一种纳米探针及其制备方法和应用与流程

1.本技术属于医学检测的技术领域，尤其涉及一种纳米探针及其制备方法和应用。


背景技术：

2.dna异常表达与多种疾病的发生和发展存在密切关系，包括：癌症、高血压、心脏病、糖尿病、病毒感染相关疾病如肝炎和新型冠状病毒肺炎等，提示疾病相关基因可被视为具有重要临床意义的诊断标志物，对疾病的早期精准诊断和预后都具有重要意义。迄今为止，用于基因检测的传统技术包括聚合酶链式反应(pcr)、基因测序等。尽管它们具有很高的灵敏度，但需依赖于精密复杂的仪器、繁琐的实验流程以及经验丰富的检测员，限制了它们的广泛应用，特别是在经济欠发达的发展中国家。因此，探索简便高效的分析策略进行dna高灵敏性和高选择性的检测仍然是一个挑战。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本技术提供了一种纳米探针及其制备方法和应用，有效解决现有检测疾病相关基因过程中存在的检测繁琐、成本高昂以及费时费力的技术缺陷。
4.针对现有技术的不足，包括需要复杂昂贵的仪器和繁琐的实验步骤，本技术提供一种基于探针dna和二维材料，进而实现疾病相关的目的基因的高效荧光和比色可视化检测，是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
5.本技术第一方面提供了一种荧光和比色可视化的纳米探针，包括：
6.二维材料和探针dna；
7.所述二维材料为可吸附所述探针dna的二维材料，或所述二维材料可作为基底合成二维材料
‑
金属纳米粒子复合物用于催化比色检测；
8.所述探针dna可与疾病相关的目的基因互补配对；
9.所述探针dna与所述目的基因互补配对的结合力大于所述探针dna与所述二维材料的结合力。
10.另一实施例中，所述二维材料为吸附所述探针dna的二维材料时，所述二维材料选自二硫化钼纳米片、二硫化钨纳米片、二维共价有机框架、石墨烯、六角形氮化硼、黑磷、二维氧化锌和mxene中的一种或多种。
11.优选地，所述二维材料为二硫化钼(mos2)纳米片。
12.具体的，所述mos2纳米片的直径为100
‑
200nm。
13.具体的，mos2是一种二维的分层过渡金属硫族化合物纳米片，具有高比表面积，易于表面修饰，低细胞毒性和优异的光热性能可用于检测疾病的目的基因。
14.另一实施例中，所述探针dna用于制备金属簇探针；
15.所述金属簇探针的荧光金属簇选自银纳米簇、金纳米簇、铂纳米簇、铜纳米簇、金银纳米簇和铂银纳米簇中的一种或多种。
16.具体的，所述荧光金属簇由探针dna、可溶性金属盐溶液和还原剂混合反应制备得
到；所述金属簇探针为银纳米簇探针、金纳米簇探针、铂纳米簇探针、铜纳米簇探针、金银纳米簇探针和铂银纳米簇探针。
17.具体的，所述二维材料吸附所述金属簇探针，使所述荧光金属簇的荧光淬灭。
18.具体的，银纳米簇探针的制备方法，包括：将探针dna、agno3、nabh4在磷酸盐缓冲液或椰油酸钠缓冲液混合反应，制得银纳米簇探针。
19.其中，探针dna与ag

的摩尔比为1:6，或者1:8；ag

与nabh4的摩尔比为1:1，或者2:1。
20.具体的，银纳米簇探针具有优良的荧光性质，可产生可见到近红外区间荧光发射带。
21.具体的，本技术通过调控探针dna的序列和反应条件，合成不同发射波长和荧光性质的金属簇探针，可用于检测疾病相关的目的基因。
22.另一实施例中，所述纳米探针还包括荧光增强dna；所述荧光增强dna与所述目的基因的一部分dna形成互补配对；所述荧光增强dna、所述探针dna与所述目的基因互补配对形成杂交结构。
23.具体的，银纳米簇探针与荧光增强dna的混合摩尔比为1:1。
24.具体的，所述探针dna的序列分成两个部分，一部分是与检测疾病的目的基因部分互补配对，另一部分是合成金属簇探针的模板，通过两个不同模板序列的设计，得到两个不同激发和发射的金属簇探针，用于分别检测两段不同的疾病的目的基因。
25.另一实施例中，所述探针dna的数量为2个、3个、4个、5个或6个；所述探针dna的数量大于1时，所有所述探针dna之间不发生互补配对。
26.另一实施例中，所述探针dna具有如seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3所示核苷酸序列中的一种或多种；所述荧光增强dna具有如seq id no:4所示核苷酸序列或/和seq id no:5所示核苷酸序列。
27.具体的，所述探针dna的数量为3个，所述探针dna具有如seq id no:1所示核酸序列，所述seq id no:1的序列为：5
’‑
cccatataccccggtgcagtttccgtccgtag
‑3’
；所述探针dna具有如seq id no:2所示核酸序列，所述seq id no:2的序列为：5
’‑
ccccacccctcccccaactcctccca
‑3’
；所述探针dna具有如seq id no:3所示核酸序列，所述seq id no:3序列为：5
’‑
acctttaacctaatctcctcccccaactcctccca
‑3’
。
28.具体的，mos2纳米片能有效淬灭银纳米簇探针的荧光。相对于银纳米簇探针，mos2纳米片尺寸很大，因此有足够空间吸附并淬灭银纳米簇探针的荧光，mos2纳米片与银纳米簇探针不存在竞争作用。
29.具体的，所述荧光增强dna的数量为2个，所述荧光增强dna具有如seq id no:4所示核酸序列，所述seq id no:4的序列为：5
’‑
atgatgggtatgggaatacagggtggggtggggtgggg
‑3’
；所述荧光增强dna具有如seq id no:5所示核酸序列，所述seq id no:5的序列为：5
’‑
acctttaacctaatctcctcccgtttt
‑3’
。
30.其中，所述荧光增强dna与所述目的基因的一部分dna形成互补配对；当疾病相关目的基因与含有探针dna的金属簇探针和荧光增强dna混合孵育时，疾病相关目的基因用于将荧光增强dna与探针dna杂交缩小距离，实现金属簇探针的荧光增强。
31.具体的，所述纳米探针使用前，所述二维材料与所述探针dna分离。
32.本技术构建了两种不同的探针dna和两种不同的荧光增强dna(富含胞嘧啶胸腺嘧啶(ct)的dna绿色发光增强序列和富含鸟嘌呤(g)的红色荧光增强序列)，可同时实现两段目的基因的检测，有效减少假阳性。
33.另一实施例中，所述二维材料作为基底合成二维材料
‑
金属纳米粒子复合物用于催化比色检测时，所述金属纳米粒子选自铂纳米粒子、钯纳米粒子、金纳米粒子、银纳米粒子、铜纳米粒子、钯铂纳米粒子、铂金纳米粒子、铂银纳米粒子、铂铜纳米粒子、银铜纳米粒子、金钯铂纳米粒子和金银铂纳米粒子中的一种或多种。
34.本技术第二方面提供了所述纳米探针的制备方法，所述金属簇探针的制备方法包括：将探针dna、可溶性金属盐溶液和还原剂混合反应，制得金属簇探针。所述金属簇探针为荧光探针。
35.具体的，所述可溶性金属盐溶液为可溶性银盐溶液、可溶性金盐溶液、可溶性铂盐溶液、可溶性铜盐溶液、可溶性金盐加银盐混合溶液和可溶性铂盐加银盐混合溶液；所述还原剂为现有常规还原剂。
36.具体的，所述可溶性金属盐溶液为agno3；所述还原剂为nabh4。
37.本技术第三方面提供了所述纳米探针的制备方法，所述二维材料
‑
金属纳米粒子复合物的制备方法包括：
38.将二维材料、可溶性金属盐溶液和还原剂混合反应，制得二维材料
‑
金属纳米粒子复合物。
39.具体的，所述可溶性金属盐溶液的可溶性金属为现有常规显色用金属离子，如pt
4
、pd
4
、au
3
、ag

和cu
2
中的一种或多种，对应的为金属盐h2ptcl6、k2pdcl6、haucl4、agno3和cucl2中的一种或多种；所述还原剂为现有常规的还原剂，如抗坏血酸或/和nabh4。
40.具体的，所述二维材料
‑
金属纳米粒子复合物作为比色探针在h2o2、显色剂和缓冲液组成的体系中进行显色反应；所述显色剂为现有常规显色剂，如3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)；缓冲液为现有常规缓冲剂，如磷酸盐缓冲液(pbs)。
41.本技术第四方面公开了所述纳米探针或所述制备方法制得的纳米探针在制备检测疾病相关的目的基因产品中的应用。
42.本技术第五方面提供了一种检测疾病相关的目的基因的试剂盒，包括：所述纳米探针。
43.使用上述试剂盒时，可将二维材料和探针dna混合形成复合物后，在添加至待测样品中检测目的基因；也可以为先将待测样品与探针dna混合，然后再添加二维材料混合反应；也可先将待测样品、探针dna和荧光增强dna混合，然后再添加二维材料混合反应。
