纳米荧光探针、其制备方法及应用与流程

本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种纳米荧光探针、其制备方法及应用。

背景技术：

重金属离子污染已成为环境卫生领域的重要问题之一。生活水中过量的重金属离子将严重威胁人类健康。众所周知，汞污染，如日本的水俣病，对财产和健康造成了巨大的损害。此外，人体中过量的金属离子如铁、铜、铅、镉等金属离子会破坏骨骼和肾脏，引起高血压、神经系统疾病和脑部疾病，而随着工业化的发展，我国大部分的河流与湖泊都受到重金属离子的影响，因此，对水体中重金属离子的检测与清除具有重要的意义。

目前已有的重金属离子检测方法中常用的有质谱法、色谱法、电化学检测和x射线荧光光谱等。这些方法需要昂贵的仪器支持，并且需要较高的技术培训，操作中也需较多的时间。因此，开发新型的简易安全的重金属离子检测方法很有必要，并且由于重金属离子对水体的污染危害，兼具检测与清除作用的纳米材料具备良好的运用前景，但现在缺少可靠的方案。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种纳米荧光探针、其制备方法及应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种纳米荧光探针，其通过以下步骤制备得到：

1)将壳聚糖固体溶于超纯水中，超声分散并搅拌；

2)将步骤1)得到的溶液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在加热条件下反应；

3)待步骤2)得到的反应物冷却至室温后，先用滤纸初步过滤，得到的滤液再用离心机离心，离心得到的滤液最后用水相滤膜过滤，得到澄清溶液；

4)将步骤3)得到的澄清溶液用透析袋透析，最后收集透析袋内溶液，冷冻干燥，得到壳聚糖纳米粒子，即为所述纳米荧光探针。

优选的是，其通过以下步骤制备得到：

1)将壳聚糖固体溶于超纯水中，超声分散并搅拌；

2)将步骤1)得到的溶液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在200℃下持续反应10个小时；

3)待步骤2)得到的反应物冷却至室温后，先用滤纸初步过滤，得到的滤液再用离心机于10000转/分钟下离心，离心得到的滤液最后用0.22μm的水相滤膜过滤，得到澄清溶液；

4)将步骤3)得到的澄清溶液用透析袋透析8小时，每四个小时换一次水，最后收集透析袋内溶液，冷冻干燥，得到壳聚糖纳米粒子，即为所述纳米荧光探针。

优选的是，所述步骤3)中的透析袋的截留分子量为1000da。

本发明还提供一种如上所述的纳米荧光探针的应用，其用于液相对象中的重金属离子浓度检测。

优选的是，该纳米荧光探针用于重金属离子浓度检测的方法包括以下步骤：

1)制定标准曲线：

称取干燥的所述纳米荧光探针，加入超纯水配制成浓度为c的纳米荧光探针溶液；

然后将得到的溶液等分为若干份，并按一定的梯度分别加入体积均为v的不同浓度的重金属离子溶液，在400nm激发光条件下，测试每份溶液在478nm处的荧光强度，将测得的荧光强度作为y轴，对应的重金属离子浓度作为x轴，制作标准曲线图，进行线性拟合得到重金属离子浓度与荧光强度关系的标准曲线；

2)对液相样品中的重金属离子浓度进行检测：

称取干燥的所述纳米荧光探针，加入超纯水配制成浓度为c的纳米荧光探针溶液，在得到的纳米荧光探针溶液中加入体积为v0的液相样品得到混合溶液，在荧光光谱仪下，检测得到的混合溶液在400nm的激发光下478nm位置处的荧光强度，利用步骤1)得到的标准曲线，计算得到液相样品中的重金属离子的浓度。

优选的是，该纳米荧光探针用于重金属离子浓度检测的方法包括以下步骤：

1)制定标准曲线：

称取干燥的所述纳米荧光探针，加入超纯水配制成浓度为0.2mg/ml的纳米荧光探针溶液；

然后将得到的溶液等分为20份，在得到的20份溶液中分别加入体积均为v，浓度依次为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0mm的重金属离子溶液，然后在400nm激发光条件下，测试每份溶液在478nm处的荧光强度，将测得的荧光强度作为y轴，对应的重金属离子浓度作为x轴，制作标准曲线图，再进行线性拟合得到重金属离子浓度与荧光强度关系的标准曲线；

2)对液相样品中的重金属离子浓度进行检测：

称取干燥的所述纳米荧光探针，加入超纯水配制成浓度为0.2mg/ml的纳米荧光探针溶液，在得到的纳米荧光探针溶液中加入体积为v0的液相样品得到混合溶液，在荧光光谱仪下，检测得到的混合溶液在400nm的激发光下478nm位置处的荧光强度，利用步骤1)得到的标准曲线，计算得到液相样品中的重金属离子的浓度。

