一种谷胱甘肽硫转移酶保护铜纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用与流程

本发明涉及铜纳米簇合成技术领域，尤其涉及一种谷胱甘肽硫转移酶保护铜纳米簇的制备方法及其在金霉素检测中的应用。

背景技术：

谷胱甘肽硫转移酶是一类存在于所有生物中且可与细胞质或细胞膜结合的多功能酶，可溶性谷胱甘肽硫转移酶广泛分布于全身，在肝脏、肾脏、大脑等都发挥至关重要的作用。它通过催化还原谷胱甘肽，生成多种亲电性物质，从而保护细胞免受药物、内源性过氧化物自由基和有毒代谢物等有毒化学物质的侵害，许多内源性化合物如前列腺素和类固醇的代谢也与谷胱甘肽结合反应有关，因此，谷胱甘肽硫转移酶是防御正常代谢过程产生的还原性和毒性亲电性物质的一种重要生物酶。

小尺寸(<2.2nm)的金属纳米团簇具有类分子的性质，能够光致荧光，具有稳定性良好，合成条件温和，毒性低、生物相容性高等优点。由于蛋白中含有还原性氨基酸，因此具有还原能力，通常以稳定剂和还原剂的形式作用于金属中心，蛋白保护的金属纳米簇在适当配体作用下表现出较强的荧光，而蛋白的二级结构和生物功能一般不会显著改变，蛋白的结构稳定可保证其荧光性能不会因发生聚集而被淬灭。由于铜的储存量大、廉价等优点，是制备纳米簇的理想原料，蛋白保护的铜纳米簇粒径适中，分散性好，性质稳定，是应用于分析和生物领域的理想荧光材料。

金霉素是一种广谱四环素类抗生素，因其高效、价格低廉等优点而广泛应用于畜牧业中，主要用于抑制革兰阳性菌和阴性菌的感染，也可作为促进生长剂用于动物饲料中；但使用剂量不当也产生了很多副作用，如造成环境污染、细菌产生耐药性等。针对金霉素的传统检测方法具有稳定性差、灵敏度低、耗时长等局限性，因而急需开发一种快捷高效的检测方法。谷胱甘肽硫转移酶可保护细胞免受有毒化学物质侵害，但目前为止没有直接的方法来确认它与金霉素之间的相互作用，因此，开发荧光传感等新技术就显得至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种谷胱甘肽硫转移酶保护铜纳米簇的制备方法及其在在金霉素检测中的应用，以谷胱甘肽硫转移酶为模板，采用一步合成法在水溶液中制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，具有独特的光物理特性、价格低廉、几乎无毒且具有优异的生物相容性，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度好。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种谷胱甘肽硫转移酶保护铜纳米簇的制备方法，具体步骤如下：

s1、在搅拌下将谷胱甘肽硫转移酶加入硫酸铜溶液中，用氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph为11-13，反应6-14分钟，得到溶液a；

s2、将二硫苏糖醇(dtt)加入到步骤s1得到的溶液a中，并调节溶液ph至6-8，反应6-10小时，得到溶液b；

s3、将步骤s2得到的溶液b，用分子截留量为25kda的透析袋在磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，使蛋白尽可能的恢复到天然状态，产物保存在4℃条件下，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

优选地，所述s1中，氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph为12，反应10分钟。

优选地，所述s1中，谷胱甘肽硫转移酶的浓度为20mgml^-1、硫酸铜溶液的浓度为5×10^-3moll^-1。

优选地，所述s2中，二硫苏糖醇(dtt)加入到步骤s1得到的溶液a中，并调节溶液ph至7，反应持续8小时。

本发明还提供了一种谷胱甘肽硫转移酶保护铜纳米簇的制备方法得到的谷胱甘肽硫转移酶保护铜纳米簇在金霉素检测中的应用，用磷酸缓冲液稀释谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，加入不同浓度的金霉素混合均匀，并在室温条件下孵育，激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的荧光发射逐渐红移且荧光强度逐渐增强，实现检测。

优选地，在室温条件下孵育5分钟，在325nm激发波长条件下，实现检测。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明以谷胱甘肽硫转移酶为模板，采用一步合成法在水溶液中制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，具有独特的光物理特性、价格低廉、几乎无毒且具有优异的生物相容性。

2、本发明制备的谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，检测金霉素方法快速简单、检测灵敏度好，是应用于生物和医学领域的理想荧光纳米材料。

附图说明

图1为本发明制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的激发光谱和发射光谱图；

图2为本发明不同反应时间制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的荧光光谱图；

图3为本发明不同浓度二硫苏糖醇条件下谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的荧光光谱图；

图4为本发明不同浓度谷胱甘肽硫转移酶反应条件下谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的荧光光谱图；

图5为本发明条件优化后的谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的透射电镜图；

图6为本发明加入不同浓度的金霉素后谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇溶液的荧光发射光谱图；

图7为本发明加入不同离子后谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇检测金霉素的抗干扰能力示意图。

具体实施方式

下面结合附图将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以使本领域的技术人员能够更好的理解本发明的优点和特征，从而对本发明的保护范围做出更为清楚的界定。本发明所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为提高产物的发光性能，包括以下步骤：

