕赤酵母属（pichia）；球拟酵母属（torulopsis）；曲霉菌属（aspergillus）；线虫捕捉菌属（arthrobotlys）；短杆菌属（brevibacteria）；微杆菌属（microbacterium）；节杆菌属（arthrobacter）；柠檬酸杆菌属（citrobacter）；克雷伯氏菌
属（klebsiella）；毛霉菌属（mucor）；泛菌属（pantoea）；棒杆菌属（corynebacterium）；和梭菌属（clostridium）。
14.在某些实施方案中，所述内酯可以包含五个碳至八个碳。在某些实施方案中，所述内酯包含δ
‑
己内酯、γ
‑
己内酯和δ
‑
辛内酯中的一种或多种。在某些实施方案中，所述内酯包含γ
‑
戊内酯、δ
‑
庚内酯和γ
‑
庚内酯中的一种或多种。
15.在某些实施方案中，所述直链脂肪酸是月桂酸，所述亚末端羟基脂肪酸是羟基月桂酸，且所述内酯包含δ
‑
己内酯、γ
‑
己内酯和δ
‑
辛内酯中的一种或多种。在某些实施方案中，所述直链脂肪酸是十三烷酸，所述亚末端羟基脂肪酸是羟基十三烷酸，且所述内酯包含γ
‑
戊内酯、δ
‑
庚内酯和γ
‑
庚内酯中的一种或多种。在某些实施方案中，在用细胞培养物处理它之前将所述亚末端羟基脂肪酸与细胞系统分离。
16.本文描述的任何方法可以进一步包含从微生物细胞培养物或酸性环境分离内酯以提供粗产物。在某些实施方案中，从这样的分离步骤得到的粗产物可以包括至少70%纯的内酯含量。在某些实施方案中，所述方法进一步包括：i)纯化包含内酯的粗产物；和，ii)在真空下除去溶剂以提供浓缩的产物。在某些实施方案中，通过柱色谱法纯化所述粗产物。在某些实施方案中，通过酸
‑
碱萃取纯化所述粗产物。在某些实施方案中，通过真空蒸馏纯化所述粗产物。在某些实施方案中，所述方法进一步包括使用半制备型hplc纯化所述内酯。
17.本公开内容进一步提供了一种包含内酯的混合物的发酵产物组合物，其中所述内酯的混合物包含一种或多种具有5
‑
8个碳原子的γ
‑
内酯和/或δ
‑
内酯。发酵产物组合物中的内酯含量可以是粗制混合物的至少70%(例如，至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)，并然后可以从微生物细胞培养物中进一步纯化。
18.本领域技术人员会认识到，通过本文描述的方法生产的内酯组合物可以进一步纯化和与其它内酯、矫味剂或香料混合，以获得在多种消费产品或食品中使用的期望组合物。例如，本文描述的内酯组合物可以被包含在食物产品(诸如饮料、软饮料、冰淇淋、乳制品、甜点、谷类食物、口香糖、烘焙物等)、饮食添加物、医学营养品、以及药物产品中，以赋予期望的风味特征或芳香特征。在某些实施方案中，本公开内容提供了一种可消费产品，其包含通过上文或本文别处所述的方法中的任一种方法产生的在特定的调味背景、调味制剂或调味处方中使用的调味量或发香量的内酯。在某些实施方案中，所述可消费产品可以是食品、饮料、香料或化妆品。在某些实施方案中，所述组合物可以选自饮料、甜点、烘焙产品、曲奇饼干和口香糖。在某些实施方案中，所述组合物可以是具有被设计成尝起来或闻起来类似于桃、杏、梨、枫树、椰子、热带水果（tropical）、奶油糖果、石榴汁糖浆和/或枣的风味或芳香特性的食品、饮料、香料或化妆品。
19.虽然本公开内容容易进行各种修改和替代形式，但其具体实施方案在附图中以举例的方式示出，并且将在本文中详细描述。但是，应当理解，本文提供的附图和详细描述无意将公开内容限制为所公开的特定实施方案，而是相反，意图涵盖落入由所附权利要求限定的本公开内容的精神和范围内的所有修改、等同方案和替代方案。
20.参考附图，本发明的其它特征和优点将在对本发明的优选实施方案的以下详细描述中变得显而易见。
21.附图简要说明
以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步证实本公开内容的某些方面，其通过参考这些附图中的一个或多个并且结合本文呈现的具体实施方案的详细描述可以更好地理解。
22.图1显示了说明根据本公开内容的用于生产γ
‑
内酯和δ
‑
内酯的生物合成途径的实施方案的示意图，其中c18脂肪酸(硬脂酸)通过涉及亚末端羟基脂肪酸(17
‑
羟基硬脂酸)作为中间体的两步法被生物转化成δ
‑
己内酯。
23.图2a显示了证实在其中过表达嗜热毁丝霉（m. thermophile）cyp505a30和大肠杆菌icd的细胞系统中从对应的直链脂肪酸c12:0产生亚末端羟基脂肪酸ho
‑
c12:0的gc/ms谱。在生物转化后4小时取样。
24.图2b显示了证实在其中过表达嗜热毁丝霉cyp505a30和大肠杆菌icd的细胞系统中从对应的直链脂肪酸c13:0产生亚末端羟基脂肪酸ho
‑
c13:0的gc/ms谱。在生物转化后4小时取样。
25.图3解释了从月桂酸(c12:0)产生δ
‑
己内酯(dc6)、γ
‑
己内酯(gc6)和δ
‑
辛内酯(dc8)。
26.图4a、4b、4c、4d和4e显示了证实从亚末端羟基脂肪酸ho
‑
12:0产生γ
‑
内酯和δ
‑
内酯的gc/ms谱。图4a是在顶部。图4b是从上数第二个。图4c是在中间。图4d是从上数第四个，且图4e是在底部。基于峰的保留时间和质谱图与来自sigma的标准品的对比来鉴定峰。图4b和峰1：γ
‑
己内酯(gc6)；图4c和峰2：δ
‑
己内酯(dc6)；图4d和峰3：苯乙醇；和图4e和峰4：δ
‑
辛内酯(dc8)。
27.图5说明了从十三烷酸(c13:0)产生γ
‑
戊内酯(gc5)、δ
‑
庚内酯(dc7)和γ
‑
庚内酯(gc7)。
28.图6a、6b、6c和6d显示了证实从亚末端羟基脂肪酸ho
‑
13:0产生γ
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内酯和δ
‑
内酯的gc/ms谱。基于峰的保留时间和质谱图与来自sigma的标准品的对比来鉴定峰。图6a是在顶部。图6b是从上数第二个。图6c是从上数第三个，且图6d是在底部。图6b和峰1：苯乙醇；图6c和峰2：γ
‑
庚内酯(gc7)；图6d和峰3：δ
‑
庚内酯(dc7)。
29.图7a和7b显示了证实在其中过表达基因mi2的细胞系统中分别从c12:0和03:0产生亚末端羟基脂肪酸ho
‑
c12:0 (图7a中的峰1)和ho
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c13:0 (图7b中的峰1)的gc/ms谱。在生物转化后9小时取样并用n
‑
三乙基甲硅烷基
‑
n
‑
甲基三氟乙酰胺甲硅烷基化。
30.图8a和8b显示了证实从不同的羟基脂肪酸产生内酯的gc/ms谱。图8a: 在mi2
‑
c12
‑
csl培养基中生长的博伊丁假丝酵母（candida boidinii）培养物。图8b: 在mi2
‑
c13
‑
csl培养基中生长的博伊丁假丝酵母培养物。图8a
‑
8b中的缩写具有以下含义：gc6：γ
‑
己内酯；dc7：δ
‑
庚内酯(dc7)；c12：月桂酸；c13：十三烷酸。在接种后2天取样。
31.优选实施方案的描述内酯是工业上重要的风味化合物，其广泛见于食品、水果和饮料中，并用于许多果味芳香食品和化妆品中(参见，例如，romero
‑
guido等人, 201 1. biochemistry of lactone formation in yeast and fungi and its utilization for the production of flavor and fragrance compounds.appl.microbiol.biotechnol.89: 535
‑
547)。在某些实施方案中，本公开内容提供了从脂肪酸制备内酯的方法。在某些实施方案中，所述方法包括第一步，其中表达异源细胞色素p450 (cyp450)蛋白的细胞系统将脂肪酸转化成羟基
脂肪酸。在某些实施方案中，所述方法包括第二步，其中微生物细胞培养物，例如酵母细胞培养物，通过称为β
‑
氧化的生化过程将亚末端羟基脂肪酸的长度缩短至适当长度，其在环化后产生适当的内酯。因此，在根据本发明的方法的第二步结束时亚末端羟酸的长度短于在根据本发明的方法的第一步结束时获得的亚末端羟基脂肪酸的长度。在某些实施方案中，第二步骤进一步包括酸化步骤，该步骤诱导缩短的亚末端羟基脂肪酸环化为适当的内酯。本文提供的方法进一步包括从细胞培养物或酸性环境中分离内酯。
32.制备内酯的方法在某些实施方案中，本文描述的方法提供从脂肪酸生产内酯。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括(a)将表达异源细胞色素p450 (cyp450)蛋白的细胞系统与包含直链脂肪酸的培养基一起温育以产生亚末端羟基脂肪酸的步骤，(b)将来自步骤(a)的亚末端羟基脂肪酸与微生物细胞培养物一起温育以将亚末端羟酸的长度缩短至适当长度的步骤，和(c)使来自步骤(b)的缩短的亚末端羟酸在酸性环境中环化以获得适当的内酯的步骤。
33.在某些实施方案中，制备内酯的方法包括使从表达异源cyp450蛋白的细胞系统收获的细胞沉淀物与包含脂肪酸的培养基一起温育。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括将重新悬浮的从细胞系统收获的细胞沉淀物与包含脂肪酸的培养基一起温育。
34.本文描述的制备内酯的方法包括以任何比例将表达异源cyp450蛋白的细胞系统与包含脂肪酸的培养基一起温育。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括温育包含1克细胞/升至200克细胞/升(1 g/l至200 g/l)的细胞系统和包含1克脂肪酸/升至20克脂肪酸/升(1 g/l至20 g/l)的培养基。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括温育包含100克细胞/升(100 g/l)的细胞系统和包含3克脂肪酸/升(3 g/l)的培养基。
35.在某些实施方案中，制备内酯的方法包括将细胞系统与包含脂肪酸的培养基一起温育足以形成羟基脂肪酸的合适时段。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括使羟基脂肪酸与细胞培养物接触足以在微生物细胞培养物中形成内酯的合适时段。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括在与微生物细胞培养物接触之前从细胞系统分离羟基脂肪酸。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括将培养基中的羟基脂肪酸与微生物细胞培养物一起温育。
36.本文描述的制备内酯的方法涵盖将表达异源cyp450蛋白的细胞系统与包含脂肪酸的培养基一起温育特定时间段。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括将表达异源cyp450蛋白的细胞系统与包含脂肪酸的培养基一起温育0.5小时至96小时的时间段。
