玉米细胞质雄性不育(CMS)S型恢复者RF3基因、分子标志物及其用途的制作方法

玉米细胞质雄性不育(cms)s型恢复者rf3基因、分子标志物及其用途
1.本技术是2014年12月30日提交的申请号为201480076203.7、发明名称为“玉米细胞质雄性不育(cms)s型恢复者rf3基因、分子标志物及其用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本公开内容涉及植物能育性基因。在一些实施方案中，公开内容涉及rf3，一种玉米育性基因的恢复者。在具体的实施方案中，公开内容涉及用于对s型细胞质雄性不育(cms)恢复育性的组合物和方法，例如通过使用与rf3基因连锁或驻留于rf3基因内的分子标志物。具体的实施方案涉及使用特定的核酸序列鉴定含有cms
‑
s育性恢复者的植物的方法，以及用于杂种种子生产的方法。
3.发明背景
4.杂种植物育种的开发已经为显著提高生产作物的质量和数量创造了可能。将产率的增加与期望特征，如对疾病和昆虫的抗性、热和干旱耐受性、和植物组成的变化等结合起来已经完全成为可能，这部分地是杂交程序的结果。杂交程序依赖于将来自雄性亲本植物的花粉提供给雌性亲本植物以产生由此得到的杂种。
5.若来自一朵花的花粉被转移到同一植物的相同或不同花，则植物可以自花传粉。或者，若花粉来源于不同植物的花，则植物可以异花传粉。可以使用自花传粉和异花传粉技术两者选育玉米植物(玉蜀黍(zea mays))。玉米植物具有位于雄花穗(tassel)上的雄花和位于同一植物的雌花穗(ear)上的雌花。玉米中的天然传粉在当来自雄花穗的花粉到达初始穗顶部的穗丝时发生。重要的是，玉米杂种的开发依赖于雄性不育性系统。
6.玉米杂种的开发需要开发纯合近交系、杂交这些系、并评估所得的杂种。谱系育种和轮回选择是两种可用于从玉米群体开发近交系的育种方法。育种程序将来自两种或更多种近交系，或者来自多种多样的来源的期望性状组合成育种池，通过自交和选择期望表型来从所述育种池中开发新的近交系。杂种玉米品种是两个这样的近交系的杂交体，其中每个近交系可以具有一个近交系中缺乏、或与另一个近交系互补的一种或多种期望的特征。将新的近交植物与其它近交系杂交，并且评估这些杂交所得的杂种以确定哪些是更理想的。来自第一代的杂种后代称作f1。在杂种的开发中，仅寻求f1杂种。f1杂种通常比它的近交亲本的活力更高。这种杂合优势称作“杂种优势”，通常导致更理想的性状，例如增加的营养生长和增加的产率。
7.杂种玉米种子可以通过包括手动去雄的雄性不育性系统生成。为了生成杂种种子，去除生长中的近交母本的雄花穗，所述近交母本可以与近交父本以多个交替行模式紧邻种植。因此，只要与外来玉米花粉足够隔离，仅有近交父本的花粉会让近交母本的穗受粉。所得的种子称作杂种f1种子。
8.然而，手动去雄需要密集的劳动，成本高昂。同时手动去雄往往无效，因为在一些情况下，植物形成中的环境变化可以导致母本植物去雄后抽出雄花穗，或者因为去雄者可
能没有完全除去雌性近交植物的雄花穗。若去雄无效，则雌性植物会成功散落花粉，并且一些雌性植物会自花授粉。这会导致雌性近交物的种子与正常生成的杂种种子一起被收获，这是不期望的。雌性近交种子不如与f1种子那样多产。另外，雌性近交种子的存在对杂种种子生产者而言会构成种质安全性的风险。
9.也可以通过机器对雌性近交植物机械去雄。机械去雄与手动去雄大致一样可靠，但是更快且不太昂贵。然而，大多数去雄机器比手动去雄对植物产生的损害更多。因此，手动或机械去雄目前都不完全令人满意。
10.遗传雄性不育性是一种备选方法，可以有利地在杂种种子生产中使用。在一些基因型中，可以有利地借助使用细胞质雄性不育近交植物避免繁冗的去雄过程。在缺乏育性恢复基因的情况下，细胞质雄性不育近交系的植物是雄性不育的，其原因是源自细胞质基因组，而非细胞核基因组，的因素。因此，由于仅雌性对受精种子提供细胞质，雄性不育性的特征在玉米植物中仅经由母本遗传。用来自非雄性不育的另一近交植物的花粉使细胞质雄性不育植物受精。来自第二近交植物的花粉可以贡献，也可以不贡献使杂种植物变为雄性能育的基因。通常，来自去雄正常玉米的种子必须与相同杂种的细胞质雄性不育产生的种子混合，以确保种植杂种植物时有足够的花粉载量可用于受精，并且以确保细胞质多样性。
11.使用细胞质雄性不育(cms)作为生产杂种种子的系统的缺点包括cms的特定变体与对某些作物疾病的易感性有关联。参见，例如beckett(1971)crop science 11:724
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6。此问题尤其阻碍了杂种玉米种子生产中的cms
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t变体的应用，并且已经对cms在玉米中的一般应用具有负面影响。
12.细胞质雄性不育是母系遗传的功能性花粉产生无能。已经找到超过40种cms来源，并且基于不同的育性恢复反应而被分类为三个主要的类群。这些类群称为cms
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t(texas)、cms
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s(usda)、和cms
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s(charrua)(beckett,1971)。在cms
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t组中，两种显性基因rf1和rf2(它们分别位于染色体3和9上)是花粉育性的恢复所需要的(duvick,1965)。s
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细胞质由单一基因rf3恢复，所述rf3已经被定位到染色体2上(laughnan and gabay,1978)。
13.在玉米中，cms的s型的恢复者表现为一种配子体性状。具有s细胞质的玉米植物由单一显性基因rf3恢复，所述rf3定位到染色体2的长臂并且位于whp1和bnl17.14基因座之间(kamps and chase,1997)。tie(2006)报告了rf3分别以2.3和8.9cm的距离与ssr标志物umc1525和bnlg1520关联。zhang等(2006)鉴定了与rf3基因紧密连锁的三个扩增片段长度多态性标志物。
14.杂合(rf3/rf3)的cms
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s植物是半能育的，其可散发大约50％的含有rf3等位基因的败育空瘪花粉和50％的含有rf3等位基因的充满淀粉的能育花粉。rf3/rf3植物中的rf3等位基因无法经由不育花粉转移到后代，因此在f2代中产生不育植物(tie等,2006)。这种继承方式使得从f2定位群体收集准确的表型数据非常困难。用于鉴定突变的传统方法是劳动力和时间密集的，全基因组测序被认为是一种测定cms
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s与恢复系之间的差异的途径。同时，设计回交1(bc1)定位群体以评估鉴定的突变。bc1定位群体对于评估表型更有用。来自回交群体的个体要么具有rf3/rf3基因型，要么具有rf3/rf3基因型，因此在表型确定过程过程中无需区分完全能育表型与部分能育表型。
15.分子标志物对加速通过回交将基因或数量性状基因座(qtl)引入良种栽培种或育种系中的过程特别有用。与基因连锁的标志物可以用来选择拥有期望的性状的植物，并且
可以利用整个基因组范围内的标志物来选择与轮回亲本在遗传上相似的植物(young and tanksley(1989)theor.appl.genet.77:95
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101；hospital等(1992)genetics 132:1199
‑
210)。
16.大多数植物育性恢复基因已经通过基于图谱的克隆策略得以克隆。迄今为止，已经从几种植物物种分离了5种恢复者基因，这些植物物种包括玉米(玉蜀黍)(cui等(1996)science 272:1334
‑
6；liu等(2001)plant cell 13:1063
‑
78)、矮牵牛(petunia,petunia hybrida)(bentolila等(2002)proc.natl.acad.sci.usa 99:10887
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92)、萝卜(radish,raphanus sativus l.)(brown等(2003)plant j.35:262
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72；desloire等(2003)embo rep.4:1
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7；koizuka等(2003)plant j.34:407
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15)、高粱(sorghum,sorghum bicolor l.)(klein等(2005)theor.appl.genet.111:994
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1012)和稻(rice,oryza sativa l.)(kazama and toriyama(2003)febs lett.544:99
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102；akagi等(2004)theor.appl.genet.108:1449
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57；komori等(2004)plant j.37:315
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25；wang等(2006)plant cell 18:676
‑
87)。除了玉米中的rf2外，所有鉴定的恢复基因均编码不同的三角状五肽(pentatricopeptide)重复(ppr)蛋白。ppr蛋白含有2至27个重复的一种35个氨基酸的基序，称为ppr基序(small and peeters,2000)。许多ppr蛋白被靶向到cms关联基因和产物定位的线粒体(lurin等,2004)。
17.关于来自玉米、稻、矮牵牛、和萝卜的育性恢复基因的额外信息可以参见美国专利申请流水号us2006/0253931，和美国专利5,981,833；5,624,842；4,569,152；6,951,970；6,392,127；7,612,251；7,314,971；7,017,375；7,164,058；和5,644,066，它们全部通过提及并入本文。
18.公开概述
19.在一些实施方案中，本公开内容提供了用于选择包含针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的植物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)对植物群体筛选至少一种标志物核酸，其中所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；(b)检测所述标志物核酸；(c)鉴定包含所述标志物核酸的植物；并且(d)选择所述包含所述标志物核酸的植物，其中所述包含所述标志物核酸的植物进一步包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因。
20.在其它实施方案中，本公开内容提供了一种在s型细胞质雄性不育植物的后代中恢复育性的方法。所述方法包括以下步骤：(a)将雌性植物与雄性植物杂交以产生后代植物的群体，其中所述雌性植物是s型细胞质雄性不育植物，并且其中所述雄性植物具备针对s型细胞质雄性不育的功能恢复基因；(b)筛选该后代植物群体以鉴定包含至少一种标志物核酸的能育后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；(c)选择包含至少一种标志物核酸的所述能育后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；并且(d)繁殖所述能育后代植物，其中所述能育后代植物包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因。
21.在一些实施方案中，本公开内容提供了用于将rf3基因转移到后代植物中的方法。所述方法包括以下步骤：(a)杂交第一亲本植物和第二亲本植物以生成后代植物，其中至少一种亲本植物包含所述rf3基因；(b)对该后代植物分析与所述rf3基因连锁的至少一种标