优选的是，其中，重金属离子包括镉离子、钴离子、铜离子、铁离子、亚铁离子、汞离子、镍离子、铅离子中的一种或多种。

优选的是，其中，v0与v相等。

本发明还提供一种如上所述的纳米荧光探针的另一种应用，其用于清除液相对象中的重金属离子，清除方法为：将所述纳米荧光探针加入到含有重金属离子的液相对象中反应，通过所述纳米荧光探针与重金属离子结合形成固体沉淀后去除沉淀来实现重金属离子的清除。优选的是，其中，重金属离子包括镉离子、钴离子、铜离子、铁离子、亚铁离子、汞离子、镍离子、铅离子中的一种或多种。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种可用于重金属离子检测与去除的纳米荧光探针：壳聚糖纳米粒子，以及该纳米荧光探针的制备方法；本发明提供的壳聚糖纳米粒子可特异性被重金属离子荧光猝灭以及结合，通过壳聚糖纳米粒子荧光强度的变化，能快速、准确检测重金属离子的浓度；通过壳聚糖纳米粒子与重金属离子结合形成固体沉淀，能够去除水体中的重金属离子，从而能够实现重金属离子的检测和去除；并且，本发明的壳聚糖纳米粒子具有制备方法简单、水溶性好、安全和适合规模化生产等特点，有望成为解决水体重金属污染的有效方法。

附图说明

图1为本发明的实施例中的壳聚糖纳米粒子的透射电镜照片和粒径分布图；

图2为本发明的实施例中的壳聚糖纳米颗粒的吸收光谱及荧光光谱；

图3为本发明的实施例中的壳聚糖碳纳米粒子红外图谱；

图4为本发明的实施例中的单一重金属离子对壳聚糖纳米粒子的淬灭效果检测结果；

图5为本发明的实施例中的混合重金属离子对壳聚糖纳米粒子的淬灭效果检测结果；

图6为本发明的实施例中的壳聚糖纳米粒子的抗干扰性能检测结果；

图7为本发明的实施例中的壳聚糖纳米粒子对重金属的去除效果检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

实施例1

本实施例提供一种纳米荧光探针，其采用一步水热法制备得，具体步骤为：

1)将壳聚糖固体溶于超纯水中，超声分散并搅拌；

2)将步骤1)得到的溶液转移至聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱于200℃下持续反应10个小时；

3)待步骤2)得到的反应物冷却至室温后，先用滤纸初步过滤，得到的滤液再用离心机于10000转/分钟下离心，去除大颗粒沉淀，离心得到的滤液最后用0.22μm的水相滤膜过滤，得到澄清溶液；

4)将步骤3)得到的澄清溶液用透析袋透析8小时，每四个小时换一次水，去除未反应的原料小分子；最后收集透析袋内溶液，冷冻干燥，得到纯化的壳聚糖纳米粒子(碳量子点)，即为所述纳米荧光探针。本实施例中，透析袋的截留分子量为1000da。

对实施例1制得的壳聚糖纳米粒子进行性能测试

1、透射电镜观测

参照图1a，为实施例1制得的壳聚糖纳米粒子的透射电镜(tem)照片，图1b为壳聚糖纳米粒子的粒径分布图。从图中可以看出，该纳米粒子呈圆球状，粒径分布较为均一，尺寸主要分布在60-120nm范围内，平均直径为79.06nm，实施例1制备的壳聚糖纳米颗粒的尺寸大于传统的碳点(3–10nm)，原因是：壳聚糖是天然聚合物，在形成纳米粒子的过程中包含多种水解产物；此外，通过溶解壳聚糖在chi-cnps的表面上形成了聚合物膜，这增加了粒径(如图1中所标示的样点，该壳聚糖纳米粒子的粒径为54.84nm，聚合物膜为5.82nm，约占聚合物膜的十分之一)。

2、壳聚糖纳米颗粒的吸收光谱及荧光光谱

参照图2，为实施例1制得的壳聚糖纳米粒子的紫外-可见吸收光谱图(as)、荧光激发光谱(ex)和荧光发射光谱图(em)。从图中可以看出，壳聚糖纳米颗粒在200-400nm宽区间都有吸收，最大的吸收峰位于265nm处；在400nm波长的激发光下，壳聚糖纳米粒子会发出明亮的蓝绿光，荧光发射峰位于478nm处。由于该纳米粒子可用于重金属离子的检测与清除，壳聚糖纳米粒子的荧光又会受到重金属离子的影响而减弱甚至猝灭，因此，其良好的蓝绿色荧光性能能够很好的作为重金属离子的检测信号。