44.所述纳米探针包括mos2纳米片、荧光增强dna和金属簇探针；使用时，在待测样品中先加入金属簇探针和荧光增强dna，若待测样品含有疾病相关目的基因，由于dna杂交动力学的影响，目的基因直接与含有探针dna的金属簇探针和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入mos2纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到mos2纳米片表面，金属簇探针的荧光得以恢复，最后在体系中检测荧光含量。其中，目的基因可有效通过序列互补拉近荧光增强dna和金属簇探针的距离，使金属簇探针的荧光得到进一步显著提高。
45.使用时，在待测样品中先加入金属簇探针和荧光增强dna，若待测样品不含有疾病
相关目的基因，金属簇探针和荧光增强dna未发生杂交，然后加入mos2纳米片后，未杂交的含有探针dna的金属簇探针和荧光增强dna可以通过mos2纳米片和dna分子碱基之间的范德华力吸附在mos2表面，使得金属簇探针的荧光猝灭，无目的基因则无法检测出荧光。同时，荧光增强dna(富含胞嘧啶胸腺嘧啶(ct)的dna绿色发光增强序列和富含鸟嘌呤(g)的红色荧光增强序列)也被吸附到mos2纳米片。
46.本技术第五方面提供了一种检测疾病的目的基因的试剂盒，包括：所述纳米探针、还原剂、金属离子、h2o2、显色剂和缓冲液。
47.具体的，所述可溶性金属盐溶液的可溶性金属离子为现有常规合成具有催化活性的纳米金属粒子的金属离子，如pt
4
、pd
4
、au
3
、ag

和cu
2
中的一种或多种。
48.具体的，还原剂为现有常规的还原剂，如抗坏血酸或/和nabh4；所述显色剂为现有常规显色剂，如3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb)；缓冲液为现有常规缓冲剂，如磷酸盐缓冲液(pbs)。
49.所述纳米探针包括mos2纳米片和探针dna，使用时，在待测样品中加入探针dna，若待测样品含有疾病相关的目的基因，由于dna杂交动力学的影响，目的基因直接与探针dna互补配对；然后再添加mos2纳米片，探针dna不与mos2纳米片结合，离心得到mos2纳米片，然后将其分散在溶液中，得到mos2纳米片水溶液；再将mos2纳米片水溶液、抗坏血酸、h2ptcl6混合反应，得到二维材料
‑
金属纳米粒子复合物(mos2‑
ptnps复合物纳米酶)；将mos2‑
ptnps复合物纳米酶、h2o2、tmb在缓冲液中孵育，最后通过比色法进行检测。mos2‑
ptnps复合物起到过氧化物酶催化活性作用，催化tmb氧化显色，从无色转变成蓝色。
50.使用时，在待测样品中加入探针dna，若待测样品不含有疾病相关的目的基因；然后再添加mos2纳米片，探针dna会吸附在mos2纳米片表面形成探针dna
‑
mos2纳米片复合物，离心得到探针dna
‑
mos2纳米片复合物，然后将其分散在溶液中，得到探针dna
‑
mos2纳米片水溶液；再将探针dna
‑
mos2纳米片水溶液、抗坏血酸、h2ptcl6混合反应，由于合成金属纳米粒子的位点被dna占据，使得mos2上无法生长铂纳米颗粒(ptnps)，得到探针dna
‑
mos2纳米片；将探针dna
‑
mos2纳米片、h2o2、tmb在缓冲液中孵育，最后通过比色法进行检测。探针dna
‑
mos2纳米片不具有过氧化物酶催化活性，无法催化tmb氧化显色，溶液颜色不发生变化。
51.具体的，本技术的试剂盒是在mos2上生长ptnps，以调节mos2‑
ptnps的过氧化物酶活性。通过在mos2表面上原位合成ptnps，mos2可用作制备二维材料
‑
金属纳米粒子复合物(mos2‑
ptnps复合物纳米酶)的基底，从而显著提高复合物纳米酶的酶活性。探针dna由于与mos2纳米片之间存在强相互作用，可有效吸附到mos2表面，从而有效地阻止ptnps在mos2表面的生长，从而使复合物纳米酶催化活性大大降低。在目的基因存在的情况下，目的基因和探针dna会形成双链dna，形成双链结构会阻碍探针dna在mos2纳米片上的吸附，从而恢复ptnps的生长，形成mos2‑
ptnps复合物纳米酶，酶活性得到显著的提高。因此，利用目的基因调节复合物纳米酶催化活性的特性可有效实现目的基因的可视化比色检测。
52.另一实施例中，所述疾病相关目的基因为引起疾病的细菌或病毒的序列，所述检测疾病的目的基因为hbv dna，或其他病毒dna，如covid
‑
19。
53.可见，本技术提供的一种纳米探针及其制备方法和应用，可简单通过荧光或比色检测目的基因；可实现目的基因的荧光或比色可视化检测，可直接通过肉眼观察实现目的基因的检测。本技术的纳米探针具备较好的准确性和稳定性，可以实现人血清样本中目标
基因的检测。综上所述，本技术的纳米探针具有疾病相关目的基因检测的潜力，尤其适用于医疗和仪器支持受限的发展中国家及流行性疾病高发的地区，本技术的纳米探针结构简单，使用操作快速，无需昂贵设备，避免复杂实验技术。
附图说明
54.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单介绍。
55.图1为本技术实施例提供的荧光和比色可视化的纳米探针检测目的基因的流程；a和b为使用mos2‑
agncs纳米复合物检测hbv dna的示意图；c和d为通过hbv dna调控mos2‑
ptnps纳米复合物的过氧化物酶活性比色检测hbv dna的示意图。其中，probe dna为探针dna，enhancer dna为荧光增强dna，target dna为疾病相关的目的基因，no target为不存在疾病相关的目的基因；
56.图2为本技术实施例提供的dna
‑
agncs a与mos2纳米片相互作用的表征；a为dna
‑
agncs a的tem图像，比例尺，20nm；b为mos2纳米片的tem图像，比例尺，100nm；c为mos2纳米片和dna
‑
agncs
‑
mos2混合物的归一化吸收光谱；d为dna
‑
agncs
‑
mos2混合物的tem图像，比例尺，10nm；
57.图3为本技术实施例提供的不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光检测结果；
58.图4为本技术实施例提供的dna
‑
agncs和荧光增强dna检测不同浓度的hbv dna目的基因的荧光检测结果；
59.图5为本技术实施例提供的采用不同纳米探针检测不同目的基因的相对荧光强度试验结果；f
m
/f
h
，其中f
h
是存在目的基因时的荧光强度，而f
m
是存在单碱基错配(sm)，三碱基错配(tm)和完全错配(cm)dna链时的荧光强度；
60.图6为本技术实施例提供的纳米探针检测不同数量的hbv dna目的基因的荧光光谱；
61.图7为本技术实施例提供含有hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的表征及其催化活性；
62.图8为本技术实施例提供含有hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的吸收光谱和选择性结果。
具体实施方式
63.本技术提供了一种荧光和比色可视化的纳米探针及其制备方法和应用，用于解决现有技术检测疾病过程中存在的步骤繁琐、成本高昂、费时费力的技术缺陷。
64.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
65.其中，以下实施例所用原料均为市售或自制。
66.以下实施例中：
67.探针dna p1为seq id no:1；
68.其序列为：5
’‑
cccatataccccggtgcagtttccgtccgtag
‑3’
。
69.探针dna p2为seq id no:2；
70.其序列为：5
’‑
ccccacccctcccccaactcctccca
‑3’
。
71.比色检测dna探针p3为seq id no:3；
72.其序列为：5
’‑
acctttaacctaatctcctcccccaactcctccca
‑3’
。
73.荧光增强dna e1为seq id no:4；
74.其序列为：
[0075]5’‑
atgatgggtatgggaatacagggtggggtggggtgggg
‑3’
。
[0076]
荧光增强dna e2为seq id no:5；
[0077]
其序列为：5
’‑
acctttaacctaatctcctcccgtttt
‑3’
。
[0078]
hbv dna目的基因t1为seq id no:6；
[0079]
其序列为：
[0080]5’‑
ctacggacggaaactgcacctgtattcccatacccatcat
‑3’
。
[0081]
hbv dna目的基因t2为seq id no:7；
[0082]
其序列为：5
’‑
tgggaggagttgggggaggagattaggttaaaggt
‑3’
。
[0083]
hbv dna单碱基错配目的基因(sm1)为seq id no:8；
[0084]
其序列为：
[0085]5’‑
ctacggacggaaactgcaactgtattcccatacccatcat
‑3’
[0086]
hbv dna三碱基错配目的基因(tm1)为seq id no:9；
[0087]