志物的存在，以获得rf3后代植物；(c)将所述rf3后代植物与所述第一亲本植物或所述第二亲本植物回交，以生成下一代后代植物；并且(d)对所述下一代后代植物分析与所述rf3基因连锁的至少一种标志物的存在，以获得rf3下一代后代植物。
22.附图简述
23.图1包括染色体2的遗传图，包括cms
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s育性恢复者qtl，以及显示与qtl有关的标志物的lod评分的qtl作图。
24.序列表
25.seq id no:1
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44显示了与玉米rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)，并且位于染色体2上含有rf3基因座的8.3mb区内的标志物和引物的例示性序列。
26.seq id no:45
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68显示了从几种ppr基因开发的多态性标志物和引物的例示性序列。
27.seq id no:69
‑
85显示了从ppr2基因开发的多态性标志物和引物的例示性序列。
28.seq id no:86
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91显示了rf3等位基因特异性确定法和内部对照延长因子α
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1的引物和探针的例示性序列。
29.seq id no:92是mo17 rf3
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ppr2基因(玉蜀黍栽培种s
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mo17(rf3/rf3)ppr
‑
814a mrna，完整cds；序列id：gb|fj176574.1)的cdna序列。
30.发明详述
31.i.术语
32.回交：回交方法可以用于将核酸序列引入植物中。近几十年以来回交技术已经广泛用来将新性状引入植物中。jensen,n.编plant breeding methodology,john wiley&sons,inc.,1988。在一个典型的回交方案中，将感兴趣的初始品种(轮回亲本)与携带要转移的感兴趣基因的第二品种(非轮回亲本)杂交。然后，将来自此杂交的所得后代与轮回亲本再次杂交，并重复该过程，直到获得植物，其中在来自非轮回亲本的转移基因外，在转化植物中恢复回归植物的基本上所有期望的形态学和生理学特征。
33.连锁的、紧密连锁的、和极紧密连锁的：如本文中使用的，基因或标志物间的“连锁”指染色体上的基因或标志物显示一起传递到下一代个体的可测量概率的现象。两种基因或标志物彼此越接近，此概率越接近(1)。因此，术语“连锁的”可以指一个或多个基因或标志物以大于0.5的概率(这是根据位于不同染色体上的标志物/基因的独立分配预期的)与基因一起传递。由于两个基因或标志物在染色体上的接近程度与基因或标志物被一起传递到下一代的个体的概率直接相关，因此术语“连锁的”在本文中也可以指在同一条玉米染色体上位于彼此的约8.5mb内的一个或多个基因或标志物。
34.因此，两个“连锁的”基因或标志物可以相隔约8.5mb；8.3mb；8.0mb；7.5mb；7.0mb；6.5mb；6.0mb；5.5mb；5.0mb；4.5mb；4.0mb；3.5mb；3.0mb；2.5mb；2.0mb；约1.95mb；约1.9mb；约1.85mb；约1.8mb；约1.75mb；约1.7mb；约1.65mb；约1.6mb；约1.55mb；约1.5mb；约1.45mb；约1.4mb；约1.35mb；约1.3mb；约1.25mb；约1.2mb；约1.15mb；约1.1mb；约1.05mb；约1.0mb；约0.95mb；约0.9mb；约0.85mb；约0.8mb；约0.75mb；约0.7mb；约0.65mb；约0.6mb；约0.55mb；约0.5mb；约0.45mb；约0.4mb；约0.35mb；约0.3mb；约0.25mb；约0.2mb；约0.15mb；约0.1mb；约0.05mb；约0.025mb；和约0.01mb。与rf3“连锁”的标志物的具体例子包括玉米基因组的染色体2的长臂上的核苷酸序列，例如，mo17
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102180901、pze
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102180129、fg
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1318、pze
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102183795、das
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pz
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102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
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5、ppr3
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7、ppr3
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
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srf39。
35.如本文中使用，术语“紧密连锁”可以指在同一条玉米染色体上位于彼此的约0.5mb内的一个或多个基因或标志物。因此，两个“紧密连锁”的基因或标志物可以相隔约0.6mb；约0.55mb；0.5mb；约0.45mb；约0.4mb；约0.35mb；约0.3mb；约0.25mb；约0.2mb；约0.15mb；约0.1mb；和约0.05mb。与rf3“紧密连锁”的标志物的具体例子包括ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
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5、ppr3
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7、ppr3
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
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srf39。
36.如本文中使用，术语“极紧密连锁”可以指在同一条玉米染色体上位于彼此的约100kb内的一个或多个基因或标志物。因此，两个“极紧密连锁”的基因或标志物可以相隔约125kb；约120kb；约115kb；约110kb；约105kb；100kb；约95kb；约90kb；约85kb；约80kb；约75kb；约70kb；约65kb；约60kb；约55kb；约50kb；约45kb；约40kb；约35kb；约30kb；约25kb；约20kb；约15kb；约10kb；约5kb；和约1kb。与rf3“极紧密连锁”的标志物的具体例子包括cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
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srf39。
37.rf3的连锁的、紧密连锁的、和极紧密连锁的遗传标志物可以用于标志物辅助育种程序以鉴定玉米s型细胞质雄性不育基因类型的恢复者，并且将此性状育种到玉米品种中。
38.基因座/座位：如本文中使用的，术语“基因座”/“座位”指基因组上与可测量的特征(例如，性状)对应的位置。snp基因座通过与基因座内含有的dna杂交的探针来界定。
39.标志物：如本文中使用的，术语“标志物”指可以用于鉴定具有特定等位基因，例如rf3的植物的基因或核苷酸序列。标志物可以描述为给定的基因组基因座处的变异。遗传标志物可以是短dna序列，如单碱基对变化(单核苷酸多态性，或“snp”)周围的序列，或长dna序列，例如微卫星/简单序列重复(“ssr”)。术语“标志物等位基因”指存在于特定植物中的标志物的形式。
40.如本文中使用的，术语“标志物”可以指玉米染色体dna的克隆区段(例如，如以mo17
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5、ppr3
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
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srf39界定的)，并且/或者可以指与玉米染色体dna的克隆区段互补的dna分子(例如与mo17
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
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srf39互补的dna)。
41.在一些实施方案中，植物中的标志物存在可以使用核酸探针来检测。探针可以是dna分子或rna分子。可以通过本领域中已知的手段，例如使用dna分子模板合成rna探针。探针可以含有标志物的整个或部分的核苷酸序列和来自玉米基因组的额外的、连续的核苷酸
序列。这在本文中称为“连续探针”。所述额外的、连续的核苷酸序列称为初始标志物的“上游”或“下游”，这取决于来自玉米染色体的连续核苷酸序列是在初始标志物的5’还是3’侧，如按照惯例理解的。额外的、连续的核苷酸序列可以位于下述两者之间：初始标志物；位于玉米基因组的染色体2上的侧翼标志物mo17
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14388和pze
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102184593之间的8.3mb区。如本领域普通技术人员认可的，向标志物中纳入的额外的、连续的核苷酸序列的过程几乎可以无限重复(仅受限于染色体的长度)，由此在玉米染色体的全长上鉴定额外的标志物。任何上文描述的标志物均可以在本公开的一些实施方案中使用。
42.寡核苷酸探针序列可以合成或通过克隆制备。合适的克隆载体是本领域技术人员公知的。寡核苷酸探针可以是标记的或未标记的。有极其多种技术可用于标记核酸分子，包括例如但不限于：通过缺口平移的放射性标记；随机引发；用末端脱氧转移酶(deoxytransferase)的加尾；等等，其中采用的核苷酸例如用放射性
32
p标记。可以使用的其它标记物包括例如但不限于：荧光团；酶；酶底物；酶辅因子；酶抑制剂；等等。或者，自身或与其它反应剂结合提供可检测信号的标记物的使用可以通过与受体结合的配体替换，其中标记受体(例如通过上文指示的标记物)以自身或与其它试剂结合提供可检测信号。参见，例如leary等(1983)proc.natl.acad.sci.usa 80:4045
‑
9。
43.探针可以含有与原始标志物的核苷酸序列不连续的核苷酸序列；此探针在本文中称为“非连续探针”。非连续探针的序列与玉米染色体上的初始标志物的序列足够接近地定位，以致于非连续探针与相同的基因(例如rf3)遗传连锁。例如，在一些实施方案中，非连续探针可以位于距玉米基因组上的原始标志物的500kb；450kb；400kb；350kb；300kb；250kb；200kb；150kb；125kb；100kb；0.9kb；0.8kb；0.7kb；0.6kb；0.5kb；0.4kb；0.3kb；0.2kb；或0.1kb内。
44.在一个实施方案中，探针可以是要检测的标志物的精确拷贝。探针也可以是包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的核酸分子，所述核苷酸序列与玉米染色体dna的克隆区段(例如，如以mo17
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102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
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5、ppr3