3、壳聚糖碳纳米粒子红外图谱

参照图3，为实施例1制得的壳聚糖纳米粒子的红外图谱，分析透射峰强度可知，壳聚糖纳米粒子的表面富含羟基、氨基、羰基等基团。壳聚糖碳纳米粒子表面含有的大量氨基、羧基，使其可与水体中重金属离子结合；在荧光猝灭的同时，重金属离子易被纳米颗粒吸附螯合聚集，形成固体沉淀，可沉降去除沉淀，从而使得其可用于实现重金属离子的检测和去除。

4、单一重金属离子对壳聚糖纳米粒子的淬灭效果检测

本实施例中，以铁离子、汞离子、铜离子为例进行举例说明，将一定浓度梯度的铁离子、汞离子、铜离子分别加入到壳聚糖纳米粒子溶液中，检测溶液在400nm的激发光下478nm位置处的荧光强度，检测结果如图4所示，其中从左至右依次为汞离子、铁离子、铜离子对壳聚糖碳纳米粒子的淬灭实验结果，可以看出壳聚糖纳米粒子的蓝绿色荧光强度会随着金属离子浓度的增加而逐步下降，这可以作为重金属离子的指示信号。

5、混合重金属离子对壳聚糖纳米粒子的淬灭效果检测

本实施例中，以铁离子、汞离子、铜离子混合而成的混合重金属离子为例进行举例说明，利用实施例1制得的壳聚糖纳米粒子制备壳聚糖纳米粒子溶液，然后等分为21份，在得到的21份溶液中分别加入体积均为v，浓度依次为0(即不加混合重金属离子)、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0mm的重金属离子溶液，然后在400nm激发光条件下，测试每份溶液在478nm处的荧光强度；将测得的荧光强度作为y轴，对应的重金属离子浓度作为x轴，制作关系曲线图，再进行线性拟合得到重金属离子浓度与荧光强度关系的线性关系曲线。参照图5a和图5b，从图5a可以看出，壳聚糖纳米粒子溶液的荧光强度随着混合重金属离子浓度的增加，逐渐减弱，当加入的混合重金属离子浓度达到6mm时，壳聚糖纳米粒子溶液的荧光强度大约减弱到未加入混合重金属离子前的四分之一。从图5b可以看出，混合重金属离子浓度同壳聚糖纳米粒子溶液的荧光强度呈现良好的线性相关，相关系数r²达到0.998，说明该壳聚糖纳米粒子能够应用于溶液中对重金属离子浓度的检测。

本实验中为方便充分表达更具通用的技术方案，是以铁离子、汞离子、铜离子混合为例进行说明，但可以理解的是，本发明中重金属离子并不限于以上铁离子、汞离子、铜离子这3种，至少还可以包括镉离子、钴离子、亚铁离子、镍离子、铅离子中的一种或多种。

6、壳聚糖纳米粒子的抗干扰性能检测

本实施例中进行了其他测试离子对壳聚糖纳米粒子的荧光淬灭实验，以检测这些测试离子是否会对壳聚糖纳米粒子是否具有只被重金属离子特异性淬灭的性能，从而判断些测试离子是否会对壳聚糖纳米粒子进行重金属离子检测产生干扰。本实施例中，检测了壳聚糖纳米粒子溶液中分别加入醋酸根离子、氯离子、溴离子、碘离子、钾离子、钙离子、钠离子、铝离子、镁离子、碳酸根离子、硝酸根离子、亚硝酸根离子、硫酸根离子、亚硫酸根离子前后的荧光强度的变化情况，结果如图6所示，其中，chi-cds表示壳聚糖纳米粒子溶液，f0是未加入测试离子前壳聚糖纳米粒子溶液的荧光强度，f是加入测试离子后之后壳聚糖纳米粒子溶液的荧光强度，可以看出f/f0几乎在1附近，说明这些测试离子不会使壳聚糖纳米粒子的荧光淬灭，从而可以说明壳聚糖纳米粒子用于重金属离子检测具有很强的抗干扰特性。

本发明的纳米荧光探针是由原材料壳聚糖水解后合成的，壳聚糖带有的氨基、羟基等基团富集在纳米粒子的表面，使其非常容易与重金属离子螯合，由于激发态电子转移与结合重金属离子后的纳米粒子聚集，导致纳米粒子与重金属离子之间发生电子转移和纳米粒子本身静态猝灭；而由于原材料壳聚糖本身的螯合作用在形成纳米粒子后进一步加强，从而能够螯合更多的重金属离子，进而沉降去除。因此，壳聚糖纳米粒子既可以检测重金属离子溶液的浓度又可以去除重金属离子。