其序列为：
[0088]5’‑
ctatggacggaaactgcaactgtattcccatacccataat
‑3’
[0089]
hbv dna完全错配目的基因(cm1)为seq id no:10；
[0090]
其序列为：
[0091]5’‑
ccttaagtaactactgtagaggtctacggattatgcgatc
‑3’
[0092]
hbv dna单碱基错配目的基因(sm2)为seq id no:11；
[0093]
其序列为：5
’‑
tgggaggagttggcggaggagattaggttaaaggt
‑3’
[0094]
hbv dna三碱基错配目的基因(tm2)为seq id no:12；
[0095]
其序列为：5
’‑
tgagaggagttggcggaggagattaggttaacggt
‑3’
[0096]
hbv dna完全错配目的基因(cm2)为seq id no:13；
[0097]
其序列为：5
’‑
ccttaagtaactactgtagaggtctacggattatg
‑3’
[0098]
以下实施例所用的mos2纳米片购买自南京先丰纳米材料科技有限公司(xf135)，测定mos2纳米片的tem图像，如图2b所示，图2b为本技术提供的mos2纳米片的tem图。
[0099]
以下实施例所用二硫化钨纳米片、二维共价有机框架纳米片、石墨烯纳米片、氮化硼纳米片、黑磷纳米片、氧化锌纳米片、mxene纳米片购买自南京先丰纳米材料科技有限公司。
[0100]
以下实施例的hbv dna目的基因t1、hbv dna目的基因t2、hbv dna单碱基错配目的基因(sm1)、hbv dna三碱基错配目的基因(tm1)、hbv dna三碱基错配目的基因(cm1)、hbv dna单碱基错配目的基因(sm2)、hbv dna三碱基错配目的基因(tm2)和hbv dna三碱基错配
目的基因(cm2)均分别添加在稀释的人标准血清样品(10％)后使用，以模拟实际样品。
[0101]
实施例1
[0102]
本技术实施例提供了两种银纳米簇探针(dna
‑
agncs a和dna
‑
agncs b)，具体制备方法包括：
[0103]
将探针dna p1(1μm)、agno3(6μm)和nabh4(6μm)在缓冲溶液中(10mm磷酸盐缓冲液，ph 7.0)混合，剧烈涡旋振荡2分钟，然后于室温条件下避光孵育5小时，制得dna
‑
agncs a，然后保存在4℃冰箱中备用；其中，探针dna p1与ag

的摩尔比为1:6，ag

与nabh4的摩尔比为1:1。
[0104]
将1μm的探针dna p2、8μm的agno3、4μm的nabh4和椰油酸钠缓冲液(5mm，ph 6.95)混合，剧烈振摇2分钟，然后在室温条件下用400psi的氧气处理2小时，制得dna
‑
agncs b，然后保存在4℃冰箱中备用。
[0105]
测定本技术实施例提供的dna
‑
agncs a的tem图像，如图2a所示，图2a为本技术实施例制得的dna
‑
agncs a的tem图像。
[0106]
将上述dna
‑
agncs a与mos2纳米片混合，得到dna
‑
agncs
‑
mos2混合物，测定该dna
‑
agncs
‑
mos2混合物和mos2纳米片的吸收光谱，以及测定dna
‑
agncs
‑
mos2混合物的tem图像，如图2c和图2d所示，图2c为本技术提供的mos2纳米片和dna
‑
agncs
‑
mos2混合物的吸收光谱，图2d为本技术提供的dna
‑
agncs
‑
mos2混合物的tem图像。
[0107]
实施例2
[0108]
本技术实施例提供了金纳米簇探针(dna
‑
auncs)，其制备方法如下：
[0109]
将探针dna p1(1μm)、haucl4(6μm)和抗坏血酸(aa，6μm)在缓冲溶液中(10mm磷酸盐缓冲液，ph 7.0)混合，剧烈涡旋振荡2分钟，然后于室温条件下避光孵育5小时，制得dna
‑
auncs，然后保存在4℃冰箱中备用；其中，探针dna p1与aucl4‑
的摩尔比为1:6，aucl4‑
与aa的摩尔比为1:1。
[0110]
本技术对得到的dna
‑
auncs进行透射电子显微镜测试，测试结果表明：本技术实施例2得到的dna
‑
auncs粒径为1～4纳米。
[0111]
实施例3
[0112]
本技术实施例提供了铂纳米簇探针(dna
‑
ptncs)，其制备方法如下：
[0113]
将探针dna p1(1μm)、h2ptcl6(6μm)和抗坏血酸(aa，6μm)在缓冲溶液中(10mm磷酸盐缓冲液，ph 7.0)混合，剧烈涡旋振荡2分钟，然后于室温条件下避光孵育5小时，制得dna
‑
ptncs，然后保存在4℃冰箱中备用；其中，探针dna p1与ptcl
62
‑
的摩尔比为1:6，ptcl
62
‑
与aa的摩尔比为1:1。
[0114]
本技术对得到的dna
‑
ptncs进行透射电子显微镜测试，测试结果表明：本技术实施例3得到的dna
‑
ptncs粒径为1～3.5纳米。
[0115]
实施例4
[0116]
本技术实施例提供了铜纳米簇探针(dna
‑
cuncs)，其制备方法如下：
[0117]
将探针dna p1(1μm)、cucl2(6μm)和抗坏血酸(aa，6μm)在缓冲溶液中(10mm磷酸盐缓冲液，ph 7.0)混合，剧烈涡旋振荡2分钟，然后于室温条件下避光孵育5小时，制得dna
‑
cuncs，然后保存在4℃冰箱中备用；其中，探针dnap1与cu
2
的摩尔比为1:6，cu
2
与aa的摩尔比为1:1。
mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图3b的曲线3所示。
[0135]
图3为本技术实施例提供的不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光检测试验，从图3a和图3b的曲线3可知，hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入mos2纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到mos2纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。从图3a和图3b的曲线1和2可知，体系中不含有mos2纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因与发生杂交，然后加入mos2纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过mos2纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在mos2表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0136]
实施例8
[0137]
本技术实施例提供了hbv dna目的基因的荧光检测试验，具体步骤包括：不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验：
[0138]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0139]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dna e1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml二硫化钨纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0140]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a(200nm)和荧光增强dna e1混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml二硫化钨纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0141]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入二硫化钨纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到二硫化钨纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有二硫化钨纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入二硫化钨纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过二硫化钨纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在二硫化钨表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0142]
