利用CAS9核糖核蛋白来产生敲除的原代和扩增的人NK细胞的制作方法

利用cas9核糖核蛋白来产生敲除的原代和扩增的人nk细胞


背景技术：

1.近年来，癌症免疫疗法有所发展。基因修饰的嵌合抗原受体(car)t细胞是成功地应用于癌症免疫疗法中的工程改造的免疫细胞的极好的示例。这些细胞最近被fda批准用于治疗cd19 b细胞恶性肿瘤，但迄今为止成功仅限于携带少量可靶向抗原的疾病，并且靶向此类有限的抗原储库容易因免疫逃逸而失败。此外，由于同种异体t细胞引起的移植物抗宿主病的风险，car t细胞一直专注于自体t细胞的使用。相比之下，nk细胞能够以抗原独立的方式杀死肿瘤靶点，并且不会引起gvhd，这使得它们成为癌症免疫疗法的良好候选者。
2.crispr/cas9技术最近已经被用于工程改造免疫细胞，但用质粒对nk细胞进行基因重编程一直是一项挑战。这是由于以dna依赖性方式进行转基因递送(诸如慢病毒和逆转录病毒转导，其导致大量程序相关的nk细胞凋亡)的困难和基因工程改造的nk细胞的有限产生。需要的是基因工程改造nk细胞的新方法。


技术实现要素：

3.公开了与基因修饰的nk细胞相关的方法和组合物。
4.在一个方面中，本文公开了对nk细胞(诸如，例如原代nk细胞或扩增的nk细胞)进行基因修饰的方法，包含获得对在nk细胞中的靶dna序列具有特异性的导向rna(grna)(诸如，例如转化生长因子
‑
β受体2(tgfbr2)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hprt1))；以及b)通过电穿孔将核糖核蛋白(rnp)复合物引入到靶nk细胞中，该复合物包含与对应的crispr/cas导向rna复合的2类crispr/cas核酸内切酶(cas9)，该导向rna与nk细胞的基因组dna内的靶序列杂交。
5.本文还公开了任何前述方面的方法，其中nk细胞的基因组通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源dna片段(例如供体多核苷酸)的插入、通过内源dna片段的缺失、通过内源dna片段的倒位或易位或其组合来修饰。
6.在一个方面中，本文公开了对任何前述方面的nk细胞进行基因修饰的方法，其中在转导(诸如电穿孔)之前，将nk细胞(例如原代或扩增的nk细胞)在il
‑
2和/或经辐照的饲养细胞的存在下孵育4、5、6或7天。
7.本文还公开了对任何前述方面的nk细胞进行基因修饰的方法，进一步包含在电穿孔后，用经辐照的膜结合的表达白介素
‑
21(mbil
‑
21)的饲养细胞扩增经修饰的nk细胞。
8.在一个方面中，本文公开了通过任何前述方面的方法制备的修饰的nk细胞。在一个方面中，修饰的nk细胞可以包含编码转化生长因子β受体2(tgfbr2)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hprt1)的基因的敲除。
9.本文还公开了治疗癌症的方法，包含向患有癌症的受试者施用任何前述方面的经修饰的nk细胞。
10.在一个方面中，本文公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的nk细胞的方法，所述方法包含a)获得待修饰的靶nk细胞(诸如原代nk细胞或扩增的nk细胞)；b)获得对靶dna序列具有特异性的grna；c)通过电穿孔将rnp复合物引入到靶nk细胞中，所述rnp复合
物包含与对应的crispr/cas grna复合的2类crispr/cas核酸内切酶(cas9)，所述crispr/cas grna与靶nk细胞的基因组dna内的靶序列杂交，产生工程改造的nk细胞；以及d)将工程改造的nk细胞转移到受试者体内。
11.本文还公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的nk细胞的方法，其中nk细胞是已经离体修饰并在修饰后转移至受试者的原代nk细胞(诸如，例如，自体nk细胞，或来自同种异体供体来源的nk细胞)。
12.在一个方面中，本文公开了向任何前述方面的有此需要的受试者过继转移工程改造的nk细胞的方法，其中在向受试者施用所述经修饰的nk细胞之前、同时或之后，用经辐照的表达mbil
‑
21的饲养细胞或施用il
‑
21来扩增所述nk细胞。
