使用具有亚末端羟化酶活性的细胞色素P450酶生物合成生产γ-内酯和δ-内酯的制作方法

技术特征：
1.一种制备内酯的方法，所述方法包括：(a)将表达异源细胞色素p450 (cyp450)蛋白的细胞系统与包含直链脂肪酸的培养基一起温育以产生亚末端羟基脂肪酸，其中所述直链脂肪酸和所述亚末端羟基脂肪酸具有5
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40个碳原子，和以下任一个：(b1)将所述亚末端羟基脂肪酸与酵母细胞培养物一起温育以产生内酯，其中所述内酯包含至少一种γ
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内酯、至少一种δ
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内酯或其组合，或者(b2)将所述亚末端羟基脂肪酸在酸性环境中温育以产生内酯，其中所述内酯包含至少一种γ
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内酯、至少一种δ
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内酯或其组合。2. 权利要求1所述的方法，其中所述细胞色素p450蛋白包含与来自嗜热毁丝霉（myceliophthora thermophile）的细胞色素p450蛋白的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。3. 权利要求1所述的方法，其中所述细胞色素p450蛋白包含seq id no: 3的氨基酸序列。4. 权利要求1所述的方法，其中所述细胞色素p450蛋白包含与来自深黄伞形霉（umbelopsis isabellina）的细胞色素p450蛋白的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。5. 权利要求1所述的方法，其中所述细胞的细胞色素p450蛋白包含seq id no: 6的氨基酸序列。6.权利要求1
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5中的任一项所述的方法，其中所述细胞系统除了表达异源细胞色素450蛋白以外还表达外源异柠檬酸脱氢酶(led)蛋白。7.权利要求6所述的方法，其中所述led蛋白包含与来自大肠杆菌的led蛋白的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。8. 权利要求6所述的方法，其中所述led蛋白包含seq id no: 4的氨基酸序列。9.权利要求1
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8中的任一项所述的方法，其中所述直链脂肪酸和所述亚末端羟基脂肪酸具有7个碳至20个碳。10.权利要求1
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9中的任一项所述的方法，其中所述直链脂肪酸是月桂酸或十三烷酸。11.权利要求1
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10中的任一项所述的方法，其中所述亚末端羟基脂肪酸是羟基化的月桂酸或羟基化的十三烷酸。12.权利要求1
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11中的任一项所述的方法，其中所述亚末端羟基脂肪酸包含在选自ω
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1、ω
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2和co
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3的碳位置处的羟基。13.权利要求1
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12中的任一项所述的方法，其中所述细胞系统包含细菌细胞、酵母细胞或其组合。14.权利要求13所述的方法，其中所述细胞系统包含选自以下的细菌或酵母细胞：埃希氏菌属（escherichia）；沙门氏菌属（salmonella）；芽孢杆菌属（bacillus）；不动杆菌属（acinetobacter）；链霉菌属（streptomyces）；棒杆菌属（corynebacterium）；甲基弯曲菌属（methylosinus）；甲基单胞菌属（methylomonas）；红球菌属（rhodococcus）；假单胞菌属（pseudomonas）；红细菌属（rhodobacter）；集胞蓝细菌属（synechocystis）；酵母属（saccharomyces）；接合酵母属（zygosaccharomyces）；克鲁维酵母属（kluyveromyces）；假丝酵母属（candida）；汉逊酵母属（hansenula）；德巴利酵母属（debaryomyces）；毛霉菌属
（mucor）；毕赤酵母属（pichia）；球拟酵母属（torulopsis）；曲霉菌属（aspergillus）；线虫捕捉菌属（arthrobotlys）；短杆菌属（brevibacteria）；微杆菌属（microbacterium）；节杆菌属（arthrobacter）；柠檬酸杆菌属（citrobacter）；克雷伯氏菌属（klebsiella）；泛菌属（pantoea）；和梭菌属（clostridium）。15.权利要求1
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12所述的方法，其中所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。16.权利要求1
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12中的任一项所述的方法，其中所述酵母细胞培养物包含博伊丁假丝酵母细胞。17.权利要求1
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16中的任一项所述的方法，其中所述内酯包含五个碳至八个碳。18.权利要求1
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17中的任一项所述的方法，其中所述内酯包含δ
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己内酯、γ
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己内酯和δ
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辛内酯中的一种或多种。19.权利要求1
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17中的任一项所述的方法，其中所述内酯包含γ
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戊内酯、δ
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庚内酯和γ
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庚内酯中的一种或多种。20.权利要求1
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8中的任一项所述的方法，其中所述直链脂肪酸是月桂酸，所述亚末端羟基脂肪酸包含ω
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1羟基月桂酸、ω
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2羟基月桂酸和co
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3羟基月桂酸中的一种或多种，且所述内酯包含δ
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己内酯、γ
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己内酯和δ
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辛内酯中的一种或多种。21.权利要求1
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8中的任一项所述的方法，其中所述直链脂肪酸是十三烷酸，所述亚末端羟基脂肪酸包含co
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1羟基十三烷酸、co
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2羟基十三烷酸和co
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3羟基十三烷酸中的一种或多种，且所述内酯包含γ
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戊内酯、δ
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庚内酯和γ
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庚内酯中的一种或多种。22.权利要求1
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21中的任一项所述的方法，其中在步骤(b1)或(b2)之前从所述细胞系统分离所述亚末端羟基脂肪酸。23.权利要求1
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21中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括从所述酵母细胞培养物分离所述内酯。24.一种制备内酯的方法，所述方法包括：(a)将表达异源细胞色素p450蛋白的细胞系统与包含直链脂肪酸的培养基一起温育以产生亚末端羟基脂肪酸，其中所述直链脂肪酸和所述亚末端羟基脂肪酸具有5
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40个碳原子：(b)将来自步骤(a)的亚末端羟基脂肪酸与细胞培养物一起温育以产生亚末端羟基脂肪酸，其长度短于来自步骤(a)的所述亚末端羟基脂肪酸；和(c)将在步骤(b)结束时得到的亚末端羟基脂肪酸在酸性环境中温育以产生内酯，其中所述内酯包含至少一种γ
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内酯、至少一种δ
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内酯或其组合。25.权利要求24所述的方法，其中所述细胞色素p450蛋白包含与来自嗜热毁丝霉的细胞色素p450蛋白的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。26.权利要求24所述的方法，其中所述细胞色素p450蛋白包含与来自深黄伞形霉的细胞色素p450蛋白的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。27.权利要求24
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26中的任一项所述的方法，其中所述细胞系统除了表达异源细胞色素450蛋白以外还表达外源异柠檬酸脱氢酶(led)蛋白。28.权利要求27所述的方法，其中所述led蛋白包含与来自大肠杆菌的led蛋白的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。

技术总结
本文提供了用于制备内酯的方法，所述方法包括将表达异源细胞色素P450(CYP450)蛋白的细胞系统与包含直链脂肪酸的培养基一起温育以产生亚末端羟基脂肪酸，和将酵母细胞培养物与所述亚末端羟基脂肪酸一起温育以产生内酯。与所述亚末端羟基脂肪酸一起温育以产生内酯。与所述亚末端羟基脂肪酸一起温育以产生内酯。


技术研发人员：陈辉 X
受保护的技术使用者：科纳根公司
技术研发日：2020.03.21
技术公布日：2021/10/26