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf321、和dascms
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srf39界定者)基本上相同。如本文中使用的，术语“基本上相同”可以指超过85％相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以与参照序列是85.5％；86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同的。
45.在一个实施方案中，探针也可以是与要检测的标志物(“dna靶标”)的精确拷贝“可特异性杂交”或“特异性互补”的核酸分子。“可特异性杂交”和“特异性互补”是这样的术语，其指示足以使得核酸分子和dna靶标之间发生稳定且特异性的结合的互补性程度。核酸分子与其可特异性杂交的靶序列不需要是100％互补的。在有足够程度的互补性以避免核酸在期望特异性结合的条件下，例如在严格杂交条件下，非特异性结合非靶序列时，核酸分子是可特异性杂交的。
46.产生特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质及杂交核酸序列的组成和长度而有所变化。一般地，杂交的温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是na

和/或mg

浓度)会决定杂交严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定严格性程度需要的
杂交条件的计算是本领域普通技术人员已知的，并且例如在sambrook等(编)molecular cloning:a laboratory manual,第2版,第1
‑
3卷,cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny,1989,第9章和第11章；以及hames and higgins(编)nucleic acid hybridization,irl press,oxford,1985讨论。关于核酸杂交的更为详细的用法说明和指导可以参见例如tijssen,“overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”于laboratory techniques in biochemistry and molecular biology
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hybridization with nucleic acid probes,第i部分,第2章,elsevier,ny,1993；和ausubel等编,current protocols in molecular biology,第2章,greene publishing and wiley
‑
interscience,ny,1995。
47.如本文中使用，“严格条件”涵盖仅在杂交分子与dna靶标之间存在有小于25％错配时发生杂交的条件。严格条件包括其它特定的严格性水平。如此，如本文中使用，“温和(moderate)严格性”条件是具有超过25％序列错配的分子不会杂交的那些条件；“中等(medium)严格性”条件是具有超过15％错配的分子不会杂交的那些条件；而“高严格性”条件是具有超过10％错配的序列不会杂交的那些条件。“非常高严格性”的条件是具有超过6％错配的序列不会杂交的那些条件。
48.在具体的实施方案中，严格条件是于65℃在6x盐水
‑
柠檬酸钠(ssc)缓冲液、5x登哈特(denhardt)氏溶液、0.5％sds、和100μg剪切的鲑鱼精巢dna中杂交，接着于65℃在2x ssc缓冲液和0.5％sds中，接着是1x ssc缓冲液和0.5％sds中，最终0.2x ssc缓冲液和0.5％sds中顺序清洗15
‑
30分钟。
49.就上文讨论的所有探针而言，探针可以包含别的核酸序列，例如：gdna；启动子；转录信号；和/或载体序列。上文讨论的任何探针均可以用来限定其他与参与将育性恢复到s型细胞质不育玉米的基因(例如rf3)连锁的标志物。如此鉴定的标志物可以等同于本公开内容中命名的例示性标志物，因此落入本公开内容的范围内。
50.标志物辅助育种：如本文中使用的，术语“标志物辅助育种”可以指针对一种或多种复杂性状(例如育性的cms
‑
s恢复系)直接育种的办法。实际上，植物育种人员尝试鉴定与农艺学期望的性状连锁的容易地可检出的性状，诸如花颜色、种皮外观、或同工酶变体。植物育种人员然后通过追踪易检出性状的分离来追踪分离的育种群体中的农艺学性状。然而，很少有这样的连锁关系可用于在植物育种中。
51.标志物辅助育种为改善植物品种提供了一种高时间和成本效率的方法。应用标志物辅助育种的几种例子涉及使用同工酶标志物。参见例如tanksley and orton编(1983)isozymes in plant breeding and genetics,amsterdam:elsevier。一个例子是与对番茄中的线虫害虫抗性的基因有关的同工酶标志物。该抗性由一种称作mi的基因控制，位于番茄的染色体6上，并且与aps1(一种酸性磷酸酶同工酶)非常紧密的连锁。使用aps1同工酶标志物间接选择mi基因有下面几点优势：可以用标准电泳技术明确测定群体中的分离；可以在幼苗组织中对同工酶标志物评分，从而无需维持植物到成熟；并且同工酶标志物等位基因的共显性为区分纯合子和杂合子创造了条件。参见rick(1983)于tanksley and orton,同上文。
52.可操作连接的：当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系中时，第一核苷酸序列与第二核酸序列“可操作连接”。例如，若启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子
或“相似性”。用于进行此调节的技术是本领域普通技术人员公知的。通常，此类技术牵涉将保守取代评分为部分而不是完全错配，从而增加百分比序列同一性。例如，在对相同氨基酸给予0
‑
1的得分，并且对非保守取代给予0的得分的情况下，对保守取代给予0
‑
1的得分。可以计算保守取代的评分，例如如程序pc/gene(intelligenetics,mountain view,ca)中执行。
60.如本文中所使用，术语“序列同一性百分比”可以指通过在比对窗口里比较两个最佳比对的序列确定的数值，其中为了实现两个序列的最佳比对，比较窗中序列的部分与参照序列(其不包含添加或缺失)相比可以包含添加或缺失(即，缺口)。通过确定两个序列中存在相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数，并将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算百分比。
61.单核苷酸多态性(snp)：如本文中使用的，术语“单核苷酸多态性”可以指当基因组(或其它共享序列)中的单个核苷酸在物种的成员或个体中的成对染色体间不同时发生的dna序列变异。
62.在群体内，可以对snp分配次要等位基因频率，即特定群体中观察到的基因座处的最低等位基因频率。这简单地就是单核苷酸多态性的两个等位基因频率中的较小者。在人群体与群体之间有变异，因此在一个地理或种族组中普遍的snp等位基因在另一个中可能罕见得多。
63.单核苷酸多态性可以落入基因的编码序列、基因的非编码区内，或者在基因之间的基因间区域中。由于遗传密码的简并性，编码序列内的snp不一定会改变生成的蛋白质的氨基酸序列。两种形式都导致相同多肽序列的snp称作“同义”(有时称作沉默突变)。若生成不同多肽序列，则它们称作“非同义”。非同义变化可以是错义或无义，其中错义变化导致不同的氨基酸，并且无义变化导致过早的终止密码子。不在蛋白质编码区中的snp可以仍具有基因剪接、转录因子结合、或非编码rna的序列的后果。snp通常是双等位的，并且因此容易在植物和动物中确定。sachidanandam(2001)nature 409:928
‑
33。
64.性状或表型：术语“性状”和“表型”在本文中可互换使用。为本公开的目的，特别感兴趣的性状是s型cms的育性恢复。
65.ii.rf3基因及其分子标志物
66.本公开内容提供了影响植物中的雄性育性的基因——玉米rf3，及其连锁的遗传标志物的具体实施方案，可以在多种系统中用于控制雄性育性。此外，公开的连锁遗传标志物中固有的多态性允许植物育种人员追踪分离群体中的基因的特定等位基因rf3或rf3。
67.rf3基因最初在源自雄性不育系“4xp811
‑
d”与恢复系“lh60”的杂交的450个个体的d2群体中被定位到染色体2。鉴于细胞质雄性不育和花粉育性恢复在玉米杂种种子生产中的现实重要性，以及细胞质来源多样化的必要性，描述了用kaspar
tm
基因型分型技术，使用分子标志物将针对cms
‑
s的玉米rf3恢复基因精细定位到非常小的区域，并通过基于图谱的克隆鉴定玉米rf3基因。确定了rf3是两种玉米近交物：lh60和mbb56中的cms
‑
s的单一显性恢复基因。
68.和几乎所有其它育性恢复基因一样，rf3基因编码一种三角状五肽重复(ppr)蛋白。rf3基因和rf3基因标志物的鉴定可以大大促进cms
‑
s育性恢复性状在植物种质中的广泛开发和部署。在一些实施方案中，可以使用与玉米rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或
极紧密连锁)或者驻留于玉米rf3基因内的标志物，或者玉米rf3基因序列自身，将玉米rf3基因引入植物生物体中。
69.使用snp标志物将rf3定位到染色体2的长臂上被标志物mo17
‑
14388和das
‑
pz
‑
13844侧翼的一个约8.3mb的区域。用来自玉蜀黍栽培种b73的参照基因组序列注释此区间，揭示了10个ppr基因，并且将rf3基因进一步精细定位到一个约1.3mb的小区间。
70.在本公开内容中，提供了与玉米cms
‑
s恢复基因rf3连锁的分子标志物。鉴定出一些dna区段含有参与cms
‑
s植物育性恢复的序列。这些区段位于与rf3基因(seq id no:92)连锁的标志物之间。还提供了包含rf3基因的核酸分子。这些鉴定的区段及其标志物在本文中部分地用它们在玉米染色体2长臂上的特定区域中的位置来描述。
71.鉴定的区域，及其标志物，的位置，当重组频率或图距单位表示时，是作为一般信息提供的。本文中描述的实施方案是使用玉米群体4xp811
‑
d x lh60获得的。然而，特定区段和标志物的位置参照公众可得的b73玉米近交基因组序列(b73 refgen v2)(其可以在玉米gdb找到)以图距单位来表示。预期对特定区段和标志物给出图距单位数目可能随栽培种不同而变化，且不是dna区段和标志物的必要定义的一部分，这些dna区段和标志物另行用例如核苷酸序列来描述。
72.rf3基因的显性等位基因控制cms
‑
s/rf3系统中的育性恢复。在具体的实施方案中，提供了rf3基因(seq id no:92)。在一些实施方案中，本公开内容还包括那些与rf3序列(seq id no:92)基本上相同的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，核酸分子是与rf3序列(seq id no:92)至少约85％相同的rf3同源物。rf3同源物可以与rf3序列(seq id no:92)86％；87％；88％；89％；90％；91％；92％；93％；94％；95％；96％；97％；98％；99％或99.5％相同。可以容易地鉴定此类rf3同源物，并且可以从多种生物体的对于本领域技术人员容易获得的任何完整或部分基因组分离。
73.一些实施方案还包括rf3基因的功能性变体。rf3的功能性变体包括，例如，包含一个或多个核苷酸取代、缺失、或插入的rf3序列(seq id no:92)，其中功能性变体可恢复cms
‑
s玉米的雄性育性，这可以通过本领域普通技术人员公知的常规技术来测量。例如，可以通过将突变或片段常规导入不育rf3等位基因纯合的植物中，然后常规观察植物的雄性不育性，来确定rf3基因的特定变体恢复cms
‑
s玉米雄性育性的能力。rf3基因的功能性变体可以通过定点诱变、诱导突变来创建，或者它们可以作为等位变体(多态性，例如snp)存在。
74.在一些实施方案中，因此，rf3基因的功能性变体可以是rf3的突变，或小于rf3的整个序列的片段，这些片段保留rf3基因的雄性不育性控制特性。因此，此类突变和片段认为在本公开内容的范围内。本领域普通技术人员可以容易地确定本文中列出的rf3序列的突变或片段是否保留rf3基因的特性。
75.iii.使用rf3基因的方法
76.可以借助本领域技术人员已知的技术，使用本文中描述的rf3基因来操作基因，以产生期望的效果。例如但不限于，rf3基因可以用来：将突变体rf3序列引入植物中以引起不育性；将突变引入天然rf3序列中；将靶向rf3dna或rna的反义核酸分子引入植物中以影响育性；使用发夹形成；或者将rf3序列与其它核酸序列连接以控制rf3基因产物的表达。例如，在一些实施方案中，rf3基因(seq id no:92)可以与影响玉米中的雄性育性的其它基因或突变体结合使用，以便于cms