13.在一个方面中，本文公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的nk细胞的方法，其中接受过继转移的修饰的nk细胞的受试者患有癌症。
附图说明
14.被并入本说明书中并构成本说明书的一部分的附图示出了若干个实施例，并与说明书一起示出了所公开的组合物和方法。
15.图1示出了使用en
‑
138程序在nk细胞中表达gfp的sirna和质粒dna的电穿孔效率。如此处所示，nk细胞存活率为77.5％，并且35％的活细胞为gfp阳性。
16.图2示出了针对电穿孔优化测试的16个程序(dn
‑
100)中另一个程序的可行性和效率。
17.图3示出了通过t7e1突变测定测量的扩增的nk细胞(a)和原代nk细胞(b)中cas9/rnp介导的tgfbr2敲除。t7e1酶识别并切割错配的dna。每个小条带(蓝色箭头)代表携带indel的消化的dna片段。
18.图4示出了通过t7e1突变测定测量的扩增的nk细胞中cas9/rnp介导的hprt破坏。
19.图5示出了使用rt
‑
pcr在由cas9/rnp(grna1 grna2)引入的crispr修饰的nk细胞中的tgfbr2胞外域的mrna表达水平。gapdh被用作内源对照基因。rna水平的降低表明tgfbr2基因的破坏。
20.图6a示出了cas9/rnp修饰的(grna1 grna2、grna2和grna3)细胞的细胞毒性测定，表明细胞与tgfb一起孵育过夜不会显著地降低其裂解daoy细胞的能力。
21.图6b显示，当与未修饰的nk细胞相比时，cas9/rnp修饰的细胞(grna2和grna3)对tgfb不太敏感。
22.图7示出了socs3基因的外显子2和用于靶向socs3基因的外显子2的grna。
23.图8示出了与野生型nk相比，敲除的nk细胞中socs3的相对归一化表达水平。
24.图9a、9b、9c和9d示出了socs3
‑
ko nk细胞的更好的扩增和细胞毒性。图9a示出了socs3
‑
ko nk细胞针对aml的incucyte结果。图9b和9c示出了来自3名供体针对daoy细胞(9b)和神经母细胞瘤细胞系nb1643(9c)的细胞毒性结果。图9d示出了对于图9b和9c中的每个细胞系和处理条件的实际死亡细胞数。
25.图10示出了增殖分析，其示出了socs3 ko对nk细胞扩增的影响。
26.图11示出了野生型和cd38敲除的nk细胞上的cd38表达。
27.图12示出了对达雷木单抗介导的自相残杀的耐药性。
28.图13示出了cas9/rnp平台成功地靶向nk细胞中的aavs1基因座。
29.图14示出了使用pcr评估mcherry报告基因在人原代nk细胞的aavs1基因座中的整合。
30.图15示出了使用流式细胞术和荧光显微镜研究扩增和分选后mcherry的稳定基因表达。*结果代表12个设计的aav构建体中的2个。
31.图16示出了使用流式细胞术评估使用不同培养条件的人原代nk细胞扩增和分选后mcherry的稳定基因表达。原代nk细胞用cas9/rnp电穿孔，并且用aav6ss800
‑
mcherry的300k moi转导，并在rpmi培养基 胎牛血清(fbs)或无血清aimv培养基中培养。
具体实施方式
32.在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另有说明，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或者除非另有说明，否则不限于特定的试剂，因为它们当然可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅仅是为了描述特定的实施例的目的，而不旨在是限制性的。
33.a.定义
34.如在说明书和所附的权利要求书中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文中另有明确规定。因此，例如，提及“药物载体”包括两种或更多种此类载体的混合物等。
