一种等离激元增强上转换发光纳米粒子及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及上转换材料技术领域，更具体的，涉及一种等离激元增强上转换发光纳米粒子及其制备方法和应用。


背景技术：

2.上转换发光材料因其较大的斯托克斯位移与光学成像灵敏度而备受生物医学诊断领域研究者们的关注。其中，gd2o3:yb
3
/ln
3
(ln＝er,ho,tm)纳米颗粒因制备工艺简单、在980nm附近具有很大的吸收截面以及gd
3
离子可以同时作为高纵向弛豫率的核磁共振造影剂而成为具有良好医学成像前景的上转换发光材料之一。然而，敏化剂和激活剂之间的能量传递效率低下限制了成像的清晰度与分辨率。
3.利用贵金属的表面等离激元共振(spr)增强激发与发射的原理，可以一定程度提高上转换发光效率，以得到高清晰度与分辨率的光学成像。作为最常见的等离子体材料之一，金纳米颗粒(aunp)具有良好的化学稳定性和生物相容性以及能够作为光热光动力治疗的探针，十分适合生物医学应用。
4.然而aunp通常会吸收发射光进行光热转换而发生荧光猝灭，且aunp的形状与尺寸会严重影响spr增强的波长与空间范围。对此，ilia等人(plasmon
‑
enhanced upconversion:engineering enhancement and quenching at nano and macro scales[j].optical materials express,2018,8(12):3787
‑
3804.)和azza hadj youssef等人(topography
‑
induced variations of localized surface plasmon resonance in tip
‑
enhanced raman configuration,opt.express 28,389565(2020))已有相关报道。大尺寸的金纳米棒、金纳米壳以及金纳米夹层等具有双等离子体模式，但其靠近金属表面的猝灭区域比较大，发光离子无法完全被spr增强区域覆盖。小尺寸的金纳米球(auns)和具有大量“热点”的金纳米星只有一个等离子共振波长，对上转换发光效率的增强作用较弱。
[0005]
因此，需要开发出一种利用spr有效增强上转换发光效率的纳米粒子。


技术实现要素：

[0006]
本发明为克服上述现有技术所述的上转换发光效率弱的缺陷，提供一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，本发明的纳米粒子为包裹有金纳米球群(aunsa)的gd2o3:yb
3
/ln
3
纳米颗粒，通过spr引发的激发场增强效应、purcell效应与淬灭效应相互协同和竞争，有效增强了上转换发射光强度。
[0007]
本发明的另一目的在于提供上述等离激元增强上转换发光纳米粒子的制备方法。
[0008]
本发明的另一目的在于提供上述等离激元增强上转换发光纳米粒子在生物光学成像中的应用。
[0009]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0010]
一种等离激元增强上转换发光纳米粒子(aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
)，包括金纳米球群(aunsa)、包裹aunsa的gd2o3纳米颗粒；
[0011]
所述aunsa由数量为38～119的金纳米球组成，所述金纳米球的粒径为5～15nm；
[0012]
所述gd2o3纳米颗粒掺杂金属离子yb
3
和ln
3
。
[0013]
发明人研究发现，虽然小尺寸的金纳米球(auns)仅具有一个等离子共振波长，但当多个auns聚集为aunsa时，由于各个auns的相互影响与作用，在近红外区域会产生另外两个共振峰，即在538nm波长处有强烈共振峰，在773.5nm与998nm附近有较弱的共振峰。由于上述共振峰的存在，可以同时增强激发场与发射场，且spr增强区域相互接壤，能够涵盖整个发光颗粒。与未包裹aunsa的纳米颗粒相比，本发明的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
上转换发光效率提升了46～96.1倍。
[0014]
所述ln
3
为镧系金属离子。
[0015]
优选地，所述ln
3
为er
3
、ho
3
或tm
3
。
[0016]
通过大量的创造性实验和数据理论分析，发明人认为，本技术aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
上转换发光效率的增强主要由下面三种效应的相互协同和竞争所致：
[0017]
第一，当激发光波长接近spr共振波长时，aunsa的周围形成局域电场显著增强的区域，在此区域内yb
3
与激发光的相互作用强度和时间均增加，导致yb
3
的激发效率提高，这称为激发场增强效应；
[0018]
第二，当发射光波长接近spr共振波长时，由于purcell效应，ln
3
相应的激发态的自发辐射跃迁几率提高，直接导致发射光发光效率增强；
[0019]
第三，虽然发射光会被auns吸收而导致荧光猝灭，但这种猝灭会随着ln
3
与auns距离增大而快速减弱，由于本技术的纳米粒子体积较大，所以受到猝灭的离子只占很少的比例。
[0020]
因此，本发明的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