实施例9
[0143]
本技术实施例提供了不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验，具体步骤包括：：
[0144]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dnae2(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0145]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncsb和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml二维共价有机框架纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0146]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b(200nm)和荧光增强dna e2混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml二维共价有机框架纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光
光谱。其中，二维共价有机框架纳米片为[zn4o(bdc)3](dmf)8(c6h5cl)(mof
‑
5，h2bdc＝1,4
‑
苯二甲酸，dmf＝n,n
‑
二甲基甲酰胺)。
[0147]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入二维共价有机框架纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到二维共价有机框架纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有二维共价有机框架纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入二维共价有机框架纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过二维共价有机框架纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在二维共价有机框架纳米片表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0148]
实施例10
[0149]
本技术实施例提供了不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验，具体步骤包括：
[0150]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0151]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml石墨烯纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0152]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a(200nm)和荧光增强dna e1混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml石墨烯纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0153]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入石墨烯纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到石墨烯纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有石墨烯纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入石墨烯纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过石墨烯纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在石墨烯表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0154]
实施例11
[0155]
本技术实施例提供了不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验，具体步骤包括：
[0156]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dna e2(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0157]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml六角形氮化硼纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0158]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b(200nm)和荧光增强dna e2混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml六角形氮化硼纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光
谱。
[0159]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入六角形氮化硼纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到六角形氮化硼纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有六角形氮化硼纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入六角形氮化硼纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过六角形氮化硼纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在六角形氮化硼表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0160]
实施例12
[0161]
本技术实施例提供了不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验，具体步骤包括：
[0162]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dna e1(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0163]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dna e1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml黑磷纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0164]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a(200nm)和荧光增强dna e1混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml黑磷纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0165]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入黑磷纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到黑磷纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有黑磷纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入黑磷纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过黑磷纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在黑磷表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0166]