35.范围在本文可以表示为从“约”一个特定值，和/或到“约”另一个特定值。当表达此类范围时，另一个实施例包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解特定值形成另一个实施例。将进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且独立于另一个端点。还应当理解，本文存在所公开的多个值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果值“10”被公开，则“约10”也被公开。还应当理解，当公开值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围，如本领域技术人员适当理解的。例如，如果值“10”被公开，则“小于或等于10”以及“大于或等于10”也被公开。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起点，以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于以及等于10和15以及10和15之间认为被公开。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13和14。
36.在本说明书中和在所附的权利要求中，将参考多个术语，这些术语将被定义为具有以下含义：
[0037]“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生的情况和其中所述事件或情况不发生的情况。
[0038]“引物”是探针的子集，所述探针能够支持某种类型的酶促操作，并且可以与靶核酸杂交，使得酶促操作可以发生。引物可以由本领域中可获得的不干扰酶促操作的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。
[0039]“探针”是通常能够以序列特异性的方式例如通过杂交与靶核酸相互作用的分子。核酸的杂交在本领域中被很好地理解并在本文中讨论。通常，探针可以由本领域中可获得
的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制成。
[0040]“编码”特定rna的dna序列是转录成rna的dna核酸序列。dna多核苷酸可以编码翻译成蛋白质的rna(mrna)(并且因此dna和mrna都编码蛋白质)，或者dna多核苷酸可以编码未翻译成蛋白质的rna(例如trna、rrna、microrna(mirna)、“非编码”rna(ncrna)、导向rna等)。
[0041]“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是一种核酸序列，当置于适当的调节序列控制下时，该核酸序列在体外或体内被转录成mrna(在dna的情况下)，并被翻译成多肽(在mrna的情况下)。编码序列的边界由5’末端(n
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末端)的起始密码子和3’末端(c
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末端)的翻译终止无义密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自原核或真核mrna的cdna，来自原核或真核dna的基因组dna序列以及合成核酸。转录终止序列通常将位于编码序列的3’。
[0042]
如本文所使用的术语“天然存在的”或“未修饰的”或“野生型”，当应用于核酸、多肽、细胞或生物体时，是指在自然界中发现的核酸、多肽、细胞或生物体。例如，存在于生物体(包括病毒)中的，可以从自然界中的来源分离出来并且在实验室中尚未被人类有意修饰的多肽或多核苷酸序列是野生型的(并且是天然存在的)。
[0043]
向受试者的“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道，通过吸入、通过植入的储器、肠胃外(例如皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等”。如本文所使用的“并行施用(concurrent administration)”、“联合施用”、“同时施用(simultaneous administration)”或“同时地施用(administered simultaneously)”是指化合物在相同的时间点或基本上紧接着彼此施用。在后一种情况下，两种化合物以足够接近的时间施用，以至于观察到的结果与当在相同时间点施用化合物时获得的结果难以区分。“全身给药”是指经由将药剂引入或递送至受试者身体的广泛区域(例如，大于身体的50％)的途径将药剂引入或递送至受试者，例如通过进入循环或淋巴系统。相比之下，“局部给药”是指通过将药剂引入或递送至紧邻施用点的一个或多个区域且不全身性以治疗有效量引入药剂的途径将药剂引入或递送至受试者。例如，局部施用的药剂在施用点的局部附近容易检测到，但在受试者身体的远端部分检测不到或以可忽略的量检测到。施用包括自我施用和由他人施用。