中aunp的荧光猝灭效应可以忽略，而spr引起的激发场增强效应与purcell效应导致发射光增强，从而大幅提高了上转换发光效率。
[0021]
优选地，所述金纳米球的粒径为7～11nm。
[0022]
所述金纳米球的平均粒径为9nm。
[0023]
优选地，所述aunsa由数量为38～77的auns组成。
[0024]
优选地，所述aunsa由数量为40～60的auns组成。
[0025]
优选地，所述auns的平均间距为8～26nm。
[0026]
优选地，所述gd2o3纳米颗粒的粒径为50～95nm。
[0027]
更优选地，所述gd2o3纳米颗粒的粒径为70～85nm。
[0028]
优选地，所述gd
3
、yb
3
、ln
3
的摩尔比为(94～73)∶(5～25)∶(1～2)。
[0029]
优选地，所述gd
3
、yb
3
、ln
3
的摩尔比为83∶15∶2。
[0030]
优选地，所述au与gd的摩尔比为1∶(2～15)。
[0031]
本发明还保护上述等离激元增强上转换发光纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
[0032]
将若干粒金纳米球分散于去离子水中，同时加入尿素、gd
3
、yb
3
、ln
3
，加热搅拌均匀后离心得到前驱体，前驱体经冷冻干燥、650～950℃加热2～8h，冷却后，再经筛选，得到所述等离激元增强上转换发光纳米粒子。
[0033]
通过筛选，得到包裹金纳米球数量为38～119的等离激元增强上转换发光纳米粒子。
[0034]
优选地，所述gd
3
、yb
3
、ln
3
分别为gd
3
、yb
3
、ln
3
的硝酸盐、氯化物或硫酸盐。
[0035]
更优选地，所述gd
3
、yb
3
、ln
3
分别为gd(no3)3、yb(no3)3、ln(no3)3。
[0036]
优选地，所述加热搅拌为在60～90℃下搅拌。
[0037]
优选地，所述冷冻干燥为在
‑
40～
‑
20℃条件下干燥6～12h。
[0038]
优选地，所述金纳米球由柠檬酸三钠还原氯金酸制备得到。
[0039]
可选的，所述金纳米球的制备方法包括如下步骤：
[0040]
将haucl4溶液加热至沸腾后，加入柠檬酸三钠，在100～170℃的加热条件下待反应液变为透明的橙红色后，冷却至室温，离心、过滤、洗涤得到所述金纳米球。
[0041]
更优选地，所述haucl4与柠檬酸三钠的质量比为1∶(5～10)。
[0042]
在haucl4溶液中加入柠檬酸三钠后，反应液颜色逐渐由浅蓝色变为红色，在持续加热条件下，反应液会变为透明的橙红色，即得到金纳米球。
[0043]
本发明还保护上述等离激元增强上转换发光纳米粒子在生物光学成像中的应用。
[0044]
在980nm近红外光激发下，本发明的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
可以分别发射红(～661nm)、绿(～542nm)、蓝(～484nm)三种荧光，应用于生物光学成像中可使得光学成像具有较高的灵敏度和清晰度。
[0045]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0046]
本发明开发了一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，通过gd2o3:yb
3
/ln
3
纳米颗粒包裹aunsa，在auns自身具有538nm等离子共振波长的条件下，aunsa在近红外区域还会产生另外两个共振峰。利用spr引发的激发场增强效应、purcell效应与淬灭效应相互协同和竞争作用，有效增强了上转换发射光强度，提升了上转换发光效率。本发明的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
在980nm近红外光激发下，可以分别发射红(～661nm)、绿(～542nm)、蓝(～484nm)三种荧光，应用于生物光学成像中可使得光学成像具有较高的灵敏度和清晰度。
附图说明
[0047]
图1为实施例1制备等离激元增强上转换发光纳米粒子的路线示意图。
[0048]
图2为实施例3制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
的透射电镜图，其中图2插入图为aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
结构示意图，图2b插入图为相应的选区电子衍射图。
[0049]
图3为实施例3制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
的能谱分析图。
[0050]
图4为实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
的fdtd模拟吸收曲线，与使用uv
‑
3150经实验测得的吸收光谱。
[0051]
图5为实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
在入射光波长为980nm、z＝0平面上的fdtd模拟的电场强度图(图5a)和电荷分布图(图5b)。
[0052]
图6为实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
在入射光波长为570nm、z＝0平面上的fdtd模拟的电场强度图(图6a)和电荷分布图(图6b)。
[0053]