37.本文描述的制备内酯的方法涵盖在特定温度将表达异源cyp450蛋白的细胞系统与包含脂肪酸的培养基一起温育。在某些实施方案中，制备内酯的方法包括在16℃至40℃的温度将表达异源cyp450蛋白的细胞系统与包含脂肪酸的培养基一起温育。
38.细胞色素p450细胞色素p450（cyp450）蛋白通常是催化底物氧化的酶。cyp450蛋白是血红素蛋白超家族的成员，并含有血红素作为辅因子。cyp450酶已在许多生物体，包括、但不限于动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中得到鉴定。催化脂肪酸的亚末端羟基化的任何cyp450蛋白或其任何功能变体或片段可用于本文描述的方法中。已报道具有亚末端羟化酶活性的cyp450蛋白的例子包括、但不限于：来自巨大芽孢杆菌（bacillus megaterium）的cyp102a1（或p450
bm3
），来自嗜热毁丝霉的cyp450蛋白（uniprot # g2qdz3），来自尖孢镰刀菌
（fusarium oxysporum）的cyp450，来自深黄伞形霉的cyp450蛋白，来自海分枝杆菌（mycobacterium marinum）的cyp147g1，来自纤维堆囊菌（sorangium cellulosum）的cyp109d1，来自tritcum aestivum的cyp709c1，来自枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）的cyp109b1，来自黄孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporium）的cyp505d6，或其任何功能变体或片段。在某些实施方案中，在本文描述的方法中使用超过一种cyp450蛋白。在某些实施方案中，在本文描述的方法中使用2、3、4或5种不同的cyp450蛋白。
39.在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与由seq id no: 1的核酸序列编码的来自嗜热毁丝霉的cyp450的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与由seq id no: 1的核酸序列编码的来自嗜热毁丝霉的cyp450蛋白的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含由seq id no: 1中的核酸编码的氨基酸序列。
40.在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与在seq id no: 3中提供的来自嗜热毁丝霉的cyp450的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与在seq id no: 3中提供的来自嗜热毁丝霉的cyp450蛋白的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含seq id no: 3的氨基酸序列。
41.在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与由seq id no: 5的核酸序列编码的来自深黄伞形霉的cyp450的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与由seq id no: 5的核酸序列编码的来自深黄伞形霉的cyp450蛋白的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含由seq id no: 5中的核酸编码的氨基酸序列。
42.在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与在seq id no: 6中提供的来自深黄伞形霉的cyp450的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含与在seq id no: 6中提供的来自深黄伞形霉的cyp450蛋白的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述cyp450蛋白包含seq id no: 6的氨基酸序列。
43.在某些实施方案中，cyp450蛋白催化脂肪酸向羟基脂肪酸的转化。在某些实施方案中，cyp450蛋白催化ω
‑
1至ω
‑
3羟基脂肪酸的形成。在某些实施方案中，cyp450蛋白催化co
‑
1羟基脂肪酸的形成。在某些实施方案中，cyp450蛋白催化co
‑
2羟基脂肪酸的形成。在某些实施方案中，cyp450蛋白催化co
‑
3羟基脂肪酸的形成。
44.异柠檬酸脱氢酶(led)异柠檬酸脱氢酶(led)蛋白通常是催化异柠檬酸盐或酯(isocitrate)的氧化脱羧的酶。已在许多生物体，包括、但不限于动物、植物、真菌、细菌、古细菌和病毒中鉴定出led蛋白。在某些实施方案中，led蛋白将nad
转化成nadh或将nadp
转化成nadph。在某些实施方案中，由led蛋白产生的nadh和/或nadph可以被另一种酶(例如，cyp450)利用，从而促进其它酶的活性。催化nad

向nadh或nadp

向nadph的转化的任何led蛋白，或其任何功能变体或片段，可以用于本文描述的方法中。led蛋白的一个例子包括、但不限于来自大肠杆菌的
led蛋白(uniprot # p08200)。在某些实施方案中，在本文描述的方法中使用超过一种led蛋白。在某些实施方案中，在本文描述的方法中使用2、3、4或5种不同的led蛋白。
45.在某些实施方案中，所述led蛋白包含与由seq id no: 2的核酸序列编码的来自大肠杆菌的led的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述led蛋白包含与由seq id no: 2的核酸序列编码的来自大肠杆菌的led蛋白的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述led蛋白包含由seq id no: 2中的核酸编码的氨基酸序列。
46.在某些实施方案中，所述led蛋白包含与由seq id no: 4提供的来自大肠杆菌的led的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述led蛋白包含与由seq id no: 4提供的来自大肠杆菌的led蛋白的氨基酸序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述led蛋白包含seq id no: 4的氨基酸序列。
47.内酯根据本文描述的方法，羟基脂肪酸可以转化成内酯。根据本公开内容，本文提供的方法将亚末端羟基脂肪酸转化成γ
‑
内酯、δ
‑
内酯和其组合。内酯的例子包括、但不限于：δ
‑
己内酯、γ
‑
己内酯、δ
‑
辛内酯、γ
‑
戊内酯、δ
‑
庚内酯和γ
‑
庚内酯。
48.在某些实施方案中，将亚末端羟基月桂酸转化成δ
‑
己内酯、γ
‑
己内酯和/或δ
‑
辛内酯。在某些实施方案中，将羟基十三烷酸转化成γ
‑
戊内酯、δ
‑
庚内酯和/或γ
‑
庚内酯。
49.在某些实施方案中，本文描述的内酯包含5个碳至8个碳。在某些实施方案中，所述内酯包含5个碳。在某些实施方案中，所述内酯包含6个碳。在某些实施方案中，所述内酯包含7个碳。在某些实施方案中，所述内酯包含8个碳。
50.使用本领域已知的任意方法，可以从细胞培养物分离或纯化根据本文描述的方法生产的任何内酯。在某些实施方案中，用色谱法从细胞培养物分离或纯化内酯。在某些实施方案中，用有机溶剂从细胞培养物分离或纯化内酯。在某些实施方案中，可以将分离的或纯化的内酯掺入产品，例如，食品、饮料、香料或化妆品。
51.脂肪酸根据本文描述的方法，脂肪酸可以转化成羟基脂肪酸。根据本文公开的方法，可以将任何脂肪酸转化成其羟基化形式。脂肪酸的例子包括、但不限于戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、十二烷酸、十三烷酸、十四烷酸、十五烷酸、十六烷酸、十七烷酸、十八烷酸、十九烷酸、二十烷酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、二十六烷酸、二十七烷酸、二十八烷酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸、三十八烷酸、三十九烷酸、和四十烷酸。表1提供了示例性脂肪酸的通用名称、结构式和脂质编号。
52.在某些实施方案中，本文描述的脂肪酸包含5个碳至40个碳。在某些实施方案中，所述脂肪酸包含5个碳、6个碳、7个碳、8个碳、9个碳、10个碳、11个碳、12个碳、13个碳、14个碳、15个碳、16个碳、17个碳、18个碳、19个碳、20个碳、21个碳、22个碳、23个碳、24个碳、25个碳、26个碳、27个碳、28个碳、29个碳、30个碳、31个碳、32个碳、33个碳、34个碳、35个碳、36个碳、37个碳、38个碳、39个碳、40个碳或更多个碳。
53.在某些实施方案中，将本文描述的脂肪酸提供在培养基中。在某些实施方案中，所述包含脂肪酸的培养基包含细胞培养基。在某些实施方案中，所述包含脂肪酸的培养基包含盐。盐是阴离子和阳离子的组合。阳离子的非限制性例子包括锂、钠、钾镁、钙和铵。阴离子的非限制性例子包括乙酸根、氯离子、硫酸根和磷酸根。在某些实施方案中，所述包含脂肪酸的培养基包含异柠檬酸三钠盐。
54.在某些实施方案中，所述包含脂肪酸的培养基包含缓冲剂。缓冲剂的例子包括、但不限于磷酸盐缓冲剂、tris缓冲剂、mops缓冲剂、hepes缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、苹果酸盐缓冲剂、mes缓冲剂、组氨酸缓冲剂、pipes缓冲剂、bis
‑
tris缓冲剂和乙醇胺缓冲剂。
55.在某些实施方案中，所述包含脂肪酸的培养基包含去污剂。去污剂的非限制性例子包括聚山梨酯20 (tween
®
20)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(tween
®
40)、4
‑
(1,1,3,3
‑
四甲基丁基)苯基
‑
聚乙二醇(triton
™
x
‑
100)、十二烷基硫酸钠(sds)、乙基三甲基溴化铵(etmab)、月桂基三甲基溴化铵(ltab)和月桂基三甲基氯化铵(ltac)。
56.包含脂肪酸的培养基可以包含任何浓度的脂肪酸。在某些实施方案中，包含脂肪酸的培养基包含0.5 g/l至100 g/l脂肪酸，例如，1 g/l至10 g/l脂肪酸。在某些实施方案中，包含脂肪酸的培养基包含0.5 g/l、1 g/l、2 g/l、3 g/l、4 g/l、5 g/l、6 g/l、7 g/l、8 g/l、9 g/l、10 g/l、20 g/l、30 g/l、40 g/l、50 g/l、60 g/l、70 g/l、80 g/l、90 g/l或100 g/l脂肪酸。