[0044]
药剂的“有效量”是指足以提供所需效果的药剂的量。“有效”的药剂的量因受试者而异，这取决于多种因素，诸如受试者的年龄和一般状况、特定的一种或多种药剂等。因此，并不总是可以指定量化的“有效量”。然而，任何受试者病例中的适当“有效量”可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。此外，如本文所使用的并且除非另有特别说明，否则药剂的“有效量”还可以指覆盖治疗有效量和预防有效量的量。达到治疗效果所需的药剂的“有效量”可以根据诸如受试者的年龄、性别和体重等的因素而变化。可以调整给药方案，以提供最佳的治疗响应。例如，可以每日施用若干分开的剂量，或者可以如由治疗情况的紧急程度所指示的按比例地减少剂量。
[0045]“药学上可接受的”组分可以指不是生物学上或以其他方式不期望的组分，即该组分可以被掺入本发明的药物制剂中并如本文所述施用给受试者而不引起显著的不期望的
生物学效应或不以有害的方式与包含它的制剂的任何其他组分相互作用。当用于指向人体施用时，该术语通常意味着该组分已经满足毒理学和生产测试的要求标准，或者其包含在美国食品和药物管理局编写的《非活性成分指南》中。
[0046]“药学上可接受的载体”(有时被称为“载体”)是指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括对于兽医和/或人类药物或治疗用途可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所使用的，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于药物制剂的其他材料，如本文进一步所描述的。
[0047]“药理学活性的”(或简称“活性的”)，如在“药理学活性的”衍生物或类似物中，可以指具有与母体化合物相同类型的药理学活性且在程度上近似相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
[0048]“治疗剂”是指具有有益的生物学效应的任何组合物。有益的生物学效应包括治疗效应，例如治疗障碍或其他不期望的生理状况；以及预防效应，例如预防障碍或其他不期望的生理状况(例如非免疫原性癌症)。该术语还包括本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，然后，或者当具体地鉴定特定的药剂时，应理解该术语包括药剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
[0049]
组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效地实现所需的治疗结果的量。在一些实施例中，期望的治疗结果是控制i型糖尿病。在一些实施例中，期望的治疗结果是控制肥胖。给定治疗剂的治疗有效量通常将关于诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重性以及受试者的年龄、性别和体重等的因素而变化。该术语还可以指治疗剂的量，或治疗剂的递送速率(例如，随时间的量)，其有效促进期望的治疗效果，诸如疼痛减轻。精确的所需治疗效果将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗剂的效力、制剂中药剂的浓度等)以及本领域普通技术人员所理解的多种其他因素而变化。在一些情况下，在数天、数周或数年的时间内向受试者施用多剂量组合物之后实现所需的生物或医学应答。
[0050]
在整个本技术中，参考了各种出版物。这些出版物的全部公开内容在此通过引用整体并入本技术中，以便更充分地描述本技术所属领域的现状。所公开的参考文献还单独地且具体地通过引用并入本文，用于在依赖该参考文献的句子中所讨论的包含在其中的材料。
[0051]
b.基因修饰nk细胞的方法
[0052]
