一种淡斑效果的本草覆膜酵母发酵方法与流程

1.本发明涉及生物技术技术领域，具体地说涉及一种淡斑效果的本草覆膜酵母发酵方法。


背景技术：

2.人类很早就开始了解和利用酵母和酵母发酵物，不仅用于食物制作、饮料酿制，还用于保健、治疗等方面。早在8000年前，古巴比伦就使用酵母帮助伤口愈合，古希腊用酿酒发酵产生的泡沫擦洗身体以保持皮肤的健康美丽，虽然已知酵母提取物对皮肤有益，但是直接使用酵母加入到护肤品中是非常危险的，经常出现过敏、发炎等反应；随着生物技术的发展，发达的发酵、提取等技术已经可以确保酵母提取物的稳定性和安全性，理论上，护肤品中最常见的酵母类成分有三类，一是酵母胞溶产物提取物，二是酵母发酵产物提取物，另外还有一种是酵母发酵过滤裂解液。
3.酵母胞溶产物提取物具有强大修护功能的酵母成分，含有非常丰富的b族维生素、微量元素、叶酸和麦角甾醇，所以能提高皮肤血液循环和新陈代谢，换言之，酵母胞溶产物提取物可以起到清洁毛孔、抗老化和消除细纹干纹的作用，让已经有“受损”的皮肤重新恢复活力。
4.公开号cn109893464a发明名称为一种阻断抑制还原黑色素的美白祛斑护肤品及其制备方法的发明专利申请，公开内容尤其涉及该一种具有阻断，抑制，还原黑色素的美白祛斑组方，该组方由烟酰胺、甜菜碱、β
‑
葡聚糖、白薇提取物、桑树皮提取物、覆膜酵母菌发酵产物滤液、勃那特螺旋藻提取物、小球藻提取物、稻胚芽提取物、大麦芽提取物、小麦芽提取物等组成，能够起到阻断，抑制，还原黑色素，加速细胞新陈代谢、加快黑色素角质细胞脱落；消除皮肤老化现象，抑制、延缓和减少皱纹产生，促进皮肤再生的皮肤调理作用；本发明的护肤品不受产品剂型的限制，可以添加于水剂、乳液、膏霜、精华等。该技术方案公开的产物是一种混合物，主要用于阻断、抑制和还原黑色素，加速细胞新陈代谢和黑色素角质细胞脱落。
5.酵母发酵产物提取物既有酵母细胞本身的营养物质提取物，又有发酵后代谢物质的过滤，一般认为，酵母发酵液富含维他命、氨基酸、矿物质以及有机酸，与肌肤天然保湿因子相似，可提升肌肤透明度、柔软度以及光滑度，通常被用作高端化妆品中美白、保湿和去皱的中药成分，例如市场上常见的sk
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ii、兰蔻小黑瓶肌底液、雅诗兰黛小棕瓶均将酵母发酵液作为核心宣传卖点。
6.覆膜酵母(trichosporon kashiwayama)是保洁公司命名的一种半乳糖酵母菌，据kashiwayama shinei于1980年的专利中报道，其发酵产物被用于保湿、淡化色斑和去皱。但是，根据该专利的报道，其发酵所得覆膜酵母发酵液中氨基酸成分很少，几十年过去之后，依然没有新的发酵方法报道，因此需要一种新的覆膜酵母发酵方法，以提升覆膜酵母的使用价值。
7.公开号cn109355216a发明名称为一种酵母微生物的发酵方法、制剂及其应用的发
明专利申请，公开了将覆膜酵母(trichosporon kashiwayama)接种于培养基中发酵，发酵液离心分离，取上清液，过滤去除覆膜酵母，获得发酵产物。试验显示，本发明所得覆膜酵母发酵产物能够起到治疗激素依赖性皮炎的效果，可用于制备治疗激素依赖性皮炎的药物、化妆品或者护肤品等外用品；该技术方案公开的内容主要涉及覆膜酵母(trichosporon kashiwayama)的发酵和利用。
8.覆膜酵母发酵液是天然发酵酵母产品，含有丰富的维生素，必需氨基酸、酶、酵母肽。覆膜酵母菌发酵产物滤液可以增加丝聚蛋白的表达并防止丝氨酸蛋白酪氨酸介导的丝聚蛋白的减少，覆膜酵母菌发酵产物滤液可以增加表皮角质形成细胞中的caspase
‑
14在3d模型中的表达，因为胱天蛋白酶caspase
‑
14表达牵涉受损的皮肤屏障形成，所以覆膜酵母菌发酵产物滤液可以改善皮肤的屏障功能，具有保湿、促进创伤愈合，治疗激素依赖性皮炎，减少瘢痕的作用，功能完善，安全可靠。
9.十三肽是多功能生物多肽，其主要作用为抗菌消炎、促进创面愈合、修复皮肤屏障、提高皮肤及黏膜免疫力，对抑制皮肤细菌生长，治疗痤疮、皮炎、皮损等病症，减少疤痕形成，修复皮肤屏障，预防创面感染，促进创面愈合都有显著作用。
10.ynb为无氨基酵母氮源，相比于蛋白胨更利于控制发酵表达过程，防止菌体过分生长而导致蛋白表达量不足。
11.公开号cn112353714a发明名称为一种覆膜酵母发酵物的制备方法及其应用的发明专利申请，公开的方法包括以下步骤：步骤1：配制培养基：一级种子培养基用ypd培养基；发酵表达培养基用bsm培养基。步骤2：发酵表达。上述覆膜酵母发酵物的应用。本发明含有覆膜酵母发酵物是天然发酵酵母产品，含有丰富的维生素，必需氨基酸、酶、酵母肽。覆膜酵母菌发酵产物滤液可以增加丝聚蛋白的表达并防止丝氨酸蛋白酪氨酸介导的丝聚蛋白的减少，覆膜酵母菌发酵产物滤液可以增加表皮角质形成细胞中的caspase
‑
14在3d模型中的表达。该方法的产品可以在皮肤表面形成一层湿性修复膜，以达到抗菌消炎和促进创面愈合、提高皮肤及黏膜免疫力的目的。
12.现有技术中，针对不同是培养基，提出了相应的发酵技术方案。对于具体的原料，探索有效的技术方案，是本领域的一种客观需要。


技术实现要素：

13.本发明的目的是提供一种淡斑效果的本草覆膜酵母发酵方法；提供一种本发明原料的有效发酵方法，为现有技术提供一种有效的原料液。
14.本发明所述的一种淡斑效果的本草覆膜酵母发酵方法，通过如下技术方案实现。
15.所述技术方案包括原料经前处理与均质化后，加入覆膜酵母进行发酵，然后进行过滤和浓缩，得到发酵产物。
16.具体而言，本发明所述的一种淡斑效果的本草覆膜酵母发酵方法，包括以下步骤：