‑
s/rf3雄性育性系统的利用。
77.在一些实施方案中，可以将rf3基因引入玉米植物中，所述玉米植物适合于在与cms
‑
s/rf3雄性育性系统不同的雄性育性系统中使用。或者，可以将与rf3不同的基因或突变体基因引入适合于在cms
‑
s/rf3雄性育性系统中使用的玉米植物，使得引入的基因或突变体基因可以用于提供额外的或互补的育性控制。玉米中的其它雄性育性基因和突变的具体例子包括：cms
‑
t/rf1；cms
‑
t/rf2；cms
‑
s/rf3；ms1(singleton and jones(1930)j.hered.21:266
‑
8)；ms2和ms3(eyster(1931)j.hered.22:99
‑
102)；ms5，ms7，ms8，ms9，ms10，ms11，ms12，ms13，和ms14(beadle(1932)genetics 17:413
‑
31)；ms17(emerson(1932)science 75:566)；ms20(eyster(1934)bibliographia genetica 11:187
‑
392)；ms23和ms24(west and albertsen(1985)mnl 59:87)；ms25和ms26(loukides等(1995)am.j.bot.82:1017
‑
23)；ms27和ms38(albertsen等(1996)mnl 70:30
‑
1)；ms28(golubovskaya(1979)mnl 53:66
‑
70)；ms29和ms31(trimnell等(1998)mnl 72:37
‑
38)；ms30(albertsen等(1999)mnl 73:48)；ms32，ms36，和ms37(trimnell等(1999)mnl 73:48
‑
50)；ms33和ms34(patterson(1995)mnl 69:126
‑
8)；ms43(golubovskaya(1979)int.rev.cytol.58:247
‑
90)；ms45(albertsen等(1993)proc.annu.corn sorghum ind.res.conf.48:224
‑
33；和ms48，ms49，和ms50(trimnell等(2002)mnl 76:38
‑
9)。
78.当将核酸序列(例如rf3)“导入”生物体，如植物中时，用于导入包含特定序列的核酸分子的技术或方法对于本公开内容不是必需的，并且可以借助本领域技术人员已知的任何技术或方法。例如，可以通过直接转化方法，如土壤杆菌(agrobacterium)介导的植物组织转化；微粒轰击；电穿孔等导入核酸分子。或者，可以通过将具有特定核苷酸序列的植物与另一个植物杂交，使得后代的基因组中组入其核苷酸序列，来导入核酸分子。此类育种技术是本领域技术人员公知的。如本文中公开的标志物辅助育种技术可以大大促进rf3借助此类杂交的掺入。
79.在将rf3基因导入生物体的实施方案中，可能期望以一定的方式导入rf3基因，使得rf3基因与一种或多种调节序列可操作连接，例如使用质粒导入，所述质粒包含与期望的调节序列可操作连接的rf3基因。可用于表达异源核酸序列的调节序列是本领域中公知的，并且包括例如但不限于：启动子(例如组成性启动子；组织特异性启动子；和发育阶段特异性启动子)；终止序列；增强子序列；亚细胞靶向序列；稳定化或前导序列；和内含子。
80.在一些实施方案中，可以将rf3基因与一种或多种别的期望的核酸序列(例如基因)一起导入生物体。别的期望的核酸序列可以包括例如：编码外来蛋白质的基因；农艺学基因；植物疾病抗性基因；赋予对植物有害物的抗性的基因；赋予对除草剂的抗性的基因；和赋予或促成增值性状(例如，修饰脂肪酸代谢；降低肌醇六磷酸盐含量；和修饰碳水化合物组成)的基因。所有前述核酸序列的例子是本领域技术人员已知的。
81.也可以将rf3基因与一种或多种与调节元件(例如启动子)可操作连接的标志物基因一起导入生物体，所述调节元件允许通过阴性选择(即，抑制不含选择标志物基因的细胞生长)或者通过阳性选择(即筛选由遗传标志物编码的产物)回收含有标志物的经转化的细胞。用于转化的许多选择标志物基因是转化领域中公知的，并且包括例如，编码代谢上解毒可以为抗生素或除草剂的选择性化学剂的酶的基因，或者编码可以对抑制剂不敏感的改变的靶标的基因。阳性选择方法也是本领域中已知的。适合于在植物细胞中使用的标志物基因的例子可以包括例如但不限于：新霉素磷酸转移酶ii(nptii)基因(fraley等(1983)
proc.natl.acad.sci.usa 80:4803)；潮霉素磷酸转移酶基因(vanden elzen等(1985)plant mol.biol.5:299)；庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、氨基糖苷
‑
3'
‑
腺苷基转移酶、和博来霉素抗性决定子(参见例如hayford等(1988)plant physiol.86:1216；jones等(1987)mol.gen.genet.210:86)；svab等(1990)plant mol.biol.14:197；及hille等(1986)plant mol.biol.7:171)；赋予对除草剂，如草甘膦、草丁磷或溴苯腈(bromoxynil)的抗性的选择标志物基因(参见例如comai等(1985)nature 317:741
‑
744；gordon
‑
kamm等(1990)plant cell 2:603
‑
618；和stalker等(1988)science 242:419
‑
423)；小鼠二氢叶酸还原酶(eichholtz等(1987)somatic cell mol.genet.13:67)；植物5
‑
烯醇丙酮莽草酸
‑3‑
磷酸合酶(shah等(1986)science 233:478)；植物乙酰乳酸合酶(charest等(1990)plant cell rep.8:643)。
82.另一类适合于植物转化的标志物基因对推定转化的植物细胞进行筛选，而不是直接遗传选择对毒性物质，如抗生素具有抗性的转化细胞。这些基因特别可用于定量或可视化特定组织中的基因表达的空间模式，并且经常被称为“报告基因”，因为它们可以与基因或基因调节序列融合以调查基因表达。用于筛选转化细胞的常用基因包括β
‑
葡糖醛酸糖苷酶(gus)、β
‑
半乳糖苷酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶。参见例如jefferson(1987)plant mol.biol.rep.5:387；teeri等(1989)embo j.8:343；koncz等(1987)proc.natl.acad.sci u.s.a.84:131；和deblock等(1984)embo j.3:1681。
83.最近，已经使不需要破坏植物组织的用于显现gus活性的体内方法已经问世。molecular probes publication 2908,imagene green.tm.,p.1
‑
4,1993；和naleway等(1991)j.cell biol.115:151a。此外，编码荧光蛋白(例如，gfp、egfp、ebfp、ecfp和yfp)的基因向来被用作原核和真核细胞中的基因表达的标志物。参见chalfie等(1994)science 263:802。可以使用荧光蛋白和荧光蛋白的突变作为可筛选标志物。
84.在一些实施方案中，可以使用本文中公开的玉米rf3基因和玉米rf3基因的片段或区段从与玉米不同的生物体中鉴定同源rf3基因序列(例如通过序列比较)。可以从与玉米不同的生物体鉴定出与玉米rf3基因同源的序列，并且根据公知的技术分离，例如，基于其与rf3序列的序列同源性加以分离。例如，可以根据常规技术使用整个或部分的rf3编码序列作为探针，所述探针与来自生物体的克隆基因组dna片段的群体(即基因组文库)中存在的其它序列特异性杂交。因此，在一些实施方案中，本公开内容包括那些与rf3序列特异性杂交的核苷酸序列。
85.或者，可以鉴定与玉米rf3基因同源的来自与玉米不同的生物体的序列，并且通过序列比较分离。例如，可以根据常规技术用玉米rf3搜索生物体的完全或部分测序基因组，以鉴定生物体基因组内与玉米rf3共享高序列同一性程度、并因此有可能是rf3同源物的基因。
86.例如，可以使用整个或部分的玉米rf3序列作为“参照序列”。一般地，与参照序列比较的核酸序列(例如基因组文库的克隆或基因组dna片段)包含“比较窗”，其是核酸序列的特定的连续区段。为了两个序列的最佳比对，与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗可以包含添加或缺失(即缺口)。比较窗的长度通常是至少20个连续的核苷酸，但是长度可以是30、40、50、100、或200个核苷酸或更长。为了避免由于在多核苷酸序列比较窗中纳入缺失所致的与参照序列的高相似性，可以引入“缺口罚分”以从核苷酸匹配数目中扣除。
87.比对比较序列的方法是本领域中公知的。可以使用可用的数学算法实现任何两个序列之间的百分比序列同一性的确定。此类数学算法的非限制性例子是myers and miller(1988),cabios 4:11
‑
7的算法；smith等(1981)adv.appl.math.2:482的局部比对算法；needleman and wunsch(1970),j.mol.biol.48:443
‑
53的全局比对算法；pearson and lipman(1988),proc.natl.acad.sci.usa 85:2444
‑
8的局部比对搜索方法；karlin and altschul(1990),proc.natl.acad.sci.usa 87:2264，以及karlin and altschul(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:5873
‑
7的算法。
88.本领域普通技术人员可以在计算机上实现这些数学算法以比较序列，从而确定序列同一性，或者根据与参照序列共享的序列同一性搜索包含多个序列的数据库(例如生物体基因组数据库)。这样的实现手段包括但不限于pc/gene程序(intelligenetics,mountain view,ca)中的clustal；和gcg wisconsin genetics software package,v.10(accelrys inc.,san diego,ca)中的align程序和gap、bestfit、blast、fasta和tfasta。使用这些程序的序列比对可以使用其缺省参数实施。或者，可以期望在一些搜索中修改缺省参数(例如改变缺口罚分的数值)。选择数学算法的特定计算机实现以计算序列同一性，和选择参数数值以在选定的算法中使用在本领域技术人员的裁量范围之内。
89.iv.使用rf3分子标志物的方法
90.使用与rf3基因连锁或驻留于rf3基因内的核酸分子标志物鉴定具有s型cms的功能恢复基因的植物的方法可以为植物开发人员节约成本，因为这样的方法可以省略对杂交包含功能恢复基因的植物与cms植物系、并且然后对杂交的后代确定表型的需要。
91.有可能将其他标志物鉴定为本文提到的任一例示性标志物(例如mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
‑
1318、pze
‑
102182167、pze
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102182672、pze
‑
102182718、pze
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102183578、pze
‑
102183795、das
‑
pz
‑
13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、和dascms
‑
srf39)的等同物，例如，通过确定其他标志物和提及的例示性标志物之间的重组频率。这样的确定可以利用基于mather(1931),the measurement of linkage in heredity,methuen&co.,london的方法的改善的正交比较方法，然后进行最大似然检验以确定重组频率。allard(1956)hilgardia 24:235
‑
78。若重组频率的值在任何玉米栽培种中均小于或等于0.10(即10％)，则为本公开的方法中使用的目的，认为该其他标志物等同于特定的参照标志物。
92.用于恢复cms
‑
s玉米育性的手段可以包括来自植物的这样的核酸序列，如果检出该核酸，则强烈指示包含该核酸序列的植物包含cms
‑
s基因的功能恢复者。在一些例子中，用于恢复到cms
‑
s玉米育性的手段是与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)或驻留于rf3基因内的标志物。