使用质粒对nk细胞进行基因重编程一直具有挑战性，因为难以以dna依赖性方式进行转基因递送(例如慢病毒和逆转录病毒转导，其导致大量程序相关的nk细胞凋亡)以及基因工程改造的nk细胞的产量有限。本文描述了用于使用原代和扩增的人nk细胞的无dna基因组编辑的方法，所述方法利用核酸内切酶核糖核蛋白复合物(诸如例如，cas9/rnp)来重编程(即，工程改造或修饰)nk细胞。
[0053]
核酸内切酶/rnp(例如，cas9/rnp)由三种组分组成，即与crispr基因座复合的重
组核酸内切酶蛋白(例如，cas9核酸内切酶)。与crispr基因座复合的核酸内切酶可以被称为crispr/cas导向rna。crispr基因座包含合成的单导向rna(grna)，该单导向rna(grna)包含可以与靶序列复合互补重复rna(crrna)和反式互补重复rna(tracrrna)杂交的rna。因此，crispr/cas导向rna与细胞的基因组dna中的靶序列杂交。在一些情况下，2类crispr/cas核酸内切酶是ii型crispr/cas核酸内切酶。在一些情况下，2类crispr/cas核酸内切酶为cas9多肽，并且对应的crispr/cas导向rna为cas9导向rna。与外源dna依赖性方法相比，这些cas9/rnp能够以更高的效率切割基因组靶，这是因为它们以功能复合物的形式递送。此外，从细胞中快速清除cas9/rnp可以减少脱靶效应，诸如诱导凋亡。因此，在一个方面中，本文公开了对nk细胞进行基因修饰的方法，包含获得对nk细胞中的靶dna序列具有特异性的导向rna(grna)；以及b)将核糖核蛋白(rnp)复合物转导(例如，通过电穿孔引入)到靶nk细胞中，所述核糖核蛋白复合物包含与对应的crispr/cas导向rna复合的2类crispr/cas内切核酸酶(cas9)，所述crispr/cas导向rna与nk细胞的基因组dna内的靶序列杂交。
[0054]
应当理解并且在本文中预期，为了将cas9核酸酶活性靶向靶位点并且还切割供体质粒以允许供体转基因重组到宿主dna中，使用了crispr rna(crrna)。在一些情况下，crrna与tracrrna结合以形成导向rna(grna)。所公开的质粒使用人染色体19上的蛋白磷酸酶1调节亚基12c(ppp1r12c)基因的内含子1的aav整合(其被称为aavs1)作为用于整合转基因的靶位点。该基因座是“安全港基因”，并且允许在多种细胞类型中稳定、长期的转基因表达。由于ppp1r12c的破坏与任何已知的疾病无关，因此aavs1基因座通常被认为是用于转基因靶向的安全港。由于aavs1位点被用作靶位置，因此crspr rna(crrna)必须靶向所述dna。在本文中，在所公开的质粒中使用的导向rna包含ggggccactagggacaggat(seq id no：9)或其任何10个核苷酸的有义或反义连续片段。虽然aavs1在本文中用于示例性目的，但应理解并且在本文中预期，考虑到被转染的特定细胞类型或转基因，其他“安全港基因”可以以同等的结果使用，并且如果更合适，可以替代aavs1。其他安全港基因的实例包括但不限于c
‑
c趋化因子受体5型(ccr5)、rosa26基因座和trac。
[0055]
应当理解并且在本文中预期，对递送至靶基因组的供体转基因构建体大小可以有大小限制。增加转基因的允许大小的一种方法是通过交换通常用于合成的cas9的化脓性链球菌cas9(spcas9)或来自不同细菌来源的cas9来形成额外的空间。cas9的替代也可以用于增加靶向特异性，因此需要使用较少的grna。因此，例如，cas9可以来源于金黄色葡萄球菌(sacas9)、氨基酸球菌属(ascpf1)、毛螺旋菌(lachnospiracase bacterium)(lbcpf1)、脑膜炎奈瑟菌(nmcas9)、嗜热链球菌(stcas9)、空肠弯曲菌(cjcas9)、增强型spcas9(espcas9)、spcas9
‑
hf1、fokl融合的dcas9、扩增的cas9(xcas9)和/或催化死亡的cas9(dcas9)。
[0056]
应当理解并且在本文中预期，特定cas9的使用可以改变cas9核酸内切酶(或替代酶)用于筛选靶的pam序列。如本文所使用的，合适的pam序列包含ngg(spcas9 pam)nngrrt(sacas9 pam)nnnngatt(nmcas9 pam)、nnnnryac(cjcas9 pam)、nnagaaw(st)、tttv(lbcpf1 pam和ascpf1 pam)；tycv(lbcpf1 pam变体和ascpf1 pam变体)；其中n可以是任何核苷酸；v＝a、c或g；y＝c或t；w＝a或t；并且r＝a或g。