图7为实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
在入射光波长为710nm、z＝0平面上的fdtd模拟的电场强度图(图7a)和电荷分布图(图7b)。
[0054]
图8为实施例1～3制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
以及对比例1～3制备的sio2@gd2o3:yb
3
/ln
3
在980nm激光激发下的发射光谱，其中图8a为实施例1和对比例1的发射光谱，图8b为实施例2和对比例2的发射光谱，图8c为实施例3和对比例3的发射光谱。
[0055]
图9为aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
在980nm激光激发下的cie色度图。
[0056]
图10为实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
的共焦激光显微图像，其中图10a、图10d、图10g分别为在980nm激光照射下发射出红色、绿色和蓝色光的荧光图像；图10b、图10e、图10h为明场图像；图10c、图10f、图10i为荧光图像与相应的明场图像相叠加后的叠加图像。
具体实施方式
[0057]
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。
[0058]
实施例及对比例中的原料均可通过市售得到；
[0059]
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0060]
实施例1
[0061]
本实施例提供一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，制备路线如图1所示，制备方法如下：
[0062]
将100ml的0.01％haucl4加热至沸腾，迅速加入10ml 1％柠檬酸三钠，溶液逐渐由浅蓝色变为红色，继续加热直至出现透明的橙红色，自然冷却至室温后经过离心、过滤、洗涤，即得到金纳米球，金纳米球的粒径为5～15nm。
[0063]
将若干粒金纳米球分散于去离子水中，并加入尿素、gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o，其中gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o的摩尔比为83：15：2，在80℃加热搅拌5h后，经8000r/min、8min离心得到前驱体，前驱体经去离子水、乙醇洗涤后，在
‑
40℃下冷冻干燥6h，再于800℃条件下加热5h后，经自然冷却、筛选包裹的金纳米球数量，得到所述等离激元增强上转换发光纳米粒子(aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
)。
[0064]
实施例2
[0065]
本实施例提供一种等离激元增强上转换发光纳米粒子(aunsa@gd2o3:yb
3
/ho
3
)，制备方法与实施例1的区别在于：
[0066]
er(no3)3·
6h2o等摩尔量替换为ho(no3)3·
6h2o。
[0067]
实施例3
[0068]
本实施例提供一种等离激元增强上转换发光纳米粒子(aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
)，制备方法与实施例1的区别在于：
[0069]
er(no3)3·
6h2o等摩尔量替换为tm(no3)3·
6h2o。
[0070]
实施例4
[0071]
本实施例一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，制备方法与实施例1的区别在于：
[0072]
gd
3
、yb
3
、ln
3
的摩尔比为94∶5∶1。
[0073]
实施例5
[0074]
本实施例一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，制备方法与实施例1的区别在于：
[0075]
gd
3
、yb
3
、ln
3
的摩尔比为73∶25∶2。
[0076]
实施例6
[0077]
本实施例一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，制备方法与实施例1的区别在于：
[0078]
gd
3
、yb
3
、ln
3
分别为gd
3
、yb
3
、ln
3
的硫酸盐。
[0079]
实施例7
[0080]
本实施例一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，制备方法与实施例1的区别在于：
[0081]
前驱体经去离子水、乙醇洗涤，冷冻干燥后，再于950℃条件下加热2h后，经自然冷却得到等离激元增强上转换发光纳米粒子。
[0082]
实施例8
[0083]
本实施例一种等离激元增强上转换发光纳米粒子，制备方法与实施例1的区别在于：
[0084]
前驱体经去离子水、乙醇洗涤，冷冻干燥后，再于650℃条件下加热5h后，经自然冷却得到等离激元增强上转换发光纳米粒子。
[0085]
对比例1
[0086]
本对比例提供一种纳米粒子(sio2@gd2o3:yb
3
/er
3
)，该上转换发光纳米粒子具有sio2核、gd2o3:yb
3
/er3壳的核壳结构，其制备方法如下：
[0087]