实施例13
[0167]
本技术实施例提供了不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验，具体步骤包括：
[0168]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dnae2(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0169]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dnae2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml二维氧化锌纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0170]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b(200nm)和荧光增强dna e2混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml二维氧化锌纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0171]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入二维氧化锌纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到二
维氧化锌纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有二维氧化锌纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入二维氧化锌纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过二维氧化锌纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在二维氧化锌表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0172]
实施例14
[0173]
本技术实施例提供了不同组分的纳米探针检测hbv dna目的基因的荧光试验，具体步骤包括：
[0174]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合孵育10分钟，得到混合物。使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0175]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与50μg/ml二维mxene纳米片混合，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。其中，二维mxene纳米片为碳化钛(ti3c2tx)。
[0176]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a(200nm)和荧光增强dna e1混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mxene纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。
[0177]
hbv dna目的基因直接与dna
‑
agncs和荧光增强dna混合后会先形成互补的t字型双链结构；然后加入mxene纳米片后，杂交形成的互补的t字型双链结构不会吸附到mxene纳米片表面，dna
‑
agncs的荧光得以恢复，可在体系中检测到荧光。当体系中不含有mxene纳米片或hbv dna目的基因，dna
‑
agncs和荧光增强dna未与hbv dna目的基因发生杂交，然后加入mxene纳米片后，未杂交的单链的dna
‑
agncs和荧光增强dna可以通过mxene纳米片和dna中碱基之间的范德华力吸附在mxene表面，使得dna
‑
agncs的荧光猝灭，无法在体系中检测到荧光。
[0178]
实施例15
[0179]
dna
‑
agncs和荧光增强dna检测不同浓度的hbv dna目的基因的荧光试验：
[0180]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与0～200nm浓度的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图4a和图4b所示。
[0181]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dnae2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与0～200nm浓度的hbv dna目的基因t2杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图4c和图4d所示。
[0182]
图4为本技术实施例提供的dna
‑
agncs和荧光增强dna检测不同浓度的hbv dna目的基因的荧光检测试验。图4a为在mos2纳米片和荧光增强dna e1存在下添加不同浓度的hbv dna目的基因t1时dna
‑
agncs的荧光发射光谱。图4b为以不同浓度的hbv dna目的基因t1绘制的dna
‑
agncs a的荧光强度图。图4b插图为荧光强度与hbv dna目的基因t1的浓度(0～200nm)之间的线性关系。图4c为在mos2纳米片和荧光增强dna e2存在下，添加不同浓度的hbv dna目的基因t2时，dna
‑
agncs b的荧光发射光谱。图4d为以不同浓度的hbv dna目的
基因t2浓度绘制的dna
‑
agncs b的荧光强度图。图4d插图为荧光强度与hbv dna目的基因t2浓度(0～200nm)之间的线性关系。误差棒是从三个平行实验中获得的。
[0183]
纳米探针对不同序列的hbv dna目的基因的选择性试验：
[0184]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5a的hbv组数据所示。
[0185]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dna e1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与sm1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5a的sm组数据所示。
[0186]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dna e1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与tm1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5a的tm组数据所示。
[0187]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs a和荧光增强dnae1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与cm1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5a的cm组数据所示。
[0188]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5b的hbv组数据所示。
[0189]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dnae2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与sm2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5b的sm组数据所示。
[0190]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dnae2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与tm2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5b的tm组数据所示。
[0191]