57.本文描述的任何脂肪酸可以根据本文描述的方法羟基化。在某些实施方案中，戊酸被转化成羟基化的戊酸，己酸被转化成羟基化的己酸，庚酸被转化成羟基化的庚酸，辛酸被转化成羟基化的辛酸，壬酸被转化成羟基化的壬酸，癸酸被转化成羟基化的癸酸，十一烷酸被转化成羟基化的十一烷酸，十二烷酸被转化成羟基化的十二烷酸，十三烷酸被转化成羟基化的十三烷酸，十四烷酸被转化成羟基化的十四烷酸，十五烷酸被转化成羟基化的十五烷酸，十六烷酸被转化成羟基化的十六烷酸，十七烷酸被转化成羟基化的十七烷酸，十八烷酸被转化成羟基化的十八烷酸，十九烷酸被转化成羟基化的十九烷酸，二十烷酸被转化成羟基化的二十烷酸，二十一烷酸被转化成羟基化的二十一烷酸，二十二烷酸被转化成羟基化的二十二烷酸，二十三烷酸被转化成羟基化的二十三烷酸，二十四烷酸被转化成羟基化的二十四烷酸，二十五烷酸被转化成羟基化的二十五烷酸，二十六烷酸被转化成羟基化的二十六烷酸，二十七烷酸被转化成羟基化的二十七烷酸，二十八烷酸被转化成羟基化的二十八烷酸，二十九烷酸被转化成羟基化的二十九烷酸，三十烷酸被转化成羟基化的三十烷酸，三十一烷酸被转化成羟基化的三十一烷酸，三十二烷酸被转化成羟基化的三十二烷酸，三十三烷酸被转化成羟基化的三十三烷酸，三十四烷酸被转化成羟基化的三十四烷酸，三十五烷酸被转化成羟基化的三十五烷酸，三十六烷酸被转化成羟基化的三十六烷酸，三十七烷酸被转化成羟基化的三十七烷酸，三十八烷酸被转化成羟基化的三十八烷酸，三十九烷酸被转化成羟基化的三十九烷酸，和四十烷酸被转化成羟基化的四十烷酸。
58.在某些实施方案中，羟基脂肪酸包含在位置co
‑
1、co
‑
2、co
‑
3或其组合处的羟基。在某些实施方案中，羟基脂肪酸包含在位置co
‑
1、co
‑
2和co
‑
3处的羟基。在某些实施方案中，羟基脂肪酸包含在位置co
‑
1处的羟基。在某些实施方案中，羟基脂肪酸包含在位置co
‑
2处的羟基。在某些实施方案中，羟基脂肪酸包含在位置co
‑
3处的羟基。
59.在某些实施方案中，使羟基脂肪酸与细胞培养物接触。在某些实施方案中，使羟基脂肪酸与细胞培养物接触包括将羟基脂肪酸暴露于细胞培养物足以在细胞培养物中形成内酯(如果有的话)的合适时段。在某些实施方案中，在与细胞培养物接触之前分离羟基脂肪酸。在某些实施方案中，使培养基中的羟基脂肪酸与细胞培养物接触。
60.细胞系统细胞系统表示提供异位蛋白或异源蛋白(例如，cyp450)的表达的任何一个或多个细胞。细胞系统包括、但不限于细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞系统包含细菌细胞、酵母细胞或其组合。在某些实施方案中，所述细胞系统包含原核细胞、真核细胞和其组合。在某些实施方案中，所述细胞系统包含基于细胞组分(诸如核糖体)的蛋白的体外表达。
61.本公开内容的细菌细胞包括、但不限于埃希氏菌属种（escherichia spp.）、链霉菌属种（streptomyces spp.）、发酵单胞菌属种（zymomonas spp.）、醋杆菌属种（acetobacter spp.）、柠檬酸杆菌属种（citrobacter spp.）、集胞蓝细菌属种（synechocystis spp.）、根瘤菌属种（rhizobium spp.）、梭菌属种（clostridium spp.）、棒杆菌属种（corynebacterium spp.）、链球菌属种（streptococcus spp.）、黄单胞菌属种（xanthomonas spp.）、乳杆菌属种（lactobacillus spp.）、乳球菌属种（lactococcus spp.）、芽孢杆菌属种（bacillus spp.）、产碱菌属种（alcaligenes spp.）、假单胞菌属种（pseudomonas spp.）、气单胞菌属种（aeromonas spp.）、固氮菌属种（azotobacter spp.）、丛毛单胞菌属种（comamonas spp.）、分枝杆菌属种（mycobacterium spp.）、红球菌属种（rhodococcus spp.）、葡糖杆菌属种（gluconobacter spp.）、罗尔斯通氏菌属种（ralstonia spp.）、酸硫杆菌属种（acidithiobacillus spp.）、小月菌属种（microlunatus spp.）、地杆菌属种（geobacter spp.）、地芽孢杆菌属种（geobacillus spp.）、节杆菌属种（arthrobacter spp.）、黄杆菌属种（flavobacterium spp.）、沙雷氏菌属种（serratia spp.）、糖多孢菌属种（saccharopolyspora spp.）、栖热菌属种（thermus spp.）、寡养单胞菌属种（stenotrophomonas spp.）、色杆菌属种（chromobacterium spp.）、中华根瘤菌属种（sinorhizobium spp.）、糖多孢菌属种（saccharopolyspora spp.）、土壤杆菌属种（agrobacterium spp.）、泛菌属种（pantoea spp.）和需钠弧菌（vibrio natriegens）。
62.本公开内容的酵母细胞包括、但不限于经工程改造的酵母属种（saccharomyces spp.）、裂殖酵母属（schizosaccharomyces）、汉逊酵母属（hansenula）、假丝酵母属（candida）、克鲁维酵母属（kluyveromyces）、子囊菌酵母属（yarrowia）、博伊丁假丝酵母（candida boidinii）和毕赤酵母属（pichia）。根据本公开内容，如本文所要求保护的酵母是被归类为真菌界的成员的真核单细胞微生物。酵母是由多细胞祖先进化而来的单细胞生物体，但是其中可用于本公开内容的一些物种是具有以下能力的那些物种：通过形成被称为伪菌丝或假菌丝的连接的芽殖细胞串而发展出多细胞特征。
63.在某些实施方案中，从表达cyp450的细胞系统收获细胞沉淀物。在某些实施方案中，细胞沉淀物可以以各种浓度重新悬浮。在某些实施方案中，细胞沉淀物以1 g/l至250 g/l的浓度重新悬浮。在某些实施方案中，从细胞系统收获的细胞沉淀物以1 g/l、10 g/l、25 g/l、50 g/l、75 g/l、100 g/l、125 g/l、150 g/l、175 g/l、200 g/l、225 g/l或250 g/l的浓度重新悬浮。
64.细胞培养物细胞培养物表示在培养中的任何一个或多个细胞。培养是其中使细胞在受控条件下(通常在其自然环境之外)生长的过程。例如，细胞(诸如酵母细胞)可以作为在液体营养发酵液中的细胞悬浮液生长。细胞培养物包括、但不限于细菌细胞培养物、酵母细胞培养物、植物细胞培养物和动物细胞培养物。在某些实施方案中，细胞培养物包含细菌细胞、酵母细胞或其组合。
65.本公开内容的细菌细胞培养物包含细菌细胞，包括、但不限于埃希氏菌属种（escherichia spp.）、链霉菌属种（streptomyces spp.）、发酵单胞菌属种（zymomonas spp.）、醋杆菌属种（acetobacter spp.）、柠檬酸杆菌属种（citrobacter spp.）、集胞蓝细菌属种（synechocystis spp.）、根瘤菌属种（rhizobium spp.）、梭菌属种（clostridium spp.）、棒杆菌属种（corynebacterium spp.）、链球菌属种（streptococcus spp.）、黄单胞菌属种（xanthomonas spp.）、乳杆菌属种（lactobacillus spp.）、乳球菌属种（lactococcus spp.）、芽孢杆菌属种（bacillus spp.）、产碱菌属种（alcaligenes spp.）、假单胞菌属种（pseudomonas spp.）、气单胞菌属种（aeromonas spp.）、固氮菌属种（azotobacter spp.）、丛毛单胞菌属种（comamonas spp.）、分枝杆菌属种（mycobacterium spp.）、红球菌属种（rhodococcus spp.）、葡糖杆菌属种（gluconobacter spp.）、罗尔斯通氏菌属种（ralstonia spp.）、酸硫杆菌属种（acidithiobacillus spp.）、小月菌属种（microlunatus spp.）、地杆菌属种（geobacter spp.）、地芽孢杆菌属种（geobacillus spp.）、节杆菌属种（arthrobacter spp.）、黄杆菌属种（flavobacterium spp.）、沙雷氏菌属种（serratia spp.）、糖多孢菌属种（saccharopolyspora spp.）、栖热菌属种（thermus spp.）、寡养单胞菌属种（stenotrophomonas spp.）、色杆菌属种（chromobacterium spp.）、中华根瘤菌属种（sinorhizobium spp.）、糖多孢菌属种（saccharopolyspora spp.）、土壤杆菌属种（agrobacterium spp.）、泛菌属种（pantoea spp）和需钠弧菌（vibrio natriegens）。
66.本公开内容的酵母细胞培养物包含酵母细胞，包括、但不限于酵母属种（saccharomyces spp.）、裂殖酵母属（schizosaccharomyces）、汉逊酵母属（hansenula）、假丝酵母属（candida）、克鲁维酵母属（kluyveromyces）、子囊菌酵母属（yarrowia）、博伊丁假丝酵母（candida boidinii）和毕赤酵母属（pichia）。
67.在某些实施方案中，使如本文中所述的细胞培养物与如本文中所述的羟基脂肪酸接触。在某些实施方案中，使如本文中所述的细胞培养物与如本文中所述的羟基脂肪酸和玉米浆接触，例如，以1:1的羟基脂肪酸:玉米浆的比率。
68.在某些实施方案中，在16℃至40℃的温度培养细胞。例如，可以在16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃的温度培养细胞。
69.在某些实施方案中，将细胞培养0.5小时至96小时或更长的时间段。例如，可以将细胞培养12、18、24、30、36、42、48、54、60、66或72小时的时间段。通常，将细胞（诸如细菌细胞）培养12
‑
24小时的时间段。在某些实施方案中，将细胞在37℃的温度培养12
‑
24小时。在某些实施方案中，将细胞在16℃的温度培养12
‑
24小时。
70.在某些实施方案中，将细胞培养到1 x 10
8 (od
600
< 1)至2 x 10
11 (od ~ 200)个
活细胞/ml细胞培养基的密度。在某些实施方案中，将细胞培养至1 x 108、2 x 108、3 x 108、4 x 108、5 x 108、6 x 108、7 x 108、8 x 108、9 x 108、1 x 109、2 x 109、3 x 109、4 x 109、5 x 109、6 x 109、7 x 109、8 x 109、9 x 109、1 x 10
10
、2 x 10
10
、3 x 10
10
、4 x 10
10