17.1)原料预处理：挑选干燥的原料，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。在本技术方案中，所述原料为光果甘草、积雪草、白附子、白术、白茯苓和白芨，所述原料由光果甘草、积雪草、白附子、白术、白茯苓和白芨按照重量比为10:5:2:2:1:1组成原料混合物。
18.2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料与水的比例为1：8
‑
10倍纯净水，调节ph至7
‑
7.5；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设
定压力值20mpa至40mpa，优选25mpa
‑
32mpa，更优选28
‑
30mpa；经过均质处理的原料均质物料，被收集到出料容器。
19.被增压的物料，流向具有固定几何形状的微通道并产生高速微射流，高速微射流物料在特定几何通道内，经过物理剪切，高能对撞，空穴效应等物理作用，达到超微化均质效果。
20.进一步，上述过程中，经过高压微射流处理的物料会出现温度瞬间升高现象，需要通过换热器进行冷却处理，在本发明的技术方案中，设定实时控温温度范围为35℃
‑
42℃，优选36
‑
40℃，更优选37.8
‑
38.8℃；均质化至整个体系澄清透明，无颗粒状固体成分，冷却至室温，得到原料均质液；
21.3)发酵步骤：
22.覆膜酵母微生物发酵方法如下：
23.1、酵母初次培养
24.1.1、复苏
25.可以从冻存管中刮下少量细胞划在ym培养皿上，不要将整个冻存管中的贮存液融化。置于培养箱中28℃倒置培养24小时，可选择性的用封口膜封闭平皿。
26.1.2、冻存
27.配制10％的甘油溶液，用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来。混匀加入到2ml的冻存管中，置于干冰中一段时间，然后转存到
‑
80℃冰箱中。
28.2、酵母继代培养
29.挑取培养于ym平板中单菌落，在新的ym平皿上划线，继代培养2次。获得稳定的单菌落。
30.3、酵母生长培养
31.挑取平皿上的单菌落，接种于5ml ym液体培养基中，置于恒温摇床中180rpm，28℃培养24小时。
32.生长培养基(1000ml)包括：酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，葡萄糖10.0g，胰蛋白胨5.0g，ph值为6.0，其余为水。121℃高温灭菌。
33.4、酵母发酵培养
34.将培养好的覆膜酵母按照1:100
‑
120(v/v)转接于步骤2)的原料均质液中。置于恒温摇床中180rpm，25℃培养3天。
35.发酵过程中，在初期可见浑浊，随着发酵过程的持续，发酵液逐渐澄清。
36.4)后处理，包括过滤、浓缩步骤；所述过滤为利用错流除菌膜设备进行过滤；所述浓缩通过采用双效真空节能浓缩。
37.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经1
‑
2μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.2
‑
0.4μm的除菌微孔膜进行除菌，优选0.22
‑
0.28μm除菌微孔膜获得除菌产品。
38.现实中，覆膜酵母菌细胞宽度(直径)约2
～
6μm，长度5
～
30μm，有的则更长，个体形态有球状、卵圆、椭圆、柱状和香肠状等。
39.在本发明的中，上述除菌产品通过采用双效真空节能浓缩，包括过滤液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
‑
0.06mpa、48℃
‑
52℃，二效真空度与
温度分别控制在
‑
0.08mpa、42
‑
46℃，以可溶性固形物含量为指标，综合控制浓缩温度、真空度及供气压力，得到浓缩液。
40.本发明的有益效果为：
41.本发明技术方案中通过均质化处理和微孔膜进行除菌，替代了传统步骤，采用已知的覆膜酵母进行发酵，操作方法简单，成本低；所得酵母微生物发酵产物，具有良好的抗炎活性，可用于制备淡斑效果的药物、化妆品或护肤品。
42.为使本发明具体实施方式的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明的具体实施方式的实施实例，对本发明具体实施方式的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的具体实施方式是本发明的一部分具体实施方式，而不是全部的具体实施方式。基于所描述的本发明的具体实施方式，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所制备的所有其它具体实施方式，都属于本发明保护的范围。
附图说明
43.图1为本发明方法流程示意图；
44.图2为本发明对照组照片；
45.图3为本发明给药组照片。
具体实施方案
46.以下通过具体的实施例，进一步说明本发明的技术方案。在以下具体实施例中，所述原料除特别说明外，皆是市售商品，采购于相关生产企业或商业部门。所述微射流高压均质机微射流高压均质机可获得20mpa至210mpa均质压力。
47.其中，所述的覆膜酵母微生物发酵方法如下：
48.1、酵母初次培养
49.1.1、复苏
50.可以从冻存管中刮下少量细胞划在ym培养皿上，不要将整个冻存管中的贮存液融化。置于培养箱中28℃倒置培养24小时，可选择性的用封口膜封闭平皿。
51.1.2、冻存
52.配制10％的甘油溶液，用甘油溶液将菌体或孢子洗脱下来。混匀加入到2ml的冻存管中，置于干冰中一段时间，然后转存到
‑
80℃冰箱中。
