荧光碳纳米点及制备方法与其在细胞核靶向成像中的应用与流程

1.本发明属于纳米材料技术领域，涉及荧光碳纳米点及制备方法与其在细胞核靶向成像中的应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.细胞核是细胞中最大、最突出的细胞器，是细胞遗传和代谢的调节中心，在细胞增殖、分化和信号传导等各种生理过程中均扮演者重要的角色。研究表明，细胞核内染色质降解、支架蛋白解体等变化不仅是细胞凋亡的明显标志，也与肿瘤细胞的癌变状态有密切关系。细胞核作为一种封闭式膜状胞器，内含有绝大多数的dna。细胞核内dna可以调控基因表达，指导蛋白质合成。dna的降解、突变，都将引发各种与基因相关的疾病。因此，细胞核靶向荧光成像对于细胞状态评估、疾病诊断和治疗措施制定等方面起着至关重要的作用。
4.到目前为止，已经开发出dapi(4,6
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苯基吲哚)等各类商业染料用于细胞核靶向成像，这些染料虽然能够准备定位到细胞核微区，但同时存在合成步骤复杂、造价昂贵、毒性大等不足。因此，亟待开发一种生物相容性好、合成简单、成本低廉的荧光材料以用于细胞核靶向成像。荧光碳纳米点作为碳纳米材料家族的新成员，因其优异的光学性能、生态友好性、可持续性和生物相容性而受到广泛关注。这些特性使其成为传统商业染料在生物医学领域应用的有效替代。然而，发明人研究发现，现已报道的大多数碳纳米点在用于细胞核定位时仍需借助靶向核的生物试剂，无法单独的、直接的定位到细胞核，绝大多数的荧光碳纳米点在细胞成像时候只浸染细胞质。极少能进入细胞核的荧光碳纳米点同时也会浸染细胞质，无法实现细胞核的特异性染色，而且这类碳纳米点的还存在合成步骤耗时、大量有机溶剂消耗、后处理复杂等缺点。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供荧光碳纳米点及制备方法与其在细胞核靶向成像中的应用，本发明提供的荧光碳纳米点具有自靶向细胞核的性质，能够作为细胞核特异性荧光成像探针，以实现细胞核的高分辨成像和动态监测。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
7.一方面，一种荧光碳纳米点，以苯二胺和烷基伯胺盐酸盐为原料制备获得。
8.发明人在前研究中获知，当不同苯二胺经过溶剂热处理可以获得不同荧光颜色的荧光碳纳米点，例如溶剂热处理的对苯二胺、间苯二胺和邻苯二胺获得碳量子点分别可以发射红色荧光、蓝色荧光和绿色荧光，为了调节荧光发光颜色以更好的适应细胞核的荧光成像，本发明首先采用烷基伯胺作为另一种原料调节苯二胺的碳纳米点的荧光颜色。
9.然而经过实验发现，以苯二胺和烷基伯胺为原料无法获得碳纳米点。本发明经过
实验意外发现采用烷基伯胺盐酸盐代替烷基伯胺，能够获得碳纳米点，而且能够使获得的碳纳米点与单一苯二胺获得的碳纳米点的荧光颜色并不相同，如间苯二胺与烷基伯胺盐酸盐为原料获得的碳纳米点发射绿色荧光，邻苯二胺与烷基伯胺盐酸盐为原料获得的碳纳米点发射红色荧光。
10.本发明在对获得的碳纳米点进行细胞成像时，意外的发现，本发明获得的荧光碳纳米点具有自靶向细胞核的性质。
11.制备碳纳米点的方法一般为水热法或溶剂热法，而这些方法存在合成步骤耗时、大量有机溶剂消耗、后处理复杂等缺点。因而另一方面，一种荧光碳纳米点的制备方法，以苯二胺和烷基伯胺盐酸盐为原料，进行微波辅助固相反应获得荧光碳纳米点。
12.由于微波辅助固相反应能够大幅降低反应时间，因而本发明采用微波辅助固相反应进行制备。然而，本发明在以苯二胺作为原料进行微波辅助固相反应时，无论如何调节时间均无法使苯二胺反应产生碳纳米点。而本发明经过实验发现，以苯二胺和烷基伯胺盐酸盐为原料，进行微波辅助固相反应时，能够获得荧光碳纳米点。表明在进行微波辅助固相反应时，烷基伯胺盐酸盐的添加能够促进碳纳米点的生成，从而降低碳纳米点的反应时间。同时解决了大量有机溶剂消耗、后处理复杂等缺点。