[0057]
为了制备rnp复合物，在95c下，可以将crrna和tracrrna以在约50μm与约500μm之间(例如，50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、35、375、400、
425、450、475或500μm)，优选地在100μm与约300μm之间，更优选地约200μm的1∶1、2∶1或1∶2的浓度比混合约5min以形成crrna：tracrrna复合物(即，导向rna)。然后可以将crrna：tracrrna复合物与在约20μm与约50μm之间(例如21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、4748、49或50μm)的cas核酸内切酶(诸如例如cas9)的最终稀释液混合。
[0058]
一旦与靶细胞中的靶序列结合，crispr基因座可以通过在靶dna中引入一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源dna片段(例如供体多核苷酸)的插入、通过内源dna片段的缺失、通过内源dna片段的倒位或易位或其组合来修饰基因组。因此，当与dna结合用于同源重组时，所公开的方法可以用于产生敲除或敲入。本文显示通过cas9/rnp的电穿孔的转导是一种克服nk细胞中基因修饰的先前限制的简单且相对有效的方法。
[0059]
应当理解并且在本文中预期，所公开的方法可以用于任何细胞类型，包括自然杀伤细胞(nk细胞)、t细胞、b细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞。人nk细胞是外周血淋巴细胞的子集，其由cd56或cd16的表达和t细胞受体(cd3)的缺失来定义。nk细胞感应并杀死缺乏主要组织相容性复合物(mhc)
‑
i类分子的靶细胞。nk细胞激活受体除其他外包括天然细胞毒性受体(nkp30、nkp44和nkp46)以及凝集素样受体nkg2d和dnam
‑
1。它们的配体在应激的细胞、转化的细胞或感染的细胞上表达，但在正常细胞上不表达，使正常细胞对nk细胞杀伤具有抗性。nk细胞激活通过抑制性受体被负调控，所述抑制性受体为诸如杀伤免疫球蛋白(ig)
‑
样受体(kir)、nkg2a/cd94、tgfβ和白细胞ig
‑
样受体
‑
1(lir
‑
1)。在一个方面中，靶细胞可以是来自供体来源(诸如，例如用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即修饰的nk细胞的最终受体))的原代nk细胞，nk细胞系(包括但不限于nk rpmi8866；hfwt、k562和ebv
‑
lcl)，或者来自扩增的nk细胞的来源，所述扩增的nk细胞衍生自原代nk细胞源或nk细胞系。
[0060]
在nk细胞的转导之前，可以在适合于nk细胞增殖的培养基中孵育nk细胞。应当理解并且在本文中预期，培养条件可以包含添加细胞因子、抗体和/或饲养细胞。因此，在一个方面中，本文公开了对nk细胞进行基因修饰的方法，进一步包含在转导细胞之前在支持nk细胞增殖的培养基中孵育nk细胞1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天；其中所述培养基进一步包含细胞因子、抗体和/或饲养细胞。例如，培养基可以包含il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18和/或il
‑
21。在一个方面中，培养基还可以包含抗cd3抗体。在一个方面中，可以从刺激nk细胞的饲养细胞中纯化饲养细胞。本文公开的用于所要求保护的发明的nk细胞刺激饲养细胞可以是经辐照的自体或同种异体外周血单核细胞(pbmc)或未辐照的自体或pbmc；rpmi8866；hfwt，k562；用膜结合的il
‑
15和41bbl或il
‑
21或其任意组合转染的k562细胞；或ebv
‑
lcl。在一些方面，nk细胞饲养细胞与il
‑
21、il
‑