53.2、酵母继代培养
54.挑取培养于ym平板中单菌落，在新的ym平皿上划线，继代培养2次。获得稳定的单菌落。
55.3、酵母生长培养
56.挑取平皿上的单菌落，接种于5ml ym液体培养基中，置于恒温摇床中180rpm，28℃培养24小时。
57.生长培养基(1000ml)包括：酵母提取物3.0g，麦芽提取物3.0g，葡萄糖10.0g，胰蛋白胨5.0g，ph值为6.0，其余为水。121℃高温灭菌。
58.4、酵母发酵培养
59.将培养好的覆膜酵母按照1:100
‑
120(v/v)转接于步骤2)的原料均质液中。置于恒
温摇床中180rpm，25℃培养3天。
60.发酵过程中，在初期可见浑浊，随着发酵过程的持续，发酵液逐渐澄清。
61.以上的覆膜酵母微生物发酵方法，适用于以下的实施例1
‑
6中。
62.实施例1
63.本实施例1具体包括以下步骤：
64.(1)原料预处理：挑选干燥的原料混合物200克，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。
65.(2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料混合物与水的比例为1：8倍纯净水，调节ph至7.2；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值35mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的原料混合物均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在本实施例中，设定实时控温温度38.8℃；
66.(3)发酵步骤：如前述。
67.(4)后处理，包括过滤、浓缩步骤
68.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经2μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.22μm的除菌微孔膜进行除菌，获得除菌液。
69.所述除菌液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
‑
0.06mpa、52℃，二效真空度与温度分别控制在
‑
0.08mpa、46℃，获得本草覆膜酵母发酵液。
70.实施例2
71.本实施例2具体包括以下步骤：
72.(1)原料预处理：挑选干燥的原料混合物200克，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。
73.(2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料混合物与水的比例为1：10倍纯净水，调节ph至7.2；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值38mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的原料混合物均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在实施例中，设定实时控温温度40℃；
74.(3)发酵步骤：如前述。
75.(4)后处理，包括过滤、浓缩步骤
76.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经1.8μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.25μm的除菌微孔膜进行除菌，获得除菌液。
77.所述除菌液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
‑
0.06mpa、52℃，二效真空度与温度分别控制在
‑
0.08mpa、46℃，获得本草覆膜酵母发酵液。
78.实施例3
79.本实施例3具体包括以下步骤：
80.(1)原料预处理：挑选干燥的原料混合物200克，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。
81.(2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料混合物与水的比例为1：8倍纯净水，调节ph至7.5；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值35.8mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的原料混合物均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在本实施例中，设定实时控温温度40℃；
82.(3)发酵步骤：如前述。
83.(4)后处理，包括过滤、浓缩步骤
84.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经1.5μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.28μm的除菌微孔膜进行除菌，获得除菌液。
85.所述除菌液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
‑
0.06mpa、52℃，二效真空度与温度分别控制在
‑
0.08mpa、46℃，获得本草覆膜酵母发酵液。
86.实施例4
87.本实施例4具体包括以下步骤：