93.用于鉴定携带用于将育性恢复到cms
‑
s玉米的基因的玉米植物的手段可以是这样的分子，该分子在被添加到从携带用于将育性恢复到cms
‑
s玉米的基因的植物获得的样品时，呈现可检测的信号。核酸的特异性杂交是可检测信号，因此与cms
‑
s恢复基因特异性杂交、或者与作为功能性cms
‑
s恢复基因的存在指示的不同基因组核酸序列特异性杂交的核酸探针可以构成用于鉴定携带用于将育性恢复到cms
‑
s玉米的基因的玉米植物的手段。在一些例子中，用于鉴定携带用于将育性恢复到cms
‑
s玉米的基因的植物的手段是与玉米rf3
基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)或驻留于玉米rf3基因内的标志物特异性杂交的探针。
94.在一些实施方案中，可以使用在rf3基因侧翼的标志物来转移明确含有rf3基因的供体亲本dna的区段。在具体的实施方案中，标志物选自包括mo17
‑
14388、pze
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102180901、pze
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102180129、fg
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1318、pze
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102182167、pze
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102182672、pze
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102182718、pze
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102183578、pze
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102183795、das
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pz
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13844、pze
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102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
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5、ppr3
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7、ppr3
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
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srf39的标志物组。在其它实施方案中，等同的标志物选自包括mo17
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14388、pze
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102180901、pze
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102180129、fg
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1318、pze
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102182167、pze
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102182672、pze
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102183795、das
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13844、pze
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102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
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5、ppr3
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7、ppr3
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9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
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srf31、dascms
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srf34、dascms
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srf321、和dascms
‑
srf39的标志物组。在一些实施方案中，使用在rf3基因侧翼的标志物来转移含有rf3基因的供体亲本dna的区段的方法可以包括用与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物可特异性杂交的探针分析两个亲本植物的基因组dna；有性杂交两个亲本植物基因型以获得后代群体，并且对那些后代分析与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物的存在；将含有与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物的后代与接受基因型回交以产生第一回交群体，并且然后继续回交程序，直至获得包含由亲本基因型和rf3基因展现的任何期望的性状的最终后代。在具体的实施方案中，通过在每代的rf3标志物分析选择每次杂交和回交步骤中获得的个别后代。在一些实施方案中，用与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物可特异性杂交的探针分析两个亲本植物的基因组dna揭示了亲本植物之一包含更少的与探针特异性杂交的连锁标志物，或者无一与探针特异性杂交的连锁标志物。
95.在一些实施方案中，与玉米rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)或驻留于玉米rf3基因内的标志物，或玉米rf3基因序列自身可以用于通过遗传转化将玉米rf3基因导入玉米植物中。在具体的实施方案中，标志物选自包含mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
‑
1318、pze
‑
102182167、pze
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102182672、pze
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102182718、pze
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102183578、pze
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102183795、das
‑
pz
‑
13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、和dascms
‑
srf39的标志物组。在其它实施方案中，等同的标志物选自包括mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
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102180129、fg
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1318、pze
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102182167、pze
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102182672、pze
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102182718、pze
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102183578、pze
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102183795、das
‑
pz
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13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、和dascms
‑
srf39的标志物组。在一些实施方案中，通过遗传重组将玉米rf3基因导入玉米植物中的方法可以包括用与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物或rf3基因自身可特异性杂交的探针分析植物(例如玉米植物)的基因组dna以鉴定植物中的rf3基因；分离包含rf3基因的植物的基因组dna的区段，例如，通过提取基因组dna并且用一种或多种酶限制性内切核酸酶消化基因组dna；任选地，扩增dna的分离的区段；将dna的分离的区段导入宿主玉米植
物的细胞或组织中；并且用与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物或rf3基因自身可特异性杂交的探针分析宿主玉米植物的dna以鉴定宿主玉米植物中的rf3基因。在具体的实施方案中，可以将dna的分离的区段导入宿主玉米植物中，使得它稳定整合到宿主玉米植物的基因组中。
96.在一些实施方案中，与玉米rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)或驻留于玉米rf3基因内的标志物，或玉米rf3基因序列自身，可以用于将玉米rf3基因导入其它生物体，例如植物中。在具体的实施方案中，标志物选自包括mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
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1318、pze
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102182167、pze
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102182672、pze
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102182718、pze
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102183578、pze
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102183795、das
‑
pz
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13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、和dascms
‑
srf39的标志物组。在其它实施方案中，等同的标志物选自包括mo17
‑
14388、pze
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102180901、pze
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102180129、fg
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1318、pze