将sio2纳米颗粒分散于去离子水中，并加入尿素、gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o，其中gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o的摩尔比为83：15：2，在80℃加热搅拌5h后，经8000r/min、8min离心得到前驱体，前驱体经去离子水、乙醇洗涤后，在
‑
40℃下冷冻干燥6h，再于800℃条件下加热5h后，经自然冷却，得到sio2@gd2o3:yb
3
/er
3
。
[0088]
对比例2
[0089]
本对比例提供一种纳米粒子(sio2@gd2o3:yb
3
/ho
3
)，制备方法与对比例1的区别在于：
[0090]
er(no3)3·
6h2o等摩尔量替换为ho(no3)3·
6h2o。
[0091]
对比例3
[0092]
本对比例提供一种纳米粒子(sio2@gd2o3:yb
3
/tm
3
)，制备方法与对比例1的区别在于：
[0093]
er(no3)3·
6h2o等摩尔量替换为tm(no3)3·
6h2o。
[0094]
对比例4
[0095]
本对比例提供一种纳米粒子(gd2o3:yb
3
/er
3
)，制备方法如下：
[0096]
在100ml去离子水中加入尿素、gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o，其中gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o的摩尔比为83∶15∶2，在80℃加热搅拌5h后，经8000r/min、8min离心得到前驱体，前驱体经去离子水、乙醇洗涤后，在
‑
40℃下冷冻干燥6h，再于800℃条件下加热5h后，经自然冷却得到gd2o3:ln
3
/er
3
)。
[0097]
对比例5
[0098]
本对比例提供一种纳米粒子，制备方法与实施例1的区别在于：
[0099]
金纳米球的粒径为25～35nm，金纳米球的制备方法为：
[0100]
将100ml的0.01％haucl4加热至沸腾，迅速加入2ml 1％柠檬酸三钠，溶液逐渐由
浅蓝色变为红色，继续加热直至出现透明的橙红色，自然冷却至室温后经过离心、过滤、洗涤，即得到金纳米球，金纳米球的粒径为25～35nm。
[0101]
对比例6
[0102]
本对比例提供一种纳米粒子，制备方法如下：
[0103]
按照au与gd的摩尔比为1∶20，将若干粒粒径为5～15nm的金纳米球分散于去离子水中，并加入尿素、gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o，其中gd(no3)3·
6h2o、yb(no3)3·
5h2o、er(no3)3·
6h2o的摩尔比为83：15：2，在80℃加热搅拌5h后，经8000r/min、8min离心得到前驱体，前驱体经去离子水、乙醇洗涤后，在
‑
40℃下冷冻干燥6h，再于800℃条件下加热5h后，经自然冷却、筛选包裹的金纳米球数量为5～20，得到纳米粒子。
[0104]
测试方法
[0105]
(1)形貌和结构测试
[0106]
通过配备有300kv场发射枪的透射电子显微镜(tem，fei tecnai
‑
g2 f30)检测aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
的结构，获得tem图像和saed图案；
[0107]
通过能量色散x射线光谱仪(edx)观察aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
的组分，获得能谱分析图。
[0108]
(2)发光性能测试
[0109]
通过紫外
‑
可见
‑
近红外分光光度计(uv
‑
3150)确定aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
置于1cm石英池中的吸收光谱；
[0110]
通过时域有限差分算法(fdtd)模拟实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
er
3
的吸收曲线、电场强度与电荷分布；
[0111]
通过配有980nm二极管激光器作为激发源的爱丁堡分光光度计(fls920)测得纳米粒子的荧光发射光谱图；
[0112]
(3)肿瘤细胞光学成像测试
[0113]
将宫颈癌hela细胞接种在24孔培养板上，于37℃、5％co2环境下在包含有10％胎牛血清、青霉素(100单位/ml)和链霉素(100mg/ml)的dulbecco’smodified eagle’s media(dmem)中培养。在生长至对数生长期后，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤细胞并在含有20μg/mlaunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
的新鲜培养基中在相同环境下再培养2小时。除去含有过量样品的培养基，然后把pbs洗涤过的细胞固定住并使用共焦激光扫描显微镜(leica tcs sp8x)成像，将用于荧光成像的发射光波长设定为980nm，并选择性使用带通滤波器以得到活细胞荧光图像。
[0114]
测试结果
[0115]
将实施例3制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