13.由于本发明提供的荧光碳纳米点具有自靶向细胞核的性质，因而第三方面，一种上述荧光碳纳米点在细胞核荧光成像中的应用。
14.第四方面，一种细胞核荧光染色试剂，包括荧光染料和缓冲溶液，所述荧光染料为上述荧光碳纳米点。
15.本发明的有益效果为：
16.(1)本发明利用不同的苯二胺与伯胺盐酸盐反应可以直接合成两种不同发光颜色的碳纳米材料。
17.(2)本发明采用微波辅助固相合成，过程迅速，无溶剂消耗，能耗低，污染小。
18.(3)本发明合成的荧光碳纳米材料能够快速进入细胞，并且自靶向到细胞核。
19.(4)本发明提出的自靶向细胞核荧光碳纳米材料的合成方法，操作简便、成本低、实用性强、无需任何溶剂的参与，摆脱了对反应溶剂的依赖，适于大量生产和工业推广。
附图说明
20.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
21.图1为本发明实施例1制备的荧光碳纳米材料的透射电镜图；
22.图2为本发明实施例2制备的荧光碳纳米材料的透射电镜图；
23.图3为本发明实施例3制备的荧光碳纳米材料的x射线粉末衍射图；
24.图4为本发明实施例4制备的荧光碳纳米材料的x射线粉末衍射图；
25.图5为本发明实施例3制备的荧光碳纳米材料的激发(左)和发射(右)光谱图；
26.图6为本发明实施例4制备的荧光碳纳米材料的激发(左)和发射(右)光谱图；
27.图7为本发明实施例1制备的荧光碳纳米材料作为细胞核靶向探针的荧光成像图；
28.图8为本发明实施例2制备的荧光碳纳米材料作为细胞核靶向探针的荧光成像图。
具体实施方式
29.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
30.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
31.鉴于现有碳纳米点存在无法单独的、直接的定位到细胞核，本发明提出了荧光碳纳米点及制备方法与其在细胞核靶向成像中的应用。
32.本发明的一种典型实施方式，提供了一种荧光碳纳米点，以苯二胺和烷基伯胺盐酸盐为原料制备获得。
33.本发明苯二胺和烷基伯胺盐酸盐为原料制备获得荧光碳纳米点不仅改变了苯二胺制备碳纳米点的原有荧光颜色，而且具有自靶向细胞核的性质。
34.烷基伯胺盐酸盐的化学式为rnh2·
hcl，r为烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基等。r优选为c1～c5的烷基。
35.该实施方式的一些实施例中，苯二胺与烷基伯胺盐酸盐的质量比为1:0.02～2。
36.在一种或多种实施例中，间苯二胺与伯胺盐酸盐的反应质量比为1:0.02～2，
37.邻苯二胺与伯胺盐酸盐的反应质量比为1:0.05～0.5。
38.该实施方式的一些实施例中，荧光碳纳米点的粒径1～10nm。粒径更小容易进入细胞。
39.本发明的另一种实施方式，提供了一种荧光碳纳米点的制备方法，以苯二胺和烷基伯胺盐酸盐为原料，进行微波辅助固相反应获得荧光碳纳米点。
40.本发明通过烷基伯胺盐酸盐的添加促进微波辅助固相反应时的荧光碳纳米点的生成，大大降低了碳纳米点的反应时间。同时解决了大量有机溶剂消耗、后处理复杂等问题。
41.该实施方式的一些实施例中，反应时间为0.5～10min。
42.该实施方式的一些实施例中，将苯二胺和烷基伯胺盐酸盐混合均匀后，进行微波辅助热解反应。
43.在一种或多种实施例中，混合方法为研磨。
44.该实施方式的一些实施例中，微波的功率为600～800w。
45.烷基伯胺盐酸盐的选择及与苯二胺的配比与上述一致。