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102182167、pze
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102182672、pze
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102182718、pze
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102183578、pze
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102183795、das
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pz
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13844、pze
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102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
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5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、和dascms
‑
srf39的标志物组。在一些实施方案中，用于将玉米rf3基因导入与玉米不同的生物体中的方法可以包括用与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物或rf3基因自身可特异性杂交的探针分析植物(例如玉米植物)的基因组dna以鉴定植物中的rf3基因；分离包含rf3基因的植物的基因组dna的区段，例如通过提取基因组dna并且用一种或多种酶限制性内切核酸酶消化基因组dna；任选地，扩增dna的分离的区段；将dna的分离的区段导入与玉米不同的生物体中；并且用与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物或rf3基因自身可特异性杂交的探针分析与玉米不同的生物体的dna以鉴定生物体中的rf3基因。在具体的实施方案中，可以将dna的分离的区段导入生物体中，使得它稳定整合到生物体的基因组中。
97.在一些实施方案中，与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)或驻留于rf3基因内的标志物，或rf3基因序列自身可以用于鉴定具有cms
‑
s雄性不育性的功能恢复基因的植物。在具体的实施方案中，植物是玉米植物。在一些实施方案中，可以从植物提取核酸分子(例如基因组dna或mrna)。然后，可以使提取的核酸分子与一种或多种探针接触，所述探针与同rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物或rf3基因序列自身可特异性杂交。一种或多种探针与提取的核酸分子的特异性杂交指示植物中用于cms
‑
s雄性不育性的功能恢复基因的存在。
98.v.包含rf3基因的生物体
99.本公开内容的一些实施方案还提供了生物体，其包括包含rf3序列(seq id no:92)的核酸分子、与rf3序列(seq id no:92)可特异性杂交的核酸序列、或rf3序列(seq id no:92)的功能性变体。合适的生物体可以是任何合适的植物、酵母或细菌。作为非限制性例子，包含前述序列的植物可以是具有农艺学价值的植物，例如但不限于：玉米；大豆；苜蓿；小麦；油菜；稻；高粱；甜菜；各种蔬菜，包括黄瓜、番茄、胡椒等；各种树，包括苹果树、梨树、桃树、樱桃树、红杉、松、栎树等；和各种观赏植物。在具体的实施方案中，生物体可以是有性繁殖植物。包含特定核酸序列的结种子的植物可以产生包含核酸序列的种子。
100.包含rf3序列(seq id no:92)、与rf3序列(seq id no:92)可特异性杂交的核酸序列、或rf3序列(seq id no:92)的功能性变体的植物细胞可以被培养，并且以植物组织培养细胞的形式保持，或者可以将本领域中已知的某些植物激素添加到培养基，从而使植物组织培养细胞分化并且形成新的植物品种，所述新的植物品种可以是能育或不育的。可用于这些和其它实施方案的植物培养方法是本领域中常规且公知的。
101.本公开内容的一些实施方案提供了病毒(例如噬菌体或植物病毒)，其包含rf3序列(seq id no:92)、与rf3序列(seq id no:92)可特异性杂交的核酸序列、或rf3序列(seq id no:92)的功能性变体。
102.vi.本公开内容的多个实施方案
103.在一个实施方案中，提供了选择包含针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的植物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)对植物群体筛选至少一种标志物核酸，其中所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；(b)检测所述标志物核酸；(c)鉴定包含所述标志物核酸的植物；并且(d)选择所述包含所述标志物核酸的植物，其中所述包含所述标志物核酸的植物进一步包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因。如本文中使用的，术语“标志物核酸”意指用于确定分子、细胞或组织的属性或特征(例如存在或缺无、位置、关联等)的核酸分子。
104.在一些实施方案中，标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因的单元型。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
‑
1318、pze
‑
102182167、pze
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102182672、pze
‑
102182718、pze
‑
102183578、pze
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102183795、das
‑
pz
‑
13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39和其任何组合。仍在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。
105.在一些实施方案中，标志物核酸选自下组：ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、
seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。
106.在多个实施方案中，所述标志物中的至少一种在8.3mb内与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。在其它多个实施方案中，所述标志物中的至少一种在.5mb内与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。在其它多个实施方案中，所述标志物中的至少一种在100kb内与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
107.在一些实施方案中，植物是玉米植物。在另一个实施方案中，玉米植物属于坚杆(stiff stalk)杂种优势组。玉米杂种，如温带玉米杂种可以源自杂种优势组，如爱荷华(iowa)坚杆杂种优势组。坚杆杂种优势组是植物育种领域中公知的。在又一个实施方案中，针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因是rf3基因(seq id no:92)。在本公开内容的另一个方面中，通过描述的方法获得玉米植物。
108.在本公开内容的又一个方面中，所述方法进一步包括以下步骤：(e)获得包含针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的植物；(f)将包含针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的植物与第二植物杂交以产生一个或多个后代植物；(g)对后代植物评估至少一种标志物核酸，所述标志物核酸包含与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；并且(h)选择包含所述至少一个标志物核酸后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因。
109.在一个实施方案中，提供了在s型细胞质雄性不育植物的后代中恢复育性的方法。所述方法包括以下步骤：(a)杂交雌性植物与雄性植物以产生后代植物的群体，其中所述雌性植物是s型细胞质雄性不育植物，并且其中所述雄性植物拥有针对s型细胞质雄性不育的功能恢复基因；(b)筛选后代植物的群体以鉴定包含至少一种标志物核酸的能育后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；(c)选择包含至少一种标志物核酸的所述能育后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；并且(d)繁殖所述能育后代植物，其中所述能育后代植物包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因。
110.在一些实施方案中，标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因的单元型。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
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102180129、fg
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1318、pze
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102182167、pze
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102182672、pze
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102182718、pze
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102183578、pze
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102183795、das
‑
pz
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13844、pze
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102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。
111.在一些实施方案中，标志物核酸选自下组：ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、
id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。
117.在一些实施方案中，标志物核酸选自下组：ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39和其任何组合。在其它实施方案中，标志物核酸选自下组：seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。
118.在多个实施方案中，所述标志物中的至少一种在8.3mb内与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。在其它多个实施方案中，所述标志物中的至少一种在.5mb内与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。在其它多个实施方案中，所述标志物中的至少一种在100kb内与针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
119.在一些实施方案中，植物是玉米植物。在另一个实施方案中，玉米植物属于坚杆杂种优势组。仍在另一个实施方案中，rf3基因是seq id no:92。