置于300kv场发射枪的透射电子显微镜下观察其形貌，结果如图2所示；实施例3的aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
能谱分析图，如图3所示。
[0116]
通过图2可以看出aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
具有良好的结晶性，在gd2o3纳米颗粒中存在一些深色的大小不一的小颗粒。根据图3的能谱分析图结果表明，制备的纳米粒子中含有金元素，证实gd2o3里面的小颗粒为金纳米球群，且au与gd的摩尔比为1∶(2～15)。由于实验制备时对前驱体在800℃下进行退火导致金熔化，因此金纳米球呈现出不规则球形。
[0117]
对实施例1～3制备的等离激元增强上转换发光纳米粒子进行形貌和结构测试，根据所有电镜下的图片，金纳米球的粒径为5～15nm，优选为7～11nm，金纳米球的平均粒径为
9.0nm；gd2o3纳米颗粒的粒径为50～95nm，优选为70～85nm，gd2o3纳米颗粒的平均粒径为79.5nm；单颗gd2o3纳米颗粒包裹的纳米金球数量为38～119个，优选为38～77个，更优选为40～60个。
[0118]
图4为实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
er
3
在400～1200nm范围内fdtd模拟的吸收曲线，与使用uv
‑
3150经实验测得的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
的吸收光谱。可以看出，fdtd模拟的吸收曲线显示aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
分别在570nm波长处有强烈共振峰、在710nm与1005nm附近有较弱的共振峰；实验所得的吸收光谱显示aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
分别在538nm波长处有强烈共振峰、在773.5nm与998nm附近有较弱的共振峰。由于fdtd模拟的金纳米球的位置、大小、间距等因素与实验样品不完全一致，因此可以认为在误差范围内两者在趋势方面比较符合。
[0119]
根据图5～7中fdtd模拟的电场强度图与电荷分布图，可以看出金纳米球群周围的电场增强。除了金纳米球本身的共振波长处有一个共振峰之外，由于金纳米球的聚集与相互影响，导致在近红外区域也存在两个共振峰。因为ln
3
离子的上转换发射光波长(约542～661nm)位于可见光共振峰的附近，而激发光波长980nm也被包含在近红外共振峰中，所以ln
3
离子的上转换发光效率就会受到附近金纳米球的影响。
[0120]
分别检测实施例1～3制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
以及对比例1～3制备的sio2@gd2o3:yb
3
/ln
3
在980nm激光激发下的发射光谱，结果如图8所示。可以看出，在同样的ln
3
条件下，aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
的发射光强度与sio2@gd2o3:yb
3
/ln
3
显著提高。具体地说，aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
在562nm和661nm处的光致发光与sio2@gd2o3:yb
3
/er
3
相比，分别提高54.5和46.1倍，aunsa@gd2o3:yb
3
/ho
3
在542nm和655nm处的光致发光分别提高54.3和47.1倍，aunsa@gd2o3:yb
3
/tm
3
在484nm和798nm处的光致发光增强因子(enhancement factor)为54.1和96.1倍。此外，与对比例4、5、6制得的纳米粒子相比，实施例1制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/er
3
在562nm和661nm处的光致发光强度也显著更高。这说明金纳米球的粒径过大、不含金纳米球，或gd2o3纳米颗粒包裹的金纳米球数量过少，均无法达到优异的光致发光性能。
[0121]
图9的cie色度图显示了本发明制备的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
的发光颜色，er
3
、ho
3
与tm
3
的发射光分别为红色(x＝0.5378，y＝0.4538)、绿色(x＝0.2975，y＝0.6877)与蓝色(x＝0.1513，y＝0.2024)。
[0122]
根据图10的测试结果，用激发波长为980nm的共焦激光扫描显微镜对预处理后的宫颈癌hela细胞进行成像，可以观察到明显的红色、绿色、蓝色细胞内荧光，发射波长分别在600nm以上，500～570nm和450
‑
500nm范围内。通过比较荧光图像与相应的叠加图像，可以看出本发明的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
可以被hela细胞有效摄取并保持固有的显著荧光特性；叠加图像表明荧光主要分布在细胞质中。由此，可以验证出本发明的aunsa@gd2o3:yb
3
/ln
3
有良好的细胞相容性和细胞内吞性，能够在980nm激发波长下实现清晰、灵敏的生物光学成像。
[0123]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求
的保护范围之内。