、5 x 10
10
、6 x 10
10
、7 x 10
10
、8 x 10
10
、9 x 10
10
、1 x 10
11
或2 x 10
11
个活细胞/ml的密度。(换算因子：od 1 = 8 x 108个细胞/ml)。
71.内酯内酯是含有1
‑
氧杂环烷烃
‑2‑
酮结构(
‑
(c=0)
‑0‑
)的环状羧酸酯或由分子内酯化形成的类似物。本发明涉及由直链羟基羧酸形成的内酯（例如，γ
‑
内酯和δ
‑
内酯），其中羟基已经与酸基反应以形成环状羧酸酯。
72.通过在母体酸名称的末尾添加术语“内酯”而得出内酯的国际纯粹与应用化学联合会(international union of pure and applied chemistry，iupac)名称。内酯的通用名称比iupac名称更常用，是通过将以羟酸结尾的酸更改为内酯而形成。希腊字母表示带有羟基的碳原子以封闭母体羟基羧酸中的环。换而言之，希腊字母前缀指定杂环中的碳原子数目—也就是说，相关
‑
oh和
‑
cooh基团之间沿着母体羟基羧酸的所述主链的距离。在母体化合物上的
‑
cooh基团中的碳之后的第一个碳原子标记为a，第二个将标记为β，依此类推。因此，希腊字母前缀也指示内酯环的大小：a
‑
内酯= 3
‑
元环，β
‑
内酯= 4
‑
元环，y
‑
内酯= 5
‑
元环；和δ
‑
内酯= 6
‑
元环。
73.为了说明，由γ
‑
羟基丁酸的环化得到的内酯被称为4
‑
羟基丁酸内酯或y
‑
丁内酯。类似地，5
‑
羟基戊酸被称为δ
‑
羟基戊酸，并且相应的内酯被称为5
‑
羟基戊酸内酯或δ
‑
戊内酯。
74.羟基直链脂肪酸和亚末端羟基直链脂肪酸由在末端包含羧基(
‑
cooh)的直烃链组成。正是这种羧酸基团的存在使这种化学实体成为酸。直链脂肪酸可以任选地具有在碳原子之间的不饱和键。支链脂肪酸通常是具有在碳链上被取代的一个或多个烷基支链的饱和脂肪酸。
75.连接到直链脂肪酸的烃主链的一个或多个氢原子也可以被羟基(
‑
oh)基团替换。具有一个或多个羟基的直链羧酸称为羟基羧酸。蓖麻油酸是一种天然存在的羟基羧酸。
76.本发明涉及使用表达具有羟化酶酶活性的重组蛋白的重组微生物生物体用羟基替换或置换饱和直链脂肪酸中的氢原子。在一个优选的实施方案中，羟基的置换发生在最靠近直链脂肪酸的末端甲基端基的
‑
ch2
‑
基团之一处。在一般术语中，n或ω表示直链脂肪酸的甲基端基，而数字ω
‑
x的n
ꢀ‑
x表示碳原子在主链上的位置，其中x指示距离甲基端基的碳的数目。为了说明，在硬脂酸(或十八烷酸，具有式ch3(ch2)i6cooh的c18:0直链脂肪酸)的例子中，ω
‑
3是指主链中的第十五个碳，它是从甲基端基除去三个碳。类似地，在同一个例子中，ω
‑
i是指主链中的第十七个碳，它是从甲基端基中除去一个碳。
77.如在本发明中所用的，当使用根据本发明的重组dna技术将羟基引入直链脂肪酸中、特别是在位置ω
‑
1、ω
‑
2和ω
‑
3时，得到的羟基化的直链脂肪酸分子被称作亚末端羟基脂肪酸，且在这样的脂肪酸分子中的位置ω
‑
1、ω
‑
2和ω
‑
3处的羟基被称作亚末端羟基。
78.li微生物培养基可用于本发明中的微生物生物体，包括野生型和重组的细菌、酵母和真菌菌株在
特定培养基中生长。微生物培养基可以是最低限度的生长培养基或丰富的生长培养基。最低限度的生长培养基包含无机化合物和一种或多种有机营养物诸如葡萄糖、蔗糖或甘油的强化混合物。丰富的生长培养基包含酵母浸出物、蛋白胨和有机营养物诸如右旋糖、蔗糖或甘油。在优选的实施方案中，丰富的生长培养基补充了玉米浆以增强微生物生物体的生长。
79.合成生物学此处使用的标准重组dna和分子克隆技术是本领域众所周知的，并且描述于例如sambrook, j., fritsch, e.f.和maniatis, t.molecular cloning: a laboratory manual, 第2版; cold spring harbor laboratory: cold spring harbor, n.y., 1989 (在下文中称作“maniatis”)；和silhavy, t.j., bennan, m.l.和enquist, l.w.experiments with gene fusions; cold spring harbor laboratory: cold spring harbor, n.y., 1984；和ausubel, f.m.等人, in current protocols in molecular biology, greene publishing and wiley
‑
interscience出版, 1987；(它们中的每篇的整个内容特此通过引用并入本文)。
80.细菌生产系统原核生物中蛋白的表达最经常用载体在细菌宿主细胞中进行，所述载体含有指导融合或非融合蛋白的表达的组成型或诱导型启动子。融合载体将许多氨基酸添加到在其中编码的蛋白，通常添加到重组蛋白的氨基末端。这样的融合载体通常用于三个目的：l)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解度；以及3)通过在亲和纯化中充当配体来帮助重组蛋白的纯化。通常，在融合部分和重组蛋白的连接处引入蛋白水解切割位点，以使得在融合蛋白纯化后重组蛋白能够与融合部分分离。这样的载体是在本公开内容的范围内。
81.在一个实施方案中，表达载体包括用于在细菌细胞中表达重组多肽的那些遗传元件。用于在细菌细胞中转录和翻译的元件可以包括启动子、蛋白复合物的编码区和转录终止子。
82.本领域普通技术人员将知道可用于制备表达载体的分子生物学技术。如上所述，通过常规技术诸如聚合酶链式反应(pcr)，可以制备用于掺入主题技术的表达载体中的多核苷酸。
83.已经开发了许多分子生物学技术来经由互补粘性末端将dna可操作地连接至载体。在一个实施方案中，可以将互补同聚物束添加到待插入载体dna中的核酸分子。然后使载体和核酸分子通过互补同聚物尾巴之间的氢键合连接以形成重组dna分子。
84.在一个替代实施方案中，使用含有一个或多个限制位点的合成接头将主题技术的多核苷酸可操作地连接至表达载体。在一个实施方案中，通过限制性内切核酸酶消化产生多核苷酸。在一个实施方案中，将核酸分子用细菌噬菌体t4 dna聚合酶或大肠杆菌dna聚合酶i处理，所述酶利用其3'
‑
5'
‑
核酸外切活性除去突出的3'
‑
单链末端，并且利用其聚合活性填充凹陷的3'
‑
末端，从而产生平端dna片段。随后在能够催化平端dna分子的连接的酶（诸如细菌噬菌体t4 dna连接酶）存在下，将平端区段与大摩尔过量的接头分子一起温育。因此，反应产物是在其末端携带聚合物接头序列的多核苷酸。然后将这些多核苷酸用适当的限制酶切割并连接至表达载体，所述表达载体已经用产生与所述多核苷酸的末端相容的末端的酶切割。
85.可替换地，可以使用具有连接非依赖性克隆(lic)位点的载体。然后可以将所需的
pcr扩增的多核苷酸克隆进lic载体，而无需限制酶切消化或连接(aslanidis和de jong, nucl. acid. res. 18 6069
‑
74, (1990), haun, 等人, biotechniques 13, 515
‑
18 (1992)，其以它与本文一致的程度通过引用并入本文)。
86.在一个实施方案中，为了分离和/或修饰用于插入到所选质粒中的感兴趣的多核苷酸，使用pcr是合适的。可以设计用于序列的pcr制备的适当引物，以分离核酸分子的所需编码区、添加限制性内切核酸酶或lic位点、以及将编码区置于期望的读码框中。
87.在一个实施方案中，通过使用pcr，使用适当的寡核苷酸引物制备用于掺入主题技术的表达载体中的多核苷酸。扩增编码区，同时引物本身被掺入扩增的序列产物中。在一个实施方案中，扩增引物含有限制性内切核酸酶识别位点，其允许将扩增的序列产物克隆进适当的载体中。
88.通过常规转化或转染技术，可以将表达载体引入植物或微生物宿主细胞。通过本领域已知的方法完成用主题技术的表达载体对适当细胞的转化，并且通常取决于载体和细胞的类型。合适的技术包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、deae
‑
葡聚糖介导的转染、脂转染、化学穿孔或电穿孔。
89.通过本领域众所周知的技术，可以鉴定成功转化的细胞，即含有表达载体的那些细胞。例如，可以培养用主题技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。通过本领域众所周知的技术，可以检查细胞中表达载体dna的存在。
90.宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，或可替换地含有表达载体的多个拷贝。
91.在某些实施方案中，经转化的细胞是动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞或酵母细胞。在某些实施方案中，所述细胞是选自以下的植物细胞：芸苔植物细胞、油菜籽植物细胞、棕榈植物细胞、向日葵植物细胞、棉花植物细胞、玉米植物细胞、花生植物细胞、亚麻植物细胞、芝麻植物细胞、大豆植物细胞和碧冬茄植物细胞。
92.微生物宿主细胞表达系统和含有指导外源蛋白的高水平表达的调节序列的表达载体是本领域技术人员众所周知的。这些中的任何一种都可用于构建用于在微生物宿主细胞中表达主题技术的重组多肽的载体。然后可以将这些载体经由转化引入适当的微生物中，以允许主题技术的重组多肽的高水平表达。
93.可用于转化合适的微生物宿主细胞的载体或盒(cassettes)是本领域众所周知的。通常，载体或盒含有指导相关多核苷酸的转录和翻译的序列、可选标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含携带转录起始控制的多核苷酸的5'区域和控制转录终止的dna片段的3'区域。优选的是，两个控制区都源自与转化的宿主细胞同源的基因，尽管应当理解，这样的控制区不需要源自被选作宿主的特定物种的天然基因。
94.可用于驱动重组多肽在期望的微生物宿主细胞中表达的起始控制区或启动子是众多的，并且是本领域技术人员所熟悉的。实际上，能够驱动这些基因的任何启动子都适合用于主题技术，包括、但不限于cyci、his3、gali、galio、adhi、pgk、ph05、gapdh、adci、trpi、ura3、leu2、eno、tpi (可用于在酵母属中表达)；aoxi(可用于在毕赤酵母属中表达)；以及lac、trp、jpl、ipr、t7、tac和trc (可用于在大肠杆菌中表达)。
95.终止控制区也可源自微生物宿主天然的各种基因。对于本文所述的微生物宿主，可以任选地包括终止位点。
biology 48:443
‑
53, 1970)来寻找使匹配数最大化并使缺口数最小化的两个序列的比对。“bestfit”使用smith和waterman的局部同源性算法(smith和waterman，advances in applied mathematics, 2:482
‑
489, 1981, smith等人, nucleic acids research 11:2205