15和/或41bbl的溶液联合提供。饲养细胞可以以1∶2、1∶1或2∶1的比率接种到nk细胞的培养物中。应当理解并且在本文中预期，培养期可以是电穿孔后1至14天之间(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)，优选地在3至7天之间，最优选地在4至6天之间。
[0061]
应当理解并且在本文中预期，用于原代nk细胞和扩增的nk细胞的孵育条件可以不同。在一个方面中，电穿孔前原代nk细胞的培养包含少于5天(例如1、2、3或4天)的培养基和细胞因子(诸如，例如il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18和/或il
‑
21)和/或抗cd3抗体。对于扩增的nk细胞，除了或代替细胞因子(诸如，例如il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18和/或il
‑
21)和/或抗
cd3抗体，可以在nk饲养细胞(例如，比率为1∶1)的存在下进行培养。扩增的nk细胞的培养可以在转导前1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天进行。因此，在一个方面中，本文公开了对nk细胞进行基因修饰的方法，包含在电穿孔前在il
‑
2的存在下孵育原代nk细胞4天，或者在电穿孔前在经辐照的饲养细胞的存在下孵育扩增的nk细胞6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、30、36、42、48、54、60小时、3、4、5、6或7天。
[0062]
应当理解并且在本文中预期，在所公开的方法中修饰nk细胞的转导方法受到限制。由于其免疫功能，nk细胞对病毒和细菌载体以及所述载体对nk细胞凋亡的诱导具有抗性。因此，在本方法之前，对nk细胞的crispr/cas修饰是不成功的。为了避免病毒载体的问题，所公开的方法使用电穿孔来转化靶nk细胞。电穿孔是一种向细胞施加电场以增加细胞膜的渗透性的技术。电场的施加引起跨过膜的电荷梯度，其将带电的分子(诸如核酸)吸引跨过细胞膜。因此，在一个方面中，本文公开了对nk细胞进行基因修饰的方法，包含获得对nk细胞中的靶dna序列具有特异性的导向rna(grna)；以及b)通过电穿孔将核糖核蛋白(rnp)复合物引入到靶nk细胞中，所述核糖核蛋白复合物包含与对应的crispr/cas导向rna复合的2类crispr/cas核酸内切酶(cas9)，所述crispr/cas导向rna与nk细胞的基因组dna内的靶序列杂交。
[0063]
在nk细胞的转导(例如电穿孔)之后，现在修饰的nk细胞可以在包含刺激修饰的nk细胞的饲养细胞的培养基中繁殖。因此，修饰的细胞保持了生存力和增殖潜力，因为它们能够在电穿孔后使用经辐照的饲养细胞进行扩增。本文公开的用于要求保护的本发明的nk细胞刺激饲养细胞可以是辐照的自体或同种异体外周血单核细胞(pbmc)，或者未辐照的自体或pbmc；rpmi8866；hfwt，k562；用膜结合的il
‑
15和41bbl或il
‑
21或其任意组合转染的k562细胞；或者ebv
‑
lcl。在一些方面中，nk细胞饲养细胞与il
‑
21、il
‑
15和/或41bbl的溶液组合提供。饲养细胞可以以1∶2、1∶1或2∶1的比率接种在nk细胞的培养物中。应该理解并且在本文中预期，培养期可以是在电穿孔后1至14天之间(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)，优选地在3至7天之间，最优选地在4至6天之间。在一些方面中，用于培养经修饰的nk细胞的培养基可以进一步包含细胞因子，诸如，例如il
‑
2、il
‑
12、il
‑
15、il
‑
18和/或il
‑
21。
[0064]
在一个方面中，应当理解并且在本文中预期，所公开的对nk细胞进行基因修饰的方法的一个目标是产生经修饰的nk细胞。因此，本文公开了通过所公开的方法制备的修饰的nk细胞。
[0065]
如上所述，nk细胞激活通过抑制性受体被负调节，所述抑制性受体为诸如杀伤免疫球蛋白(ig)样受体(kirs)、nkg2a/cd94、tgfβ和白细胞ig样受体
‑
1(lir
‑