在持续搅拌的条件下，将谷胱甘肽硫转移酶加入到硫酸铜溶液中，并用氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph；十分钟后，将二硫苏糖醇加入到混合溶液中，并调节溶液ph，反应时间为0小时；利用荧光光谱仪检测产物的激发光谱和发射光谱。增加反应时间，用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物；观察不同反应时间产物的荧光光谱，随着反应时间的增加，荧光强度逐渐增强，反应时间为8小时荧光强度达到最强；因此选择8小时作为制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的最佳反应时间。

在持续搅拌的条件下，将谷胱甘肽硫转移酶加入到硫酸铜溶液中，并用氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph；十分钟后，将1mg二硫苏糖醇加入到混合溶液中，并调节溶液ph，反应时间为8小时；用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物；利用荧光光谱仪检测产物发射光谱。增加二硫苏糖醇使用量，观察荧光光谱，随着二硫苏糖醇使用量的增加，荧光强度并未增强，当使用1mg的二硫苏糖醇时，荧光强度最佳；因此选择1mg二硫苏糖醇作为制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的最佳使用量。

在持续搅拌的条件下，将谷胱甘肽硫转移酶加入到硫酸铜溶液中，并用氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph；十分钟后，将1mg二硫苏糖醇加入到混合溶液中，并调节溶液ph，反应时间为8小时；用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物；利用荧光光谱仪检测产物的发射光谱。增加谷胱甘肽硫转移酶的浓度，观察荧光光谱，随着谷胱甘肽硫转移酶浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当使用20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶时，荧光强度最佳；因此选择20mgml^-1谷胱甘肽硫转移酶作为制备谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的最佳浓度。条件优化后制备的谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇簇尺寸大小分布均一，其平均粒径约为2nm。

以谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇为荧光探针检测金霉素：

用磷酸缓冲液稀释谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，加入不同浓度的金霉素混合均匀，并在室温条件下孵育5分钟，在325nm激发波长条件下，随着金霉素浓度的逐渐增加，谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的荧光发射逐渐红移且荧光强度逐渐增强。

用磷酸缓冲液稀释谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，加入金霉素混合均匀，再加入常见无机盐，并在室温条件下孵育5分钟，比较其荧光光谱，结果表明这些无机盐离子对荧光强度的影响很小，可认为常见无机盐离子不会对金霉素的检测产生干扰作用，该方法可用于金霉素检测。

(一)谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的制备及优化

实施例一：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌2小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例二：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌4小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例三：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌6小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例四：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌8小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例五：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌9小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例六：由上述实施例一、实施例二、实施例三、实施例四、实施例五得到的谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，如图2所示，在325nm激发波长下，通过比较其荧光强度，确定最佳反应时间为8小时，谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇的荧光发射强度最强。

实施例七：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将2mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌8小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例八：100μl浓度为20mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将3mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌8小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例九：由上述实施例四、实施例七、实施例八得到的谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，如图3所示，在325nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定二硫苏糖醇为1mg时，荧光发射强度最强。

实施例十：100μl浓度为5mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌8小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例十一：100μl浓度为10mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌8小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例十二：100μl浓度为15mgml^-1的谷胱甘肽硫转移酶加入到5×10^-3moll^-1硫酸铜溶液中，在室温下持续搅拌。用1.0moll^-1氢氧化钠溶液调节混合溶液的ph至12。10分钟后，将1mg的二硫苏糖醇加入到上述溶液中，并调节溶液ph至7，混合溶液在室温下搅拌8小时。用分子截留量为25kda的透析袋，将初产物置于磷酸缓冲液中透析24小时，以去除多余的反应物，并使蛋白尽可能的恢复到天然状态，得到谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇。

实施例十三：由上述实施例四、实施例十、实施例十一、实施例十二得到的谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，如图4所示，在325nm激发波长下，通过比较其各自荧光发射强度，确定谷胱甘肽硫转移酶浓度为20mgml^-1时，荧光发射强度最强。

(二)谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇作为荧光探针检测金霉素

实施例十四：用400μl磷酸盐缓冲液稀释100μl谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇原液，然后加入终浓度为0～120μm的金霉素溶液，在室温下孵育5分钟后，用荧光光谱仪检测325nm激发波长下的荧光光谱。

实施例十五：用400μl磷酸缓冲液稀释100μl谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，加入120μm的金霉素混合均匀，再加入溴化钾溶液混合均匀，并在室温条件下孵育5分钟，比较加入溴化钾和不加溴化钾时的荧光光谱。

实施例十六：用400μl磷酸缓冲液稀释100μl谷胱甘肽硫转移酶-铜纳米簇，加入120μm的金霉素混合均匀，再加入硝酸镁溶液混合均匀，并在室温条件下孵育5分钟，比较加入硝酸镁和不加硝酸镁时的荧光光谱。

实施例十七：由上述实施例十五、实施例十六得到的荧光强度比，如图6所示，在325nm激发波长，加入无机盐和不加入无机盐时的荧光强度无明显变化，不会对金霉素检测产生干扰作用。

本发明中披露的说明和实践，对于本技术领域的普通技术人员来说，都是易于思考和理解的，且在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，也应视为本发明的保护范围。