‑
2220, 1983)来进行两个序列之间最佳相似性区段的最佳比对，并且插入缺口以使匹配数最大化。最优选地使用“best fit”程序来确定同一性百分比。
101.可用于确定序列同一性的方法还公开于基本局部比对检索工具(basic local alignment search tool，blast)程序，所述程序可从national library of medicine, national institute of health, bethesda, md.20894的national center biotechnology information (ncbi)公开获得；参见blast manual, altschul等人, ncbi, nlm, nih; altschul等人, j. mol. biol. 215:403
‑
10 (1990)；blast程序的2.0版或更高版本允许将缺口(缺失和插入)引入比对中；对于肽序列，blastx可以用于确定序列同一性；并且，对于多核苷酸序列，blastn可以用于确定序列同一性。
102.本文中使用的术语“实质序列同一性百分比”表示以下序列同一性百分比：至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约85%同一性、至少约90%序列同一性或甚至更大序列同一性，诸如约98%或约99%序列同一性。因此，本公开内容的一个实施方案是多核苷酸分子，其与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70%序列同一性、至少约80%序列同一性、至少约85%同一性、至少约90%序列同一性或甚至更大序列同一性，诸如约98%或约99%序列同一性。具有本公开内容的细胞色素p450基因的活性的多核苷酸分子能够指导多种γ
‑
内酯和δ
‑
内酯的产生。这样的多核苷酸分子可以与本文所提供的多核苷酸序列具有实质序列同一性百分比，并且被涵盖在本公开内容的范围内。
103.同一性和相似性同一性是在序列比对(其可仅使用序列信息或结构信息或一些其它信息进行，但通常它仅基于序列信息)后在一对序列之间相同的氨基酸的分数，而相似性是基于使用一些相似性矩阵的比对指定的评分。相似性指数可以是以下blosum62、pam250或gonnet中的任一个，或者本领域技术人员进行蛋白的序列比对所用的任何矩阵。
104.同一性是两个子序列之间一致性的程度(在序列之间没有缺口)。25％或更高的同一性暗示功能的相似性，而18％至25％暗示结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关的或随机的序列(其为多于100个残基)可以具有高于20%同一性。相似性是当对比两个序列时所述序列之间相似性的程度。这依赖于它们的同一性。
105.本文使用的术语的解释：“编码序列”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示编码特定氨基酸序列的dna序列。
[0106]“蛋白表达”。蛋白生产可以发生在基因表达以后。它由dna已经转录为信使rna (mrna)以后的阶段组成。然后将mrna翻译成多肽链，其最终折叠成蛋白。dna通过转染存在于细胞中，所述转染是有意地将核酸引入细胞中的过程。该术语经常用于真核细胞中的非病毒方法。它也可能表示其它方法和细胞类型，尽管其它术语是优选的：“转化”更常用于描述细菌、非动物真核细胞（包括植物细胞）中的非病毒dna转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化也用于表示在这些细胞中进展为癌性状态（致癌作用）。转导经常用于描述病毒介导的dna转移。在本技术的转染的定义下包括转化、转导和病毒感染。
[0107]
本文中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。
[0108]
就在说明书或权利要求书中使用的术语“包括”、“具有”等而言，这样的术语意图以类似于术语“包含”的方式具有包含性，如同“包含”当在权利要求书中用作过渡词时所解释的那样。
[0109]
词语“示例性的”在本文中用于表示“用作例子、实例或说明”。本文中被描述为“示例性的”任何实施方案不一定被解释为比其它实施方案优选或有利。
[0110]
术语“互补的”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于dna，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，主题技术还包括与所附序列表中报告的完整序列互补的分离的核酸片段以及那些基本上相似的核酸序列。
[0111]
术语“核酸”和“核苷酸”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言各自普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及它们的聚合物。除非特别限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有与参考核酸相似的结合性能并且以与天然存在的核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列也隐含地涵盖其保守地修饰的或简并的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列，以及明确指出的序列。
[0112]
术语“分离的”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且当用于分离的核酸或分离的多肽的上下文中时，非限制性地用于表示人为地存在于其天然环境之外并且因此不是自然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如存在于转基因宿主细胞中。
[0113]
术语“简并变体”表示具有与参考核酸序列相差一个或多个简并密码子置换的残基序列的核酸序列。简并密码子置换可以通过生成这样的序列来实现：其中一个或多个所选择的(或全部)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基置换。核酸序列及所有其简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。
[0114]
术语“多肽”、“蛋白”和“肽”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言各自普通和常规的含义；这三个术语有时互换使用，并且非限制性地用于表示氨基酸或氨基酸类似物的聚合物，无论其大小或功能如何。尽管“蛋白”经常用于指相对大的多肽，而“肽”经常用于指小的多肽，但这些术语在本领域中的使用会重叠和变化。除非另外指出，否则本文中使用的术语“多肽”表示肽、多肽和蛋白。当表示多核苷酸产物时，术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互换地使用。因此，示例性多肽包括多核苷酸产物、天然存在的蛋白、同系物、直系同源物、旁系同源物、前述物质的片段和其它等同物、变体和类似物。
[0115]
术语“多肽片段”和“片段”在关于参考多肽使用时，应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示这样的多肽：其中与参考多肽本身相比缺失氨基酸残基，但是其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的相应位置相同。这样的缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端，或可替换地在两者处。
[0116]
术语多肽或蛋白的“功能片段”表示这样的肽片段：其为全长多肽或蛋白的一部分，并且具有与全长多肽或蛋白基本上相同的生物活性，或执行与全长多肽或蛋白基本上相同的功能(例如，实现相同的酶反应)。
[0117]
可互换使用的术语“变体多肽”、“经修饰的氨基酸序列”或“经修饰的多肽”表示与参考多肽相差一个或多个氨基酸(例如，一个或多个氨基酸置换、缺失和/或添加)的氨基酸序列。在一个方面，变体是保留了参考多肽的一些或全部能力的“功能变体”。
[0118]
术语“功能变体”进一步包括保守置换的变体。术语“保守置换的变体”表示具有与参考肽相差一个或多个保守氨基酸置换并且保持参考肽的一些或全部活性的氨基酸序列的肽。“保守氨基酸置换”是用功能相似的残基置换氨基酸残基。保守置换的例子包括：用一个非极性的(疏水的)残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个；用一个带电的或极性的（亲水的）残基置换另一个，诸如在精氨酸和赖氨酸之间、在谷氨酰胺和天冬酰胺之间、在苏氨酸和丝氨酸之间；用一个碱性残基诸如赖氨酸或精氨酸置换另一个；或用一个酸性残基诸如天冬氨酸或谷氨酸置换另一个；或用一个芳族残基诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸置换另一个。预期这样的置换对蛋白或多肽的表观分子量或等电点几乎没有影响或没有影响。短语“保守置换的变体”还包括其中残基被化学衍生的残基替代的肽，前提条件是，所得的肽保持如本文所述的参考肽的一些或全部活性。
[0119]
与主题技术的多肽相关的术语“变体”进一步包括与参考多肽的氨基酸序列具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%同一性的氨基酸序列的功能活性多肽。
[0120]
术语“同源的”以所有它的语法形式和拼写变化表示具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包括来自超家族的多核苷酸或多肽以及来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白(reeck等人, cell 50:667, 1987)。这样的多核苷酸或多肽具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面还是在保守位置处存在特定氨基酸或基序方面。例如，两个同源多肽可以具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少900至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和甚至100%同一性的氨基酸序列。
[0121]“合适的调节序列”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示这样的核苷酸序列：其位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部、或下游(3'非编码序列)，并且其影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性、或者翻译。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