88.(1)原料预处理：挑选干燥的原料混合物200克，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。
89.(2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料混合物与水的比例为1：8倍纯净水，调节ph至7.2；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值35mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的原料混合物均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在实施例中，设定实时控温温度38℃；
90.(3)发酵步骤：如前述。
91.(4)后处理，包括过滤、浓缩步骤
92.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经2μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.22μm的除菌微孔膜进行除菌，获得除菌液。
93.过滤液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
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0.06mpa、52℃，二效真空度与温度分别控制在
‑
0.08mpa、46℃，获得本草覆膜酵母发酵液。
94.实施例5
95.本实施例5具体包括以下步骤：
96.(1)原料预处理：挑选干燥的原料混合物200克，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。
97.(2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料混合物与水的比例为1：8倍纯净水，调节ph至7.0；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值38mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的原料混合物均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在实施例中，设定实时控温温度40℃；
98.(3)发酵步骤：如前述。
99.(4)后处理，包括过滤、浓缩步骤
100.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经2μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.4μm的除菌微孔膜进行除菌，获得除菌液。过滤液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
‑
0.06mpa、50℃，二效真空度与温度分别控制在
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0.08mpa、44℃，获得本草覆膜酵母发酵液。
101.实施例6
102.本实施例6具体包括以下步骤：
103.(1)原料预处理：挑选干燥的原料混合物200克，含水量小于10％，粉碎至200目至300目。
104.(2)均质处理：采用微射流高压均质机，通过增压泵或均质机柱塞泵抽吸进料；原料混合物与水的比例为1：8倍纯净水，调节ph至7.3；物料增压：物料在柱塞增压泵内，增压到设定压力值40mpa；被增压的物料，在微射流高压均质机内达到超微化均质状态，经过均质处理的原料混合物均质物料，被收集到出料容器。在此过程中，经高压微射流处理的物料通过换热器进行冷却处理，在实施例中，设定实时控温温度39℃；
105.(3)发酵步骤：如前述。
106.(4)后处理，包括过滤、浓缩步骤
107.低温过滤、低温除菌：将3)中发酵后的发酵液利用错流除菌膜设备进行过滤；将3)中发酵后的发酵液经1.8μm袋式过滤器除去颗粒杂质，后将滤液用0.4μm的除菌微孔膜进行除菌，获得除菌液。
108.过滤液经双效真空节能浓缩设备浓缩，一效真空度与温度分别控制为
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0.06mpa、48℃，二效真空度与温度分别控制在
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0.08mpa、42℃，获得本草覆膜酵母发酵液。
109.图1
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图3，图1给出了本发明方法流程示意图；图2为本发明所述技术方案中原料，未经均质处理获得的产品，施用在志愿者皮肤，得到的对照组照片；图3为根据本发明所述技术方案获得的产品，施用在志愿者皮肤，得到的给药组照片。可以看出，施用本发明技术方案的产品，可以有效减少人体皮肤黑色素生成。
110.以上结合具体实施例，对本发明技术方案的具体实施方式进行了进一步描述，此具体实施方案是为了对本技术方案的详细描述，而不是为了限制本技术方案。以上所述的具体实施方案，仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的技术构思和保护范围进行限定，在不脱离本发明设计构思的前提下，本领域普通技术人员对本技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的保护范围。