一种基于上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针的制备及应用的制作方法

本发明涉及分子印迹荧光探针技术领域，具体为一种基于上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针的制备及应用。

技术背景

自20世纪50年代以来，全氟辛烷磺酸(pfos)由于其疏水和疏油的特性，在世界范围内广泛生产并被用作纺织品、润滑油、化妆品、防水材料和灭火泡沫的原材料。由于pfos结构中c-f键高键能(约110kcal/mol)，使其在环境中具有较高的热稳定性和化学惰性。在强酸、强碱及氧化剂中很难被分解，也不会发生光解、水解以及生物降解等作用，因而pfos一旦排放到环境中就很难被分解。pfos作为一种广泛存在的污染物，已被广泛报道。毒理学研究表明，即使微量的pfos也可能对人体肝脏、肾脏造成严重的功能损害，对脂肪酸代谢、生殖系统、激素分泌系统产生不良影响。因此开发高灵敏度的分析方法来检测环境中的全氟辛烷磺酸具有重要意义。

目前，全氟辛烷磺酸的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法(lc-ms)、液相色谱-串联质谱法(lc-ms-ms)和气相色谱-质谱联用法(gc-ms)。虽然这些分析方法具有良好的灵敏度，但这些仪器相对昂贵且涉及复杂的样品制备、仪器操作复杂且耗时，限制了其应用推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种基于上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针的制备及应用。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：

一种基于上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针的制备及应用，制备方法为，

(1)将氨基修饰的上转换纳米粒子nayf4:yb,er(ucnps)加入30ml去离子水中，超声10min使其充分分散；

(2)加入模板分子全氟辛烷磺酸(pfos)和功能单体进行预组装；

(3)搅拌30min后再依次加入致孔剂和氢氧化钠溶液搅拌反应30min；

(4)加入催化剂氨水和交联剂正硅酸乙酯，室温下搅拌12h进行反应；

(5)反应完成后将反应液离心，使用洗脱液将固体产物中的模板分子与致孔剂洗脱；

(6)将产物置于真空干燥箱中干燥至恒重；

应用方法为，

(5)于10ml具塞比色管中依次加入分子印迹荧光探针分散液、britton-robinson缓冲溶液调节体系酸度，混合均匀，分子印迹荧光探针分散液与britton-robinson缓冲溶液的比例为8:1；

(6)加入pfos标准溶液，然后使用去离子水定容至10ml；

(7)于室温下反应10min，待反应充分后转移至比色皿；

(8)使用980nm激光器激发，记录体系在545nm处的荧光发射光谱及强度，根据545nm处的荧光强度的变化值来实现对pfos的定量检测。

优选的，氨基修饰ucnps:pfos:功能单体:致孔剂:氢氧化钠:teos:氨水的质量比为(1～5):1:(1～5):(60～100):(10～15):(5～10):(5～10)。

优选的，所述洗脱液为体积比为8:2的极性有机溶剂与低浓度的酸或碱溶液的混合液。

优选的，所使用的分子印迹荧光探针分散液的浓度为0.01～0.2g/l。

优选的，britton-robinson缓冲溶液调节体系的ph为2～8。

本发明的有益效果是：本发明结合表面分子印迹技术和上转换荧光技术，在氨基修饰的nayf4:yb,er表面形成对全氟辛烷磺酸具有特异性识别位点的二氧化硅薄层。基于pfos与nayf4:yb,er表面的氨基和含氟基团的特异结合作用，通过nayf4:yb,er到pfos的电荷转移的猝灭机制导致分子印迹荧光探针的荧光猝灭。根据荧光强度变化可实现对pfos进行定量检测。本发明将具有低细胞毒性的上转换粒子与具有优异选择性的介孔印迹材料相结合，在纳米技术和生物检测等领域具有良好应用前景。

本发明的优点在于：

(1)采用nayf4:yb,er作为荧光信号材料，与传统的有机荧光染料相比，其具有低细胞毒性、高穿透深度、光化学稳定性高、荧光背景干扰小等优势，在荧光生物检测和成像领域有着巨大的应用前景。

(2)采用表面分子印迹技术，使得印迹位点位于上转换材料表面，并且具有高度贯通的孔结构，从而大大提高了目标分子的传递能力，从而能实现高效快速检测pfos。

(1)所制备的分子印迹聚合物可以用于环境水样中pfos的检测，该方法快速、简便、灵敏度高、选择性好，相比于色谱质谱的分析方法，降低了检测成本，提高了检测效率。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为mip的n2吸附-脱附等温曲线及孔径分布图；