[0122]“启动子”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示能够控制编码序列或功能性rna的表达的dna序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'侧。启动子可以以其整体源自天然基因，或者由源自在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或者甚至包含合成的dna区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件的基因表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的精确边界尚未完全确定，因此不同长度的dna片段可能具有相同的启动子活性。
[0123]
术语“可操作地连接”表示核酸序列在单个核酸片段上的结合，使得一个的功能受
另一个影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列处于启动子的转录控制下)时，该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以以有义或反义方向可操作地连接至调节序列。
[0124]
本文中使用的术语“表达”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示源自主题技术的核酸片段的有义(mrna)或反义rna的转录和稳定积累。“过表达”表示在转基因或重组生物体中产生的基因产物超过了在正常或非转化生物体中的产生水平。
[0125]“转化”应当被赋予其对于本领域的合适技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示将多核苷酸转移到靶细胞中以便由该细胞进一步表达。转移的多核苷酸可以掺入靶细胞的基因组或染色体dna中，从而产生遗传稳定的遗传特性，或者它可以独立于宿主染色体进行复制。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。
[0126]
当在本文中与宿主细胞结合使用时，术语“转化的”、“转基因的”和“重组的”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言各自普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示已经向其中引入异源核酸分子的宿主生物体的细胞，诸如植物或微生物细胞。所述核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者所述核酸分子可以作为染色体外分子存在。这样的染色体外分子可以自我复制。转化的细胞、组织或受试者应理解为不仅涵盖转化过程的终产物，而且涵盖其转基因后代。
[0127]
当在本文中与多核苷酸结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”应当赋予其对本领域普通技术人员而言普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示这样的多核苷酸(例如，dna序列或基因)：其源自对特定宿主细胞而言为外源的来源，或者如果源自相同来源，从其原始形式被修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括这样的基因：其对特定宿主细胞而言为内源的，但已经被修饰，例如通过使用定位诱变或其它重组技术。该术语还包括天然存在的dna序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语表示这样的dna区段：其对细胞而言为外源的或异源的，或对细胞而言为同源的，但在宿主细胞内以通常不会发现该元件的位置或形式存在。
[0128]
类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”是指这样的多肽或氨基酸序列：其源自对特定宿主细胞而言为外源的来源，或者如果源自相同来源，从其原始形式被修饰。因此，重组dna区段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。
[0129]
术语“质粒”、“载体”和“盒”应当被赋予其对本领域普通技术人员而言各自普通和常规的含义，并且非限制性地用于表示经常携带不是细胞的中心代谢的一部分的基因并且通常为环状双链dna分子的形式的染色体外元件。这样的元件可以是源自任何来源的单链或双链dna或rna的线性或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已被连接或重组成独特的构建体，所述构建体能够将所选择的基因产物的启动子片段和dna序列与适当的3'非翻译序列一起引入细胞中。“转化盒”表示含有外源基因并且除外源基因外还具有促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”表示含有外源基因并且除外源基因外还具有允许该基因在外源宿主中的增强表达的元件的特定载体。
[0130]
本文中使用的术语“细胞系统”表示提供异位蛋白表达的任何细胞。在某些实施方案中，所述细胞系统包含细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞系统包含原核细胞和/或真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞系统包含基于细胞组分（诸如核糖体）的蛋白的体外表达。
[0131]
本文中使用的术语“细胞培养物”表示包含细胞的组合物。在某些实施方案中，所述细胞培养物是液体(例如，发酵液培养物)。在某些实施方案中，所述细胞培养物是固体(例如，刺植培养物)。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含细菌细胞、酵母细胞、植物细胞和动物细胞。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含原核细胞和/或真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞培养物包含基于细胞组分（诸如核糖体）的蛋白的体外表达。
[0132]
本文中使用的术语“温育”(“incubating”和“incubation”)表示，将两种或更多种化学或生物实体（诸如化学化合物和酶）混合并允许它们在有利于产生新化学实体（诸如如本文中所述的羟基脂肪酸（例如，亚末端羟基脂肪酸）或如本文中所述的内酯（例如，γ
‑
内酯、δ
‑
内酯或其组合））的条件下相互作用的过程。
[0133]
与主题技术的变体多肽序列相关的“氨基酸序列同一性百分比(%)”表示在比对所述序列后，候选序列中与参考多肽的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，和如果必要的话引入间隙以实现最大序列同一性百分比，且不考虑任何保守置换作为序列同一性的一部分。
[0134]
用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术中的多种方式实现，例如，使用公众可得到的计算机软件诸如blast、blast
‑
2、align、align
‑
2或megalign (dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括达到在被对比的序列的全长上的最大比对所需的任何算法。例如，使用序列对比程序ncbi
‑
blast2可以确定氨基酸序列同一性百分比。ncbi
‑
blast2序列对比程序可以从ncbi.nlm.nih.gov下载。ncbi blast2使用若干搜索参数，其中那些搜索参数全部都被设定为默认值，包括例如去掩蔽(unmask)“是”，链=所有，预期发生10，最小低复杂度长度=15/5，多程e
‑
值=0.01，多程常数=25，最终缺口比对的下降值=25，以及评分矩阵=blosum62。在采用ncbi
‑
blast2进行氨基酸序列对比的情况下，如下计算给定氨基酸序列a相对、与、或针对给定氨基酸序列b的%氨基酸序列同一性(其可以可替换地叙述为相对、与、或针对给定氨基酸序列b具有或包含特定%氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)：100
×
分数x/y，其中x是通过序列比对程序ncbi
‑
blast2在该程序的a和b的比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，并且其中y是b中的氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度的情况下，a相对b的%氨基酸序列同一性将不等于b相对a的%氨基酸序列同一性。
[0135]
在这个意义上，用于确定氨基酸序列“相似性”的技术是本领域众所周知的。一般而言，“相似性”表示两个或更多个多肽在适当位置处的氨基酸与氨基酸的精确对比，其中氨基酸是相同的或具有相似的化学性能和/或物理性能，诸如电荷或疏水性。然后可以确定所对比的多肽序列之间的所谓的“相似性百分比”。用于确定核酸和氨基酸序列同一性的技术也是本领域众所周知的，并包括确定该基因的mrna的核苷酸序列(通常经由cdna中间体)并确定在其中编码的氨基酸序列，并将其与第二氨基酸序列对比。一般而言，“同一性”表示两个多核苷酸或多肽序列分别的核苷酸与核苷酸或氨基酸与氨基酸的精确对应性。两个或
更多个多核苷酸序列可以通过确定它们的“同一性百分比”进行对比，两个或更多个氨基酸序列也是如此。在wisconsin sequence analysis package第8版(可得自genetics computer group, madison, wis.)中可得到的程序(例如，gap程序)能够分别计算两个多核苷酸之间的同一性以及两个多肽序列之间的同一性和相似性。用于计算序列之间的同一性或相似性的其它程序是本领域的技术人员已知的。
[0136]“对应于”参考位置的氨基酸位置表示与参考序列比对的位置，如通过比对氨基酸序列所鉴定的。这样的比对可以手工进行或通过使用众所周知的序列比对程序诸如clustalw2、blast 2等进行。
[0137]
除非另有说明，否则两个多肽或多核苷酸序列的同一性百分比表示在两个序列中的较短者的整个长度上相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。