120.提供以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。实施例不应解释为将公开内容限于例示的具体的特征或实施方案。
实施例
121.实施例1：植物材料
122.使用cms
‑
s型雄性不育系4xp811
‑
d(美国专利7,135,629)、以及响应cms
‑
s型的雄性不育恢复系lh60作为亲本，产生f1后代。然后，自交f1后代以产生f2群体。f2群体由450个个体组成，使用该f2群体来鉴定rf3基因和与rf3基因连锁(例如连锁；紧密连锁；或极紧密连锁)的标志物。
123.利用包含275个源自4xp811
‑
d x mbb56(一种响应cms
‑
s型的雄性不育恢复系)的个体的bc1群体，以及根据1.3mb区间内的10个ppr基因设计的分子标志物，进行连锁图分析。
124.实施例2：育性分类
125.根据从雄花穗散布的花粉对来自f2和bc1群体的个体进行表型分类。散布花粉的植物归为能育。不散布花粉的植物归为不育。在f2群体中观察到部分能育的植物，但在bc1群体中未观察到。
126.还通过使用1％ki
‑
i2染色确定花粉粒的活力，对来自bc1群体的个体进行表型分类。对于能育植物，染色结果显示了充满淀粉的完全染色的花粉，并且对于不育植物，染色结果显示了未染色的空瘪的花粉。表1提供了来自f2和bc1定位群体的分离数据。
127.表1：来自f2和bc1定位群体的表型分离数据
[0128][0129]
实施例3：dna提取和定量
[0130]
使用magattract
tm
dna提取方法(qiagen,valencia,ca)和biocel 1800
tm
(agilent technologies,santa clara,ca)从每份样品8个叶冲孔块提取基因组dna。用quant
‑
it
tm
定量试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca)按照制造商的用法说明或用nanodrop 8000 spectrophotometer
tm
(thermo scientific,rockford,il)按照制造商的用法说明定量dna样品。将dna浓度归一到6ng/μl，以供在kaspar
tm
基因型分型系统(kbioscience inc.,hoddesdon,uk)中使用。
[0131]
实施例4：kaspar
tm
snp基因型分型系统
[0132]
竞争型等位基因特异性pcr基因型分型系统(kaspar
tm
)是一种snp检测系统，它使用一项基于等位基因特异性寡聚物延伸和荧光共振能量转移(fret)产生信号的技术。kaspar
tm
测定中的每种snp标志物仅需要两种组分：测定预混物(三种未标记的引物：两种等位基因特异性寡聚物和一种共同的反向基因座特异性寡聚物，的混合物)；和反应预混物(pcr所需的其它组分，包括通用荧光报告系统和taq聚合酶)。kaspar
tm
反应完成后在荧光分光光度计中读取荧光信号，对于fam荧光团，用485nm的激发波长和535nm的发射波长；对于vic荧光团，用525nm的激发波长和560nm的发射波长。使用klustercaller
tm
软件(kbiosciences inc.)分析数据以确定群体中的每种snp标志物的基因型。
[0133]
用kraken
tm
工作流管理器(kbiosciences,hoddesdon,hertfordshire,uk)设计基于snp或indel的kaspar
tm
测定。根据表2和3设立kaspar
tm
反应。pcr循环以94℃15分钟开始，然后是20个循环的94℃变性10秒、57℃退火5秒、然后于72℃延伸10秒，接着是22个循环个94℃变性10秒、57℃退火20秒，然后于72℃延伸40秒。扩增使用abipcr system 9700(applied biosystems,foster city,ca)来进行。通过pherastar
tm
荧光分光光度计(bmg labtech inc.,cary,nc)测量pcr产物。
[0134]
表2：用于测定预混物设置的配方
[0135][0136]
表3：用5μl终体积中的kaspar
tm
反应的配方
[0137][0138]
实施例5：使用snp标志物在f2群体中对rf3初步遗传定位。
[0139]
使用joinmap 4.0
tm
(van ooijen,j.w.等,2006)创建遗传连锁图，并且使用mapqtl 5.0
tm
(van ooijen,j.w.等,2006)定位f2群体中的qtl。实施区间定位法。当lod得分超过连锁群上的显著性阈值(置换检验结果)时，检测到分离qtl；在连锁群上具有最大lod的位置是qtl在图谱上的估计位置。
[0140]
对140种选定的snp标志物(对于染色体2，每10cm一个标志物，对于其它染色体，每20cm一个标志物)建立了kaspar
tm
测定，用这些测定对整个群体确定基因型以进行连锁图构建和qtl分析。以3.0的lod阈值将133个snp标志物成功分配到10个连锁群。
[0141]
在运行1000个置换后将3.6lod值设置为显著的阈值。全基因组qtl分析检出一个显著的qtl，用于恢复此种质的cms
‑
s育性(参见图1)。该qtl解释了总表型变异的30％。此qtl与染色体2上的8.3mb区内的分子标志物mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
‑
1318、pze
‑
102182167、pze
‑
102182672、pze
‑
102182718、pze
‑
102183578、pze
‑
102183795、das
‑
pz
‑
13844和pze
‑
102184593紧密连锁，并且其位置与恢复基因rf3的位置一致(参见图1，表3)。
[0142]
表3：与染色体2上的8.3mb区中的rf3基因座共分离的例示性标志物。
[0143][0144][0145]
实施例6：8.3mb qtl区的注释
[0146]
使用玉蜀黍栽培种b73参照基因组第2版(可在maize gdb等站点获取)，从220,446,527bp至228,748,276bp的核苷酸序列对所述8.3mb qtl区进行注释。在此区域中找到总共142个基因(数据未显示)。该142个基因中的10个是ppr基因(用星号标识；***)(表4)。这10个ppr基因位于一段1,282,382bp区间内，rf3基因定位在该区间中。一些ppr匹配先前
研究已知的恢复基因，可以是rf3候选基因。
[0147]
表4：8.3mb qtl区的注释结果。在区域中鉴定10个ppr基因。用星号鉴定ppr基因；***。
[0148]
[0149]
[0150][0151]
实施例7：将rf3基因精细定位到染色体2上的1.3mb区
[0152]
在基于b73参照基因组中的qtl区的注释鉴定了ppr基因后，利用基于b73中的ppr基因序列设计的特异性引物，通过pcr产生来自cms
‑
s系4xp811
‑
d和恢复系lh60的同源序列。该pcr在含有100ng基因组dna、10x qiagen
tm
pcr缓冲液、25mm mgcl2、2.5mm每种dntp、0.25mm特异性引物、和5u taq plus聚合酶的总体积50μl中进行。特异性引物的pcr条件是于94℃最初变性2分钟，接着是7个98℃10分钟、62℃(以
‑
1.0℃递减)20秒、和72℃4分30秒的循环，然后是25个98℃10秒、56℃20秒和72℃4分30秒的循环，最后于72℃延伸10分钟。用2％琼脂糖e
‑
凝胶分离pcr产物，并且使用qiagen dna纯化试剂盒
tm
(qiagen,germantown,md)纯化。克隆纯化的扩增子，并且通过eurofins mwg operon(huntsville,al)测序。
[0153]
由于ppr基因含有许多重复序列，从设计为分离ppr基因的几个引物组仅获得了几个pcr产物。用sequencher 4.10.1
tm
软件(gene codes,ann arbor,mi)比对cms
‑
s和恢复系的pcr产物的序列。在比对的序列中鉴定变异，并且设计kaspar
tm
测定来检测这些变异。表5中显示了亲本系4xp811
‑
d和lh60之间多态性的6个snp标志物。
[0154]
表5：从几个ppr基因开发的多态性标志物
[0155][0156]
使用f2定位群体4xp811
‑
d x lh60，用joinmap 4.0软件定位上述6个多态性标志物。此群体主要被用来鉴定rf3恢复基因在染色体2的长臂上的位置。图谱含有133个标志物，均匀分布在全玉米基因组上，并且qtl是明确限定并得到确认的。6个标志物ppr1_p5_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、ppr8_p6
‑
1和ppr3_p4_2被定位到峰区中，它们具有定位的qtl(长度为1.3mb)中最高的lod得分。
[0157]
实施例9：全基因组测序和序列特异性标志物开发
[0158]
为了进一步鉴定特异性rf3恢复基因序列和导致细胞质雄性不育的rf3突变的基因序列，使用了全基因组测序策略。使用两个cms
‑
s品系4xp811
‑
d和7sh382ms，和两个恢复系lh60和mbb56进行测序分析。
[0159]
在比较测序基因组区与来自玉蜀黍栽培种b73的参照基因组(可在maize gdb访问)的注释序列后，在染色体2上的1.3mb基因组区间内鉴定了总共10个ppr基因(顺序注释为ppr 1
‑
10)。与ppr2对应的全长编码序列不存在于注释的b73基因组中，并且无法被预测为全长功能性基因。结果，通过与玉蜀黍栽培种mo17的参照基因组(可在maize gdb访问)的序列比较获得了ppr2的全基因序列。基于两个cms
‑
s品系和两个恢复系的全基因组测序数据装配10个ppr基因的所得的序列(ppr2具有两个序列，一个序列来自品系b73，第二个序列来自品系mo17)，以提供参照序列信息。
[0160]
接下来，在cms
‑
s系、恢复系、和参照基因组序列之间比对所有ppr基因序列。从ppr基因的基因组序列比对鉴定任何基因组序列变异并记录。
[0161]
基于10个ppr基因区段的序列，设计58个pcr引物对，并且用它们筛选cms
‑
s和恢复系。仅4个来自ppr2的引物组(表6)显示了多态性，提示了ppr2与育性恢复有关。
[0162]
基于ppr2基因内的变异，建立了21个kaspar
tm
测定，并且对bc1定位群体进行筛选，三个测定显示了亲本系之间的多态性(表6)。
[0163]
表6：来自ppr2基因的多态性分子标志物
[0164][0165]
实施例10：ppr2基因特异性标志物在连锁图上与rf3共分离
[0166]
用482个snp标志物(其在全基因组上均匀分布)使用kaspar
tm
测定对bc1定位群体进行基因型分型。使用437个标志物(包括4个来自ppr2的基于pcr的标志物、432个全基因组内的snp标志物、和1个基于bc1定位群体的不育
‑
能育表型的标志物)用joinmap 4.0
tm
软件创建遗传连锁。凭借遗传连锁图、表型数据和基因型数据，使用mapqtl 6.0
tm
软件(kyazma b.v.,netherlands)实施了全基因组qtl分析。结果显示，所有ppr2基因特异性标志物(表5和6)与177.08cm遗传位置处的rf3基因座共分离，lod为99.99，并且解释100％的表型变异。
[0167]
实施例11：推定的rf3候选突变和通过实时pcr对编码ppr2蛋白的基因的表达分析
[0168]
为了验证rf3
‑
ppr2蛋白的表达是否与cms
‑
s玉米的育性恢复相关联，实施实时pcr(rt
‑
pcr)以定量测定能育植物中的rf3
‑
ppr2基因和cms植物中的rf3
‑
ppr2基因的表达模式。基于含有在rf3
‑
ppr2蛋白编码基因中具有变异的氨基酸的多核苷酸序列的部分设计了几个特异性引物对和探针。从下述来源提取总rna：两个品系4xp811
‑
d(细胞质雄性不育)和lh60(恢复系)，在长臂染色体2的1.3mb区方面分离的源自f2穗的f3个体，和三个商品化玉米品系。
[0169]
要接受测定分析的植物培植在温室中。从7周(即将抽穗前)和10周龄的植物(授粉后)收集叶组织。还收集了具有形成中的花药/花粉和散布的花粉(在能育植物中)的雄花穗组织。使用qiagen rneasy plant mini kit
tm
提取总rna，并且使用qiagen quantitect reverse transcription kit
tm
(qiagen,carlsbad,ca)合成cdna。通过与玉米内部对照基因延长因子α
‑
1(efα1)比较来定量表达水平。(czechowski t,等,plant physiol.,sep；139(1):5
‑
17,2005)。针对rf3
‑
ppr2和efα1的引物、以及具有fam或vic染料和minor groove binding non fluorescence quencher
tm