46.本发明的第三种实施方式，提供了一种上述荧光碳纳米点在细胞核荧光成像中的应用。
47.本发明的第四种实施方式，提供了一种细胞核荧光染色试剂，包括荧光染料和缓冲溶液，所述荧光染料为上述荧光碳纳米点。
48.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
49.实施例1
50.称取0.1g间苯二胺和0.02g甲胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到50ml烧杯中，置于功率为700w的微波炉中固相反应，1分钟后即可制得具有绿色荧光的碳纳米点。
51.实施例2
52.称取0.8g邻苯二胺和0.4g乙胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到100ml烧杯中，置于功率为700w微波炉中固相反应，3分钟后即可制得具有红色荧光的碳纳米点。
53.实施例3
54.称取0.6g间苯二胺和0.2g丙胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到100ml烧杯中，置于功率为700w的微波炉中固相反应，5分钟后即可制得具有绿色荧光的碳纳米点。
55.实施例4
56.称取0.1g邻苯二胺和0.05g丁胺盐酸盐，放置于研钵中，充分研磨混匀，转移到50ml烧杯中，置于功率为700w的微波炉中固相反应，7分钟后即可制得具有红色荧光的碳纳米材料。
57.如图1所示为实施例1制备的绿色荧光碳纳米材料的透射电镜表征图，合成的碳纳米材料大小均一，呈近似球形；如图2所示为实施例2制备的红色荧光碳纳米材料的透射电镜表征图，合成的碳纳米材料具有良好的单分散性；从透射电镜图可以看出合成的荧光碳纳米材料粒径均小于10nm，为碳纳米点，因此极易进入细胞。
58.如图3所示为实施例3制备的绿色荧光碳纳米点的x射线粉末衍射图，表明合成的材料是无定型碳结构；如图4所示为实施例4制备的红色荧光碳纳米点的x射线粉末衍射图，证明合成的材料也属无定型碳结构。
59.如图5所示，实施例3制备的绿色荧光碳纳米点的最佳激发波长和发射波长分别为460nm和520nm；如图6所示，实施例4制备的红色荧光碳纳米点的最佳激发和发射波长分别为530nm和600nm。
60.进行细胞核染色实验，过程为：首先，将hela细胞接种在置于12孔板中的细胞载玻片上，该12孔板含有100u
·
ml
‑1的青霉素和链霉素以及10％的胎牛血清，然后在5％co2加湿培养箱，37℃培养48小时。将培养基更换为ph＝3.5的含有绿色、红色碳纳米点的缓冲溶液，培养20min。成像前，使用1ml ph＝3.5的nah2po4‑
柠檬酸缓冲溶液冲洗复合负载的细胞3次。通过荧光显微镜拍摄。结果如图7所示，实施例1制备的绿色荧光碳纳米点能够快速进入细胞，并且靶向定位到细胞核，将细胞核染色发出高分辨的绿色荧光；如图8所示，实施例2制备的红色荧光碳纳米点能够快速进入细胞，并且靶向定位到细胞核，将细胞核染色发出明亮的红色荧光。
61.实施例5
62.称取0.1g邻苯二胺，置于功率为700w的微波炉中固相反应，反应0.3分钟内均无法获得荧光碳纳米点。且对产物进行荧光检测，没有荧光产生。
63.实施例6
64.0.4g间苯二胺与0.2g甲胺盐酸盐，加入20ml水，180℃水热反应12小时获得具有绿色荧光的碳纳米点。该碳纳米点具有自靶向细胞核的性质，但是相比实施例1的效果较差
(仍有少部分碳纳米点位于细胞核中)。
65.实施例7
66.0.4g间苯二胺加入至20ml乙醇中，180℃溶剂热反应12小时获得具有蓝色荧光的碳纳米点。该碳纳米点不具有自靶向细胞核的性质。
67.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。