图2为ph＝3.38时mip(a)和nip(c)与不同浓度pfos结合的荧光发射光谱以及mip(b)与nip(d)的stern-volmer方程拟合线性结果图；

图3为溶液的ph值对pfos与mip结合后体系荧光响应的影响；

图4为mip对相同浓度的pfos的及类似物的选择性考察。

具体实施方式

以下通过具体实施例和附图更为详细的说明本发明，但下面具体描述内容仅为示例性而非限制性，实施例中描述的技术特征或技术特征的组合不应当被认为是孤立的，他们可以被相互组合从而达到更好的技术特征。

实施例1

上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针的制备：

(1)上转换材料nayf4:yb,er的制备：将含1mmol的lncl3(ln＝y:yb:er，80:18:2)的5ml水溶液加入50ml烧杯中，然后加入2mmol柠檬酸钠和10ml水，磁力搅拌10min，将nacl(2.88mmol)和nh4f(6mmol)的5ml水溶液、oa(10ml)、乙二醇(5ml)加至上述溶液，搅拌30min后将混合溶液转移至50ml反应釜中，180℃反应6h。反应完后使用乙醇离心洗涤3次，最后将所得固体置于60℃真空干燥箱中干燥6h，得到上转换材料nayf4:yb,er(ucnps)。

(2)氨基修饰ucnps的制备：称取100mgucnps于100ml圆底烧瓶中，加入10ml环己烷和1mligepalco-520，剧烈搅拌10min，然后，分别量取4mligepalco-520和800μl25％的氨水，依次加入到烧瓶中。用塞子封口，超声分散20min形成透明乳液。用微量进样器向其中逐滴滴加400μl正硅酸乙酯。搅拌过夜后，将500μl的aptes逐滴滴加至上述溶液。继续反应3～4h后停止搅拌，让反应液在室温下陈化2h。将陈化后的反应液离心分离并用乙醇洗涤3次，最后将所得固体置于60℃的真空干燥箱中干燥6h，获得氨基修饰的上转换纳米材料。

分子印迹荧光探针的制备：准确称取氨基修饰的上转换纳米粒子nayf4:yb,er(ucnps)50mg加入30ml去离子水中，超声10min使其充分分散，然后加入30mg的模板分子全氟辛烷磺酸(pfos)和100μl的功能单体n,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺进行预组装，搅拌30min后依次加入1.6ml的0.2mctab和0.2ml的0.2m氢氧化钠溶液搅拌反应30min，之后加入200μl的氨水和200μl的teos，室温下搅拌12h进行反应。反应完成后将反应液离心，使用乙醇和0.1m的hcl(8:2，v/v)洗脱液将pfos和ctab洗脱，然后用去离子水离心清洗以除去多余的盐酸溶液，将产物置于真空干燥箱中干燥至恒重，即可得到基于上转换的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针。非印迹荧光探针制备过程除不加入模板分子pfos外，其他步骤同上述制备过程一致，其中，使用的功能单体优选为n,o-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺、(3,3,3-三氟丙基)甲基二氯硅烷、(3,3,3-三氟丙基)甲基二甲氧基硅烷或(3,3,3-三氟丙基)三乙氧基硅烷等含氟硅烷化试剂，但不局限于此。

实施例2

上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针的应用：

于10ml具塞比色管中依次加入800μl分子印迹荧光探针分散液(0.05g/l)、一定体积的br缓冲溶液，混合均匀后加入一定浓度的pfos的标准溶液，然后使用去离子水定容至10ml，于室温下反应10min，待反应充分后转移至比色皿，使用980nm激光器激发，记录体系在545nm处的荧光发射光谱及强度，根据545nm处的荧光强度的变化值来实现对pfos的定量检测；pfos与非印迹荧光探针的结合情况实验在相同条件下同时开展。

实施例3

对上述所合成的上转换材料的全氟辛烷磺酸介孔分子印迹荧光探针进行表征：

(1)图1分别是mip的n2吸附-脱附等温曲线(a)和孔径分布图(b)，根据吸附脱附曲线类型可判断样品的孔隙特点，由图1(a)可知n2吸附-脱附等温曲线为典型的langmuirⅳ型曲线，当p/p0大于0.4时，出现一个较宽的滞后环，表明mip表面孔道具有较窄的孔口。此外，mip的比表面积为38.123m²/g，孔体积为0.033cm³/g。由图1(b)可知，mip的孔径分布较宽主要集中2～50nm，介孔的平均孔径为3.786nm。mip较大的比表面积和大小适中的孔径提高了目标分子pfos的传递能力。