i(mgbnfq)淬灭剂的双重标记探针均由applied biosystems(foster city,ca)合成。使用基因型分型主预混物(applied biosystems,foster city,ca)设立10μl pcr反应，并且在roche lightcycler 480
tm
热循环仪(roche,indianapolis,in)上进行pcr。pcr程序以在95℃对taq酶的10分钟活化开始，接下来是50个95℃10秒和58℃38秒的循环。在每个循环结束时记录荧光信号。使用delta delta ct法计算rf3
‑
ppr2相对于efα1的表达水平。
[0170]
根据导致rf3
‑
ppr2基因内的氨基酸改变的突变设计了7个测定。仅有dascms
‑
srf39测定扩增了分别对应于能育恢复系和细胞质雄性不育系中rf3或rf3基因序列的存在的扩增子(表7)。此测定成功鉴定了一个导致rf3细胞质雄性不育表型的单突变。
id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0184]
5.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0185]
6.实施方案1至5中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0186]
7.实施方案1至6中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0187]
8.实施方案1至7中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85和其任何组合。
[0188]
9.实施方案1至8中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在8.3mb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0189]
10.实施方案1至8中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在.5mb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0190]
11.实施方案1至8中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在100kb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0191]
12.实施方案1至11中任一项的方法，其中所述植物是玉米植物。
[0192]
13.实施方案12的方法，其中所述玉米植物属于坚杆杂种优势组。
[0193]
14.实施方案1至13中任一项的方法，其中所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因是rf3基因(seq id no:92)。
[0194]
15.一种通过实施方案1至14中任一项的方法获得的玉米植物。
[0195]
16.实施方案1至14中任一项的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
[0196]
(e)获得包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的植物；
[0197]
(f)将该包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的植物与第二植物杂交以产生一个或多个后代植物；
[0198]
(g)对该后代植物评估至少一种标志物核酸，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；和
[0199]
(h)选择包含所述至少一个标志物核酸的所述后代植物，该标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因。
[0200]
17.一种恢复s型细胞质雄性不育植物的后代中的育性的方法，所述方法包括以下步骤：
[0201]
(a)杂交雌性植物与雄性植物以产生后代植物的群体，
[0202]
其中所述雌性植物是s型细胞质雄性不育植物，并且
[0203]
其中所述雄性植物具备针对s型细胞质雄性不育的功能恢复基因；
[0204]
(b)筛选该后代植物的群体以鉴定包含至少一种标志物核酸的能育后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；
[0205]
(c)选择包含至少一种标志物核酸的所述能育后代植物，所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因；和
[0206]
(d)繁殖该能育后代植物，其中该能育后代植物包含所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因。
[0207]
18.实施方案17的方法，其中所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因的单元型。
[0208]
19.实施方案17或实施方案18的方法，其中所述标志物核酸选自下组：mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
‑
1318、pze
‑
102182167、pze
‑
102182672、pze
‑
102182718、pze
‑
102183578、pze
‑
102183795、das
‑
pz
‑
13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0209]
20.实施方案17至19中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0210]
21.实施方案17至20中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0211]
22.实施方案17至21中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0212]
23.实施方案17至22中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0213]
24.实施方案17至23中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0214]
25.实施方案17至24中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在8.3mb内与所述
针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0215]
26.实施方案17至24中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在.5mb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0216]
27.实施方案17至24中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在100kb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0217]
28.实施方案17至27中任一项的方法，所述方法进一步包括将rf3基因(seq id no:92)引入所述雄性植物中。
[0218]
29.实施方案28的方法，其中所述引入选自下组：转化、杂交、回交、同源重组、和诱变。
[0219]
30.实施方案17至29中任一项的方法，其中所述植物是玉米植物。
[0220]
31.实施方案30的方法，其中所述玉米植物属于坚杆杂种优势组。
[0221]
32.实施方案17至31中任一项的方法，所述方法进一步包括以下步骤：
[0222]
‑
从所述后代植物的群体分离核酸分子；
[0223]
‑
使分离的核酸分子与一组寡核苷酸接触；并且
[0224]
‑
扩增所述分离的核酸分子和所述寡核苷酸以生成扩增子，其中所述扩增子包含指示所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因的存在的可检测信号。
[0225]
33.一种用于将rf3基因转移到后代植物中的方法，所述方法包括以下步骤：
[0226]
(a)杂交第一亲本植物和第二亲本植物以生成后代植物，其中至少一种亲本植物包含所述rf3基因；
[0227]
(b)对所述后代植物分析至少一种与所述rf3基因连锁的标志物的存在，以获得rf3后代植物；
[0228]
(c)将所述rf3后代植物与所述第一亲本植物或所述第二亲本植物回交，以生成下一代后代植物；和
[0229]
(d)对所述下一代后代植物分析至少一种与所述rf3基因连锁的标志物的存在，以获得rf3下一代后代植物。
[0230]
34.实施方案33的方法，其中所述标志物核酸包含与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因连锁的等位基因的单元型。
[0231]
35.实施方案33或实施方案34的方法，其中所述标志物核酸选自下组：mo17
‑
14388、pze
‑
102180901、pze
‑
102180129、fg
‑
1318、pze
‑
102182167、pze
‑
102182672、pze
‑
102182718、pze
‑
102183578、pze
‑
102183795、das
‑
pz
‑
13844、pze
‑
102184593、ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0232]
36.实施方案33至35中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0233]
37.实施方案33至36中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：ppr1_p5_1、ppr3_p4_2、ppr8_p6_1、ppr3
‑
5、ppr3
‑
7、ppr3
‑
9、cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0234]
38.实施方案33至37中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:45、seq id no:46、seq id no:47、seq id no:48、seq id no:49、seq id no:50、seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0235]
39.实施方案33至38中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：cmss03、cmss10、cmss15、cmss34、dascms
‑
srf31、dascms
‑
srf34、dascms
‑
srf321、dascms
‑
srf39、和其任何组合。
[0236]
40.实施方案33至39中任一项的方法，其中所述标志物核酸选自下组：seq id no:69、seq id no:70、seq id no:71、seq id no:72、seq id no:73、seq id no:74、seq id no:75、seq id no:76、seq id no:77、seq id no:78、seq id no:79、seq id no:80、seq id no:81、seq id no:82、seq id no:83、seq id no:84、seq id no:85、和其任何组合。
[0237]
41.实施方案33至40中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在8.3mb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0238]
42.实施方案33至40中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在.5mb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0239]
43.实施方案33至40中任一项的方法，其中至少一种所述标志物在100kb内与所述针对玉米s型细胞质雄性不育的功能恢复基因相伴随。
[0240]
44.实施方案33至43中任一项的方法，其中所述植物是玉米植物。
[0241]
45.实施方案44的方法，其中所述玉米植物属于坚杆杂种优势组。
[0242]
46.实施方案33至45中任一项的方法，其中所述rf3基因是seq id no:92。