将摩尔比为1:1的实施例1的dna
‑
agncs b和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与cm2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育10分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图5b的cm组数据所示。
[0192]
图5为本技术采用不同纳米探针检测不同目的基因的相对荧光强度试验，图5中f
m
/f
h
，其中f
h
是存在目的基因时的荧光强度，而f
m
是存在单碱基错配(sm)，三碱基错配(tm)和完全错配(cm)dna链时的荧光强度。图5可知，本技术实施例提供的纳米探针对hbv dna目的基因t1和hbv dna目的基因t2具有高度选择性。
[0193]
纳米探针检测不同数量的hbv dna目的基因的荧光试验：
[0194]
将摩尔比为1:1:1:1的dna
‑
agncs a、dna
‑
agncs b、荧光增强dna e1和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育30分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图6a所示。
[0195]
将摩尔比为1:1:1:1的dna
‑
agncs a、dna
‑
agncs b、荧光增强dna e1和荧光增强dna e1(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t1(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育30分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图6b所示。
[0196]
将摩尔比为1:1:1:1的dna
‑
agncs a、dna
‑
agncs b、荧光增强dna e1和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物与hbv dna目的基因t2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育30分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图6c所示。
[0197]
将摩尔比为1:1:1:1的dna
‑
agncs a、dna
‑
agncs b、荧光增强dna e1和荧光增强dna e2(200nm)混合，得到混合物。之后，将该混合物、hbv dna目的基因t1(200nm)与hbv dna目的基因t2(200nm)杂交30分钟，并向其中添加50μg/ml mos2纳米片，在孵育30分钟后，使用rf
‑
6000荧光分光光度计扫描溶液的荧光光谱。结果如图6d所示。
[0198]
图6为本技术实施例提供的纳米探针检测不同数量的hbv dna目的基因的荧光光谱。图6d可知，在存在mos2纳米片、荧光增强dna e1和荧光增强dna e2情况下，dna
‑
agncs a、dna
‑
agncs b、hbv dna目的基因t1和hbv dna目的基因t2共同孵育，分别在490nm和593nm的激发下监测绿色和红色荧光发射。可见，可采用dna
‑
agncs同时检测多重目的基因。
[0199]
实施例16
[0200]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0201]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸和h2ptcl6水溶液混合。然后在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有不同浓度hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps。
[0202]
检测含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的tem图像、afm图像和xps光谱，结果如图7a、图7b和图7c所示。图7a为含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的tem图像；图7b为含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的afm图像；图7b插图为mos2‑
ptnps的高度轮廓图；图7c为含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps和mos2纳米片的xps光谱。
[0203]
实施例17
[0204]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0205]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)和k2pdcl6(100μm)
水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌2小时，得到含有不同浓度hbv dna目的基因t1的mos2‑
pdnps。
[0206]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
pdnps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例17得到的mos2‑
pdnps粒径约为216nm，电位约为
‑
19.5mv。
[0207]
而后，依次将50μlmos2‑
pdnps、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0208]
实施例18
[0209]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0210]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)和haucl4(100μm)水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌2小时，得到含有不同浓度hbv dna目的基因t1的mos2‑
aunps。
[0211]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
aunps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例18得到的mos2‑
aunps粒径约为208nm，电位为
‑
18.6mv。
[0212]
而后，依次将上述合成的mos2‑
aunps、h2o2(50mm)和tmb(800μm)混合到pbs缓冲液(ph4.0，25mm)，孵育10分钟后，观察颜色变化。实验证实随着hbv dna目的基因浓度升高，tmb颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0213]
实施例19
[0214]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0215]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与nabh4(300μm)和agno3(100μm)水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌1小时，得到含有不同浓度hbv dna目的基因t1的mos2‑
agnps。
[0216]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
agnps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例19得到的mos2‑
agnps粒径约为212nm，电位为
‑
21.3mv。
[0217]
而后，将上述合成的mos2‑
agnps、h2o2(终浓度为50mm)和tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，10分钟后观察颜色变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0218]
实施例20
[0219]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具
体方法包括：
[0220]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(400μm)和cucl2(100μm)水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌2小时，得到含有不同浓度hbv dna目的基因t1的mos2‑