(2)图2(a)、(c)为mip和nip与不同浓度pfos结合的荧光发射光谱以及(b)、(d)为mip和nip的stern-volmer方程拟合线性结果图，具体制作步骤为：在10ml具塞比色管中依次加入800μl分子印迹荧光探针分散液(0.05g/l)、一定体积的br缓冲溶液，混合均匀后加入一定浓度的pfos标准溶液，然后使用去离子水定容至10ml，于室温下反应10min，待反应充分后转移至比色皿，使用980nm激光器激发，记录体系在545nm处的荧光发射光谱及强度，由图2(a)和(c)可知，pfos均能猝灭mip和nip的荧光，且pfos对mip的猝灭常数大于nip的猝灭常数，因此分子印迹聚合物对pfos的猝灭效果更加明显，进一步说明分子印迹聚合物对pfos具有特异性。pfos导致荧光猝灭归因于其高的电负性，与荧光探针mip发生静电和氟-氟相互作用导致荧光猝灭，当调节体系ph＝3.38时静电与氟-氟共同作用，mip和nip的荧光均能被pfos猝灭，由图(b)和(d)可知，在0.01～1.5nmol/l范围内具有良好的线性关系，mip与pfos作用后猝灭程度更大，线性方程为y＝0.8559x 0.0402，r²＝0.9962，同时nip与pfos作用后荧光也会猝灭，线性方程为y＝0.2361x 0.0424，r²＝0.9951，计算得印迹因子可以达到3.63，表明mip选择性高于nip，归因于mip表面存在大量的特异性识别位点。

(3)由于ph不仅影响复合材料的表面环境，还会影响复合材料表面基团的电荷，从而影响目标分子与探针的结合，因此，我们在ph值3～10的范围内，考察了ph值对mip检测pfos的影响，体系选择br缓冲溶液调节酸度；具体步骤为：在10ml具塞比色管中依次加入800μl分子印迹荧光探针分散液(0.05g/l)、不同体积的br缓冲溶液，混合均匀后加入一定浓度的pfos的标准溶液，然后使用去离子水定容至10ml，于室温下反应10min，待反应充分后转移至比色皿。使用980nm激光器激发，记录体系在545nm处的荧光发射光谱及强度；由图3可知，随着体系ph增大，pfos对mip的荧光猝灭程度降低，由于pfos带负电荷，在水中有较低的pka＝-3.27，在酸性条件下mip表面的氨基质子化后带正电，同时由于其存在含氟功能单体，可以通过静电与氟-氟相互作用作为受体结合pfos，从而增强mip荧光猝灭值。当溶液的ph增大，mip表面氨基去质子化从而使其带负电，与阴离子形态的pfos存在静电斥力的作用，阻碍mip荧光猝灭，但由于mip表面具有识别pfos的含氟基团，仍能碱性条件下与pfos相互作用导致荧光猝灭。与ph值为酸性时相比，碱性条件下mip荧光猝灭程度较低。为了获得更高的灵敏度，因此体系选择ph＝3.38进行后续试验。

(4)为了考察分子印迹荧光探针对pfos的检测选择性，我们选择pfos的结构类似物铬雾抑制剂(f-53b)、全氟辛酸(pfoa)、全氟己基磺酸盐(pfhxs)和全氟丁基磺酸钾(pfbs)进行研究。具体步骤为：在10ml具塞比色管中依次加入800μlmip分散液(0.05g/l)、一定体积的br缓冲溶液，混合均匀后加入不同浓度的pfos结构类似物，然后使用去离子水定容至10ml，于室温下反应10min，待反应充分后转移至比色皿，使用980nm激光器激发，记录体系在545nm处的荧光发射光谱及强度，由图4可以看出，mip对模板分子pfos具有一定的识别能力，并且猝灭强度最大，印迹因子为3.63，其次对于pfos结构类似物也有一定的猝灭量，但特异选择性并不高；此外，f-53b、pfoa与pfos的结构大体相同，但f-53b、pfoa对mip荧光探针的猝灭效果明显低于pfos且f-53b的猝灭效果大于pfoa，这表明c-f键跟磺酸基官能团在印迹位点形成中起着重要作用。由于pfhxs和pfbs与pfos结构的差别在于碳链长度的不同，随着碳链长度的增加对mip荧光探针的猝灭效果更加明显，说明c-f键会影响识别效果；结果表明，这是由于在印迹合成的过程中，在mip表面形成了很多特异性识别位点，模板分子pfos可以与mip发生强的氟-氟与静电相互作用从而导致荧光发生明显猝灭，其次，因为f-53b、pfoa、pfhxs、pfbs与pfos有着不同的空间构型和分子质量，它们也可以与mip发生静电与氟-氟相互作用，但是由于印迹位点的识别构型不能与它们完全匹配，导致荧光猝灭不明显。

本文虽然给出了本发明的实施例，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明精神的情况下，可以对本文的实施例进行改变。上述实施例只是示例性的，不应以本文的实施例作为本发明权利范围得到限定。