7、壳聚糖纳米粒子对重金属的去除效果检测

参照图7a，本实施例中，是以电导率来指示废水溶液中重金属离子的浓度(溶液的电导率与所含离子的总量呈正相关关系)，其中，重金属离子为铁离子、汞离子、铜离子的混合物。从图中可以看出在未加入壳聚糖纳纳米粒子之前，液体中所含离子总量的电导率为12.48mscm^-1，加入壳聚糖纳纳米粒子溶液后，电导率降低到6.05mscm^-1，表明在加入壳聚糖纳米粒子后，水体所含的离子总量降低到48.48％。

参照图7b，(-)代表溶液中未加入壳聚糖纳纳米粒子(图中上下两排的第一个)，( )代表溶液中加入了壳聚糖纳纳米粒子(图中上下两排的第二至七个，第二个表示加入了壳聚糖纳纳米粒子的初始状态，后面的依次是1h、4h、8h、16h、24h后的状态)。其中上排在365nm激发光下成像，下排在日光下成像。结果显示，随着时间的变化在365nm激发光下，加入纳米粒子的溶液中荧光逐渐减弱；而在日光下先形成颗粒型固体，然后慢慢沉降聚集在液体底部。

本实验中为方便充分表达更具通用的技术方案，是以铁离子、汞离子、铜离子混合为例进行说明，但可以理解的是，本发明中重金属离子并不限于以上铁离子、汞离子、铜离子这3种，至少还可以包括镉离子、钴离子、亚铁离子、镍离子、铅离子中的一种或多种。

上述这些结果说明，壳聚糖纳米粒子可以对溶液中重金属进行指示和清除作用，并且由于该纳米粒子制作简单，使用简易，适合大规模生产，有望在污水处理方面发挥有效的作用。

实施例2

本实施例提供一种实施例1制得的纳米荧光探针的应用，其用于液相对象中的重金属离子浓度检测，检测的方法包括以下步骤：

1)制定标准曲线：

称取干燥的所述纳米荧光探针，加入超纯水配制成浓度为0.2mg/ml的纳米荧光探针溶液；

然后将得到的溶液等分为20份，在得到的20份溶液中分别加入体积均为v，浓度依次为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1、2.4、2.7、3.0、3.3、3.6、3.9、4.2、4.5、4.8、5.1、5.4、5.7、6.0mm的重金属离子溶液，然后在400nm激发光条件下，测试每份溶液在478nm处的荧光强度，将测得的荧光强度作为y轴，对应的重金属离子浓度作为x轴，制作标准曲线图，再进行线性拟合得到重金属离子浓度与荧光强度关系的标准曲线；可参照图5，本实施例中与图5中步骤基本相同，可共用实验结果；

2)对液相样品中的重金属离子浓度进行检测：

称取干燥的所述纳米荧光探针，加入超纯水配制成浓度为0.2mg/ml的纳米荧光探针溶液，在得到的纳米荧光探针溶液中加入体积为v0的液相样品得到混合溶液，在荧光光谱仪下，检测得到的混合溶液在400nm的激发光下478nm位置处的荧光强度，利用步骤1)得到的标准曲线，计算得到液相样品中的重金属离子的浓度。

本实施例中，重金属离子为铁离子、汞离子、铜离子的混合物。本实施例中为方便充分表达更具通用的技术方案，是以仅包含铁离子、汞离子、铜离子的混合重金属离子为例进行说明，但可以理解的是，本发明中重金属离子并不限于以上铁离子、汞离子、铜离子这3种，至少还可以包括镉离子、钴离子、亚铁离子、镍离子、铅离子中的一种或多种。

在一种优选的实施例中，v0与v相等。即保证样品检测时和制定标准曲线时的条件尽量相同，以减小误差。但可以理解的时，即使v0与v不相等，通过常规的换算也可计算出样品中的重金属离子的浓度。

实施例3

本实施例提供一种实施例1制得的纳米荧光探针的另一种应用，其用于清除液相对象中的重金属离子，清除方法为：将所述纳米荧光探针加入到含有重金属离子的液相对象中反应，通过所述纳米荧光探针与重金属离子结合形成固体沉淀后去除沉淀来实现重金属离子的清除。其中，重金属离子包括镉离子、钴离子、铜离子、铁离子、亚铁离子、汞离子、镍离子、铅离子中的一种或多种。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。