cunps。
[0221]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
cunps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例20得到的mos2‑
cunps粒径约为205nm，电位为
‑
22.5mv。
[0222]
而后，依次将含有不同浓度目的基因的mos2‑
cunps、h2o2(终浓度为50mm)和tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0223]
实施例21
[0224]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0225]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)、h2ptcl6(50μm)和k2pdcl6(50μm)水溶液混合。然后将反应混合物在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/pdnps。
[0226]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
pt/pdnps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例21得到的mos2‑
pt/pdnps粒径约为230nm，电位为
‑
12.3mv。
[0227]
而后，依次将上述含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/pdnps、h2o2(终浓度为50mm)和tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0228]
实施例22
[0229]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0230]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)、h2ptcl6(50μm)和haucl4(50μm)水溶液混合。然后将反应混合物在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/aunps。
[0231]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
pt/
aunps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例22得到的mos2‑
pt/aunps粒径约为206nm，电位为
‑
11.6mv。
[0232]
而后，依次将上述含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/aunps、h2o2(50mm)和tmb(800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0233]
实施例23
[0234]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0235]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)、h2ptcl6(80μm)和agno3(20μm)水溶液混合。然后将反应混合物在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/agnps。
[0236]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
pt/agnps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例23得到的mos2‑
pt/agnps粒径约为212nm，电位为
‑
13.6mv。
[0237]
而后，依次将上述含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/agnps、25μl h2o2(终浓度为50mm)和8μltmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0238]
实施例24
[0239]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0240]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)、h2ptcl6(80μm)和cucl2(20μm)水溶液混合。然后将反应混合物在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
pt/cunps。
[0241]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
pt/cunps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例24得到的mos2‑
pt/cunps粒径约为225nm，电位为
‑
9.8mv。
[0242]
而后，依次将上述mos2‑
pt/cunps、h2o2(50mm)和tmb(终800μm)混合到pbs缓冲液(ph4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0243]
实施例25
[0244]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0245]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与nabh4(500μm)、agno3(50μm)和cucl2(50μm)水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌2小时，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
ag/cunps。
[0246]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
ag/cunps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例25得到的mos2‑
ag/cunps粒径约为225nm，电位为
‑
9.8mv。
[0247]
而后，依次将上述含有不同浓度目的基因的mos2‑
ag/cunps、h2o2(50mm)和tmb(800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0248]
实施例26
[0249]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0250]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)、haucl4(30μm)、k2pdcl6(20μm)和h2ptcl6(50μm)水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌2小时，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
au/pd/ptnps。
[0251]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
au/pd/ptnps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例26得到的mos2‑
au/pd/ptnps粒径约为210nm，电位为
‑
15.6mv。
[0252]
而后，依次将上述含有不同浓度目的基因的mos2‑
au/pd/ptnps、h2o2(终浓度为50mm)和tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，共同孵育10分钟后观察其变化。发现随着hbv dna目的基因浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0253]
实施例27
[0254]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0255]