[0138]“转化”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规的含义使用，并且非限制性地用于表示多核苷酸向靶细胞中的转移。转移的多核苷酸可以掺入靶细胞的基因组或染色体dna中，从而产生遗传稳定的遗传特性，或者它可以独立于宿主染色体进行复制。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“重组的”或“转化的”生物体。
[0139]
当在本文中与多核苷酸结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”根据本领域普通技术人员所理解的其普通和常规的含义使用，并且非限制性地用于表示这样的多核苷酸(例如，dna序列或基因)：其源自对特定宿主细胞而言为外源的来源，或者如果源自相同来源，从其原始形式被修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包括这样的基因：其对特定宿主细胞而言为内源的，但已经被修饰，例如通过使用定位诱变或其它重组技术。该术语还包括天然存在的dna序列的非天然存在的多个拷贝。因此，该术语表示这样的dna区段：其对细胞而言为外源的或异源的，或对细胞而言为同源的，但在宿主细胞内以通常不会发现该元件的位置或形式存在。
[0140]
类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”是指这样的多肽或氨基酸序列：其源自对特定宿主细胞而言为外源的来源，或者如果源自相同来源，从其原始形式被修饰。因此，重组dna区段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。
[0141]
除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在本公开内容的实践或试验中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和物质，但下文描述了优选的物质和方法。
[0142]
在考虑以下非限制性实施例后将更充分地理解本公开内容。应当理解，这些实施例虽然指示了主题技术的优选实施方案，但仅以举例说明的方式给出。从以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定主题技术的必要特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以做出主题技术的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。
[0143]
本说明书公开的所有特征都可以以任何组合形式合并。在本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代特征替换。因此，除非另有明确陈述，公开的每个特征都仅仅是总的一系列等价物或类似特征的一个例子。从以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本公开内容的必要特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以做出本公开内容的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其它实施方案也在权利要求内。
[0144]
等同方案和范围本领域技术人员会认识到或能够使用不超过例行实验确定本文描述的具体实施方案的许多等同方案。本文描述的本实施方案的范围无意限于以上描述，而是如所附权利要求所述。本领域普通技术人员会明白，在不脱离如以下权利要求所限定的本公开内容的精神或范围的情况下，可以做出对本说明书的各种变化和修改。
[0145]
除非明确地相反指出，否则如本文在说明书中和在权利要求中使用的不定冠词“一个/种（a）”和“一种/个（an）”应当被理解为是指“至少一个/种”。
[0146]
如本文在说明书中和在权利要求中使用的短语“和/或”应当被理解为是指如此结合的要素（即，在某些情况下结合地存在和在其它情况下分离地存在的要素）中的“任一个或二者”。用“和/或”列出的多个要素应以相同方式解释，即如此连接的要素中的“一个或多个”。除了由“和/或”条款具体地标识的要素之外可以任选地存在其它要素，无论与具体地标识的那些要素有关还是无关。因而，作为一个非限制性例子，当与开放式语言诸如“包含”结合使用时，对“a和/或b”的提及可以在一个实施方案中表示仅a（任选地包括除了b以外的要素）；在另一个实施方案中，表示仅b (任选地包括除了a以外的要素)；在另一个实施方案中，表示a和b (任选地包括其它要素)；等。
[0147]
如本文在说明书中和在权利要求中使用的，“或”应当理解为具有与如上定义的“和/或”相同的含义。例如，当分隔列表中的项目时，“或”或“和/或”应当解释为包含性的，即，包括数字或要素列表中的至少一个，但是也包括超过一个，且任选地包括另外的未列出的项目。清楚地指出相反含义的仅有性术语，诸如
“……
中的仅一个”或
“……
中的刚好一个”，或者，当在权利要求中使用时，“由
……
组成”，将表示包括数字或要素列表中的刚好一个要素。一般而言，当前面存在排它性术语（诸如“任一个”、
“……
之一”、
“……
中的仅一个”或
“……
中的刚好一个”）时，本文使用的术语“或”仅应被解释为指示排它性备选物（即“一个或另一个，但非两个”）。当在权利要求中使用时，“基本上由
……
组成”应具有在专利法领域中使用的其普通含义。
[0148]
如本文在说明书中和在权利要求中使用的，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当被理解为是指至少一个选自要素列表中的任意一个或多个要素的要素，但不一定包括在所述要素列表内具体地列出的每个和每一个要素中的至少一个，且不排除所述要素列表中的要素的任意组合。该定义还允许除了在短语“至少一个”所指的要素列表中具体地标识的要素之外的要素可以任选地存在，无论与具体地标识的那些要素有关还是无关。因而，作为一个非限制性例子，“a和b中的至少一个”（或等效地“a或b中的至少一个”，或等效地“a和/或b中的至少一个”）可以在一个实施方案中表示至少一个（任选地包括超过一个）a，且不存在b (且任选地包括除了b以外的要素)；在另一个实施方案中，表示至少一个（任选地包括超过一个）b，且不存在a (且任选地包括除了a以外的要素)；在另一个实施方案中，表示至少一个（任选地包括超过一个）a，和至少一个（任选地包括超过一个）b (且任选地包括其它要素)；等。
[0149]
还应当理解，除非明确地相反指出，否则在本文要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的次序不一定限于列举所述方法的步骤或动作的次序。
[0150]
在权利要求中以及在上述说明书中，所有过渡短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、
“
具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由
……
构成”等应当理解为开放式的，即，意在包括、但不限于。仅过渡短语“由
……
组成”和“基本上由
……
组成”应当分别是封闭式或半封闭式过渡短语，如在美国专利局专利审查程序手册（united states patent office manual of patent examining procedures）第2111.03部分中所述。应当理解，在替代实施方案中，在本文件中使用开放式过渡短语（例如，“包含”）描述的实施方案也被涵盖为“由开放式过渡短语所描述的特征组成”和”基本上由开放式过渡短语所描述的特征组成”。例如，如果本公开内容描述了“包含a和b的组合物”，则本公开内容也涵盖替代实施方案“由a和b组成的组合物”和“基本上由a和b组成的组合物”。
[0151]
此外，本公开内容涵盖所有变体、组合和排列，其中将来自一项或多项所列权利要求的一个或多个限制、要素、条款和描述性术语引入另一项权利要求中。例如，从属于另一项权利要求的任何权利要求可以修改为包括在从属于同一基本权利要求的任何其它权利要求中发现的一个或多个限制。在将要素呈现为列表的情况下，例如，以马库什群组格式，还公开了要素的每个亚组，并且可以从群组中移除任何要素。应当理解，一般而言，在本公开内容或本公开内容的方面被称为包含特定要素和/或特征的情况下，本公开内容的某些实施方案或本公开内容的方面由这样的要素和/或特征组成，或基本上由这样的要素和/或特征组成。为简单起见，那些实施方案并未在本文中用这种话具体阐述。还应注意，术语“包含”和“含有”意图是开放的，并且允许包括额外的要素或步骤。在给出范围的情况下，包括端点。此外，除非另外指示或以其它方式从上下文和本领域普通技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可以假设在本公开内容的不同实施方案中在所述范围内的任何具体值或子范围，其精确至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指明。
[0152]
本技术涉及各种期刊文章和其它出版物，它们都通过引用并入本文。本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请关于各自引用的主题通过引用并入，其在某些情况下可以包括所述文件的整体。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则应以说明书为准。此外，属于现有技术的本公开内容的任何特定实施方案可以明确地从任何一项或多项权利要求中排除。因为这样的实施方案被认为是本领域普通技术人员已知的，所以即使在本文中没有明确阐述排除，它们也可以被排除。本公开内容的任何特定实施方案可以出于任何原因从任何权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在相关。
实施例
[0153]
实施例1嗜热毁丝霉cyp505a30和大肠杆菌led的克隆嗜热毁丝霉的bm3同系物（cyp505a30）的氨基酸序列得自uniprot (www.uniprot.org/uniprot/g2qdz3.fasta)，且相应的基因为在大肠杆菌中表达经过密码子优化并由genscript (piscataway, nj)合成。为大肠杆菌表达而密码子优化的来自嗜热毁丝霉的cyp505a30的核苷酸序列提供为seq id no: 1。cyp505a30的氨基酸序列提供为seq id no: 3。
[0154]
将所得基因产物通过ndei和xhoi位点克隆进petduet
‑
1载体(amp

, novagen)中。将构建体转化到bl21(de3)细胞中进行表达。为了增强在大肠杆菌中的cyp505a30活性，将异柠檬酸脱氢酶(icd)介导的nadph再生系统与cyp505a30偶联。使用引物icd
‑
f, 5
’‑
ggaattccatatggaaagtaaagtagttgt (seq id no: 7)和icd
‑
r, 5
’‑
ccgctcgagttacatgttttcgatgatcgcgt (seq id no: 8)通过pcr从大肠杆菌k
‑
12 substr. mg1655的基因组扩增icd基因。来自大肠杆菌k
‑
12 substr. mg1655的icd的核苷酸序列提供为seq id no: 2。对应的氨基酸序列提供为seq id no: 4。
[0155]
将得到的pcr产物通过ndei和xhoi位点亚克隆进pcdfduet
‑
1载体(spect

, novagen)中。该构建体用于转化过表达cyp505a30的bl21(de3)细胞，并在lb(amp

spect

)平板上选择转化体。
[0156]
所得到的载体用于在大肠杆菌细胞中过表达嗜热毁丝霉cyp505a30和大肠杆菌led。
[0157]
实施例2使用过表达嗜热毁丝霉cyp505a30和大肠杆菌led的大肠杆菌细胞生产γ
‑
内酯和δ
‑
内酯本实施例证明了过表达嗜热毁丝霉cyp505a30和大肠杆菌led的大肠杆菌细胞在通过亚末端羟基脂肪酸中间体将短链脂肪酸生物转化成γ
‑
内酯和δ
‑
内酯中的用途。
[0158]
为了从相应的短链脂肪酸产生亚末端(即，ω
‑
1 (co
‑
1)、ω
‑
2 (co
‑
2)和ω
‑
3 (co
‑
3))羟基脂肪酸，将过表达cyp505a30和led的大肠杆菌细胞与包含作为底物的短链脂肪酸的培养基一起温育。
[0159]
在典型的实验中，使用过夜培养物接种含有100 mg/l的羧苄西林和100 mg/l的大观霉素的液体lb培养基(2%)。首先使培养物在37℃下生长至0.6的o
600
并冷却至16℃。然后加入1 mm iptg以诱导蛋白表达。在16℃温育16小时后，通过离心收获细胞。
[0160]
将收获的细胞沉淀物以100 g/l鲜重的浓度重新悬浮在含有0.1%吐温40的100 mm磷酸钾缓冲剂(ph7.0)中。然后加入3 g/l的月桂酸(c12:0)或3 g/l的十三烷酸(c13:0)以及10 g/l的异柠檬酸三钠盐，以在30℃在振荡器中进行生物转化。在不同的反应时间取样并通过gc/fid进行分析。
[0161]
在shimadzu gc
‑
2014系统上进行gc/fid分析。分析柱为restek rxi
‑
5ms (厚度0.25pm；长度30 m；直径0.25 mm)，且在分流模式下注射温度为240℃。温度梯度是0
‑
3分钟，100℃；3
‑
9分钟100℃
‑
280℃，按30的梯度；9
‑
12分钟，280℃。
[0162]
如在图2a和图2b中所示，根据在实施例1中描述的程序修饰的大肠杆菌细胞从对应的羧酸02:0 (十二烷酸，也被称作月桂酸)和03:0 (十三烷酸，也被称作十三烷酸)有效地生产ho
‑
c12:0和ho
‑
c13:0。根据baker等人(2017)，cyp505a30催化在ω
‑
1至ω
‑
3位置处的直链脂肪酸的羟基化。但是，图2a
‑
2b显示单峰，因为在没有衍生化存在下，gc/fid不可分离co
‑
1至co
‑
3羟基脂肪酸。所以，所述峰代表co
‑
1至co
‑
3羟基脂肪酸的混合物。
[0163]
这些结果证明了重新悬浮的过表达嗜热毁丝霉cyp505a30和大肠杆菌led的大肠杆菌细胞从相应的脂肪酸产生co
‑
1至co
‑
3羟基脂肪酸。
[0164]
为了从亚末端羟基脂肪酸生产γ
‑
内酯(5
‑
元环)和δ
‑
内酯(6
‑
元环)，首先从重新悬浮的大肠杆菌细胞分离来自前一步的co
‑
1至co
‑
3羟基脂肪酸的混合物，然后用博伊丁假丝酵母培养物接种。
[0165]
作为从羟基脂肪酸生产内酯的一个例子，将ho
‑
c12:0的混合物和ho
‑
c13:0的混合物分别与60 g/l的玉米浆(csl)以1:1比例混合，并将所得培养基在121℃高压灭菌20分钟。
对于c12:0和c13:0生物转化，将培养基分别命名为cyp505a30c12或cyp505a30c13。然后用过夜酵母培养物（例如，博伊丁假丝酵母）接种培养基，并使酵母培养物在30℃振荡器中生长。接种后每天取样并如本文所述进行分析。
[0166]
为了分析γ
‑
内酯产生，取0.5 ml大肠杆菌培养物并加入10
µ
l 2n hcl。将酸化的培养物用0.5 ml乙酸乙酯在室温振荡萃取60分钟。在14,000 rpm离心15分钟以后，将乙酸乙酯相用于gc/ms或gc/fid分析。
[0167]
在与gcms
‑
qp2010s检测器偶联的shimadzu gc
‑
2010系统上进行gc/ms分析。分析柱为shrxi
‑
5ms (厚度0.25pm；长度30 m；直径0.25 mm)，且在分流模式下注射温度为265℃。温度梯度是0
‑
3分钟80℃；3
‑
8.7分钟120℃至263℃，按25的梯度；8.7
‑
10.7分钟，263℃。
[0168]
如在图3中所示，如果初始开始脂肪酸具有偶数个碳诸如02:0 (十二烷酸，也被称作月桂酸)，那么在酵母中的β
‑
氧化后，预测产物为来自ω
‑
1羟基脂肪酸中间体的δ
‑
己内酯(dc6)、来自ω
‑
2羟基脂肪酸中间体的γ
‑
己内酯(gc6)和来自ω
‑
3羟基脂肪酸中间体的δ
‑
辛内酯(dc8)。这是因为在每一轮β
‑
氧化中，都会从羟基脂肪酸中间体除去2个碳原子。取决于羟基脂肪酸中oh基团的位置，羟基脂肪酸中的羟基化碳原子和羧化碳原子之间可以存在9、8或7个插入碳原子。一旦β
‑
氧化已经除去足够的碳原子对从而剩下2或3个插入碳原子，有利的动力学就会导致环化成内酯产物（如果剩余2个插入碳原子，则为γ
‑
内酯，并且如果剩余3个插入碳原子，则为δ
‑
内酯）。
[0169]
图4显示了在与博伊丁假丝酵母一起温育后用cyp505a30c12 (含有co
‑
1至co
‑
3羟基月桂酸)得到的来自gc/ms分析的谱。参考图4a，分析了峰1、2、3和4。在将保留时间与已知标准品的保留时间对比以后，峰1被鉴定为γ
‑
己内酯gc6，峰2被鉴定为δ
‑
己内酯dc6，且峰4被鉴定为δ
‑
辛内酯dc8。峰3被鉴定为苯乙醇，它是酵母代谢的代谢物。
[0170]
如在图5中所示，如果初始开始脂肪酸具有奇数个碳诸如03:0 (十三烷酸，也被称作十三烷酸)，那么在酵母中的β
‑
氧化后，预测产物为来自co
‑
1羟基脂肪酸中间体的γ
‑
戊内酯(gc5)、来自co
‑
2羟基脂肪酸中间体的δ
‑
庚内酯(dc7)和来自ω
‑
3羟基脂肪酸中间体的γ
‑
庚内酯(gc7)。这是因为在每一轮β
‑
氧化中，都会从羟基脂肪酸中间体除去2个碳原子。取决于羟基脂肪酸中oh基团的位置，羟基脂肪酸中的羟基化碳原子和羧化碳原子之间可以存在10、9或8个插入碳原子。一旦β
‑
氧化已经除去足够的碳原子对从而剩下2或3个插入碳原子，有利的动力学就会导致环化成内酯产物（如果剩余2个插入碳原子，则为γ
‑
内酯，并且如果剩余3个插入碳原子，则为δ
‑
内酯）。
[0171]
图6显示了在与博伊丁假丝酵母一起温育后用cyp505a30c13 (含有co
‑
1至co
‑
3羟基十三烷酸)得到的来自gc/ms分析的谱。参考图6a，分析了峰1、2、3和4。在将保留时间与已知标准品的保留时间对比以后，峰2被鉴定为γ
‑
庚内酯gc7，且峰3被鉴定为δ
‑
庚内酯dc7。峰1被鉴定为苯乙醇，它是酵母代谢的代谢物。通过gc/ms未检测到戊内酯(gc5)，最可能由于其低浓度或挥发度。
[0172]
这些结果证明了通过接种酵母细胞培养物从羟基脂肪酸生产内酯。
[0173]
实施例3使用过表达深黄伞形霉细胞色素p450蛋白的大肠杆菌细胞生产内酯来自深黄伞形霉的bm3同系物（一种细胞色素p450蛋白）的氨基酸序列得自jgi genome portal (www.genome.jgi.doe.gov/cgi
‑ꢀ
bin/dispgenemodeldb=umbisa1&id=
523695)，且相应的基因为在大肠杆菌中表达经过密码子优化并由gene universal inc.(newark, de)合成。为大肠杆菌表达而密码子优化的来自深黄伞形霉的bm3同系物mi2的核苷酸序列在下面提供为seq id no: 5。mi2的氨基酸序列在下面提供为seq id no: 6。
[0174]
将所得基因产物通过hindiii和xhoi位点克隆进pet
‑
32a
‑
( )载体(amp , novagen)中。将构建体转化进bl21(de3)细胞中进行表达，并将过夜培养物用于接种含有100 mg/l的羧苄西林的液体lb培养基(2%)。在16℃温育16小时后，通过离心收获细胞。
[0175]
将收获的细胞沉淀物以100 g/l鲜重的浓度重新悬浮在含有0.1%吐温40的100 mm磷酸钾缓冲剂(ph7.0)中。然后加入1 g/l的月桂酸(c12:0)或1 g/l的十三烷酸(c13:0)以在30℃在振荡器中进行生物转化。在不同反应时间取样，并在用mstfa (n
‑
甲基
‑
n
‑
三甲基甲硅烷基
‑
三氟乙酰胺)甲硅烷基化以后通过gc/ms确定羟基脂肪酸的产生。
[0176]
图7a和图7b证明了通过过表达深黄伞形霉的bm3同系物mi2的大肠杆菌细胞从相应的羧酸产生ho
‑
c12:0和ho
‑
c13:0。尽管质谱图库搜索没有找到样品中峰1的精确匹配，但搜索表明该峰是羟基脂肪酸。
[0177]
为了从羟基脂肪酸ho
‑
c12:0和ho
‑
c13:0生产内酯，将生物转化混合物与60 g/l的玉米浆(csl)以1:1比例混合，并将所得培养基在121℃高压灭菌20分钟。对于02:0和c13:0生物转化，分别将培养基标记为mi2
‑
c12
‑
csl或mi2
‑
c13
‑
csl。然后给培养基接种过夜酵母培养物，例如，博伊丁假丝酵母，并使酵母培养物在30℃振荡器中生长。接种后每天取样。
[0178]
为了分析酵母培养物中的内酯产生，取0.5 ml博伊丁假丝酵母培养物并加入10
µ
l 2n hcl。将酸化的培养物用0.5 ml乙酸乙酯在室温振荡下萃取60分钟。在14,000 rpm离心15分钟以后，将乙酸乙酯相用于gc/ms或gc/fid分析。
[0179]
图8a和图8b分别证实，gc6是衍生自c12:0的主要内酯（通过ho
‑
c12:0作为中间体），并且dc7是衍生自c13:0的主要内酯（通过ho
‑
c13:0作为中间体）。这提示，ω
‑
2羟基月桂酸和ω
‑
2羟基十三烷酸可能分别对应于图7a和图7b中的峰1，所述峰1又分别源自c12和c13。
[0180]
综上所述，这些结果证实，深黄伞形霉细胞色素p450 mi2是一种co
‑
2脂肪酸羟化酶，并且可以用于生产γ
‑
己内酯或δ
‑
庚内酯。
[0181]
重要的序列嗜热毁丝霉cyp505a30核苷酸序列(seq id no: 1)
来自大肠杆菌k
‑
12 substr. mg1655的icd基因(seq id no: 2)嗜热毁丝霉cyp505a30氨基酸序列(seq id no: 3)
来自大肠杆菌k
‑
12 substr. mg1655的icd蛋白(seq id no: 4)深黄伞形霉mi2核苷酸序列(seq id no: 5)
深黄伞形霉mi2氨基酸序列(seq id no: 6)
icd
‑
f引物(seq id no: 7)icd
‑
r引物(seq id no: 8)