将探针dna p1(50nm)和0pm～50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸(500μm)、haucl4(30μm)、agno3(20μm)和h2ptcl6(50μm)水溶液混合。然后将反应混合物在室温搅拌2小时，得到含有不同浓度目的基因的mos2‑
au/ag/ptnps。
[0256]
本技术对存在探针dna p1(50nm)和hbv dna目的基因t1(50nm)时得到的mos2‑
au/ag/ptnps进行动态光散射和zeta电位分析，测试结果表明：本技术实施例27得到的mos2‑
ag/au/ag/ptnps粒径约为216nm，电位为
‑
16.9mv。
[0257]
而后，依次将上述mos2‑
au/ag/ptnps、h2o2(终浓度为50mm)和tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，观察其变化。发现随着hbv dna目的基因
浓度升高，溶液颜色逐渐加深，证实可有效实现疾病相关的目的基因的可视化比色检测。
[0258]
实施例28
[0259]
本技术实施例提供了采用比色法通过纳米探针检测hbv dna目的基因的试验，具体方法包括：
[0260]
1、依次将50μl的上述实施例16的mos2‑
ptnps、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，通过uv
‑
vis吸光度检测催化活性，检测在652nm处随时间变化的吸光度变化。
[0261]
测定mos2纳米片、不含有hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps和含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps在652nm处随时间变化的吸光度变化以及外观颜色，图7d的顶部溶液从左往右分别为mos2纳米片在652nm处的外观颜色、不含有hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps在652nm处的外观颜色、含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps在652nm处的外观颜色。结果如图7d所示，图7d的曲线1为mos2纳米片在652nm处随时间变化的吸光度变化，图7d的曲线2为存在探针dna p1，不存在hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps在652nm处随时间变化的吸光度变化，图7d的曲线3为含有50nm hbv探针dna p1和目的基因t1的mos2‑
ptnps在652nm处随时间变化的吸光度变化。
[0262]
图7d可知，本技术实施例成功制得含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps，且含有50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps、tmb和h2o2在652nm处随时间增加吸光度增大，tmb肉眼可见显色。
[0263]
2、依次将50μl的上述含有0pm～50nm的hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，通过uv
‑
vis吸光度检测催化活性，检测含有0pm～50nm的hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的tmb在300～900nm处典型吸收光谱以及外观颜色，结果如图8a所示，a为含有不同浓度hbv dna目的基因t1,以mos2‑
ptnps为纳米酶，在h2o2和tmb存在下，溶液在300～900nm处的典型吸收光谱和外观颜色，图8a顶部溶液从左往右分别为含有0pm、50pm、100pm、500pm、1nm、5nm、10nm、20nm、50nm hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的颜色结果。检测含有0pm～50nm的hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的tmb在652nm处的吸光度与不同浓度的hbv dna目的基因t1的关系图。误差线代表三个测量值的标准偏差，结果如图8b所示。检测含有0pm～50nm的hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps的tmb在652nm处的吸光度与不同浓度的hbv dna目的基因t1的线性校准图，结果如图8c所示。
[0264]
将50nm探针dna p1和50nm的hbv dna目的基因t1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸和h2ptcl6水溶液混合。然后在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有hbv dna目的基因t1的mos2‑
ptnps(即是二维材料
‑
金属纳米粒子复合物，mos2‑
ptnps复合物纳米酶)。依次将50μl的上述mos2‑
ptnps复合物纳米酶、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，通过uv
‑
vis吸光度检测催化活性，检测在652nm处的吸光度和外观颜色，结果如图8d的hbv组数据所示。
[0265]
将50nm探针dna p1和50nm的sm1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通
过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸和h2ptcl6水溶液混合。然后在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有sm1的mos2‑
ptnps(即是二维材料
‑
金属纳米粒子复合物，mos2‑
ptnps复合物纳米酶)。依次将50μl的上述mos2‑
ptnps复合物纳米酶、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，通过uv
‑
vis吸光度检测催化活性，检测在652nm处的吸光度和外观颜色，结果如图8d的sm组数据所示。
[0266]
将50nm探针dnap1和50nm的tm1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸和h2ptcl6水溶液混合。然后在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有tm1的mos2‑
ptnps(即是二维材料
‑
金属纳米粒子复合物，mos2‑
ptnps复合物纳米酶)。依次将50μl的上述mos2‑
ptnps复合物纳米酶、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，通过uv
‑
vis吸光度检测催化活性，检测在652nm处的吸光度和外观颜色，结果如图8d的tm组数据所示。
[0267]
将50nm探针dna p1和50nm的cm1杂交30分钟，随后，添加50μg/ml mos2纳米片。通过离心收集dna
‑
mos2复合物，然后分别将其重新分散在溶液中，得到dna
‑
mos2水分散液。分别将上述dna
‑
mos2水分散液与抗坏血酸和h2ptcl6水溶液混合。然后在微波反应器(wx
‑
6000，preekem corporation，中国)的微波辐射下，将反应混合物在60℃加热5分钟，得到含有cm1的mos2‑
ptnps(即是二维材料
‑
金属纳米粒子复合物，mos2‑
ptnps复合物纳米酶)。依次将50μl的上述mos2‑
ptnps复合物纳米酶、25μl的h2o2(终浓度为50mm)和8μl的tmb(终浓度为800μm)混合到pbs缓冲液(400μl，ph 4.0，25mm)，温育10分钟后，通过uv
‑
vis吸光度检测催化活性，检测在652nm处的吸光度和外观颜色，结果如图8d的cm组数据所示。
[0268]
图8为在hbv dna目的基因t1，hbv dna单碱基错配目的基因(sm1)，hbv dna三碱基错配目的基因(tm1)和hbv dna三碱基错配目的基因(cm1)存在下的吸光度，图8可知，本技术实施例提供的纳米探针对不同的hbv dna目的基因具有高度选择性。
[0269]
可见，本技术实施例公开的纳米探针可实现应用疾病相关的目的基因调控二维mos2纳米材料表面金属纳米粒子的生长；应用金属
‑
二维mos2纳米材料的纳米复合体系实现疾病相关的目的基因的荧光和比色双通道检测。
[0270]
以上所述仅是本技术的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本技术的保护范围。