1)。一种抑制性受体的参与可能足以防止靶细胞裂解。因此，nk细胞有效地靶向表达多个应激诱导配体和少数mhc i类配体的细胞。tgfβ是一种主要的免疫抑制细胞因子，其抑制nk细胞的活化和功能。因此，应当理解并且在本文中预期，nk细胞的一种有利的修饰是抑制抑制性受体，诸如杀伤免疫球蛋白(ig)样受体(kirs)、nkg2a/cd94、tgfβ和白细胞ig样受体
‑
1(lir
‑
1)，从而将抑制nk细胞的负调节。此类修饰的细胞在任何可以通过添加nk细胞来治疗的疾病或病症的免疫疗法中将是非常有用的。因此，在一个方面中，本文公开了基因修饰的nk细胞，其包含编码转化生长因子β受体2(tgfbr2)或次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hprt1)的基因的敲除。
[0066]
如在整个本公开中所述，所公开的修饰的nk细胞理想地适用于免疫疗法，诸如将修饰的(即，工程改造的)nk细胞过继转移至有此需要的受试者。因此，在一个方面中，本文
公开了向有此需要的受试者过继转移工程改造的nk细胞的方法，所述方法包含a)获得待修饰的靶nk细胞；b)获得对靶dna序列具有特异性的grna；c)通过电穿孔将rnp复合物引入到靶nk细胞中，所述rnp复合物包含与对应的crispr/cas grna复合的2类crispr/cas核酸内切酶(cas9)，所述crispr/cas grna与靶nk细胞的基因组dna内的靶序列杂交，产生工程改造的nk细胞；以及d)将工程改造的nk细胞转移到受试者体内。
[0067]
在一个方面中，在所公开的免疫治疗方法中使用的修饰的nk细胞可以是来自供体来源(诸如，例如，用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即，修饰的nk细胞的最终受体))的原代nk细胞、nk细胞系(包括但不限于nk rpmi8866；hfwt，k562和ebv
‑
lcl)，或来自扩增的nk细胞的来源，所述扩增的nk细胞衍生自原代nk细胞源或nk细胞系。因为可以使用原代nk细胞，所以应当理解并且在本文中预期，所公开的对nk细胞的修饰可以离体或在体外进行。
[0068]
在nk细胞的转导之后，在向受试者施用经修饰的(即工程改造的)nk细胞之前，经修饰的nk细胞可以被扩增和刺激。例如，本文公开了向有此需要的受试者过继转移nk细胞的方法，其中在向受试者施用之前，用经辐照的表达mbil
‑
21的饲养细胞扩增nk细胞。在一些方面中，应当理解并且在本文中预期，在向受试者施用修饰的nk细胞之后或同时，修饰的(即工程改造的)nk细胞的刺激和扩增可以在体内发生。因此，本文公开了免疫治疗方法，其中在通过施用il
‑
21或经辐照的表达mbil
‑
21的饲养细胞将nk细胞转移至受试者后，在受试者中扩增nk细胞。
[0069]
已经表明，靶向tgfβ途径可以增加免疫细胞功能。靶向编码结合tgfβ的tgbr2胞外域的区域。代表性的结果显示该基因的mrna表达水平显著降低，并且进一步证明经修饰的nk细胞对tgfβ具有抗性。因此，本文公开了免疫治疗方法，其中rnp复合物靶向tgfrb2或hprt1基因。
[0070]
应当理解并且在本文中预期，所公开的经修饰的nk细胞和经修饰的nk细胞的过继转移方法可以是针对癌症的有效免疫疗法。所公开的方法和组合物可以用于治疗任何发生不受控制的细胞增殖的疾病，诸如癌症。不同类型癌症的非限制性列表如下：淋巴瘤(霍奇金氏和非霍奇金氏)、白血病、癌、实体组织癌、鳞状细胞癌、腺癌、肉瘤、神经胶质瘤、高级神经胶质瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、浆细胞瘤、组织细胞瘤、黑色素瘤、腺瘤、低氧性肿瘤、骨髓瘤、aids相关性淋巴瘤或肉瘤、转移性癌症或一般癌症。
[0071]
所公开的组合物可用于治疗的代表性但非限制性的癌症列表如下：淋巴瘤、b细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金病、髓样白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌、头颈癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌(诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、成神经细胞瘤/胶质母细胞瘤、卵巢癌、皮肤癌、肝癌、黑色素瘤、口腔鳞状细胞癌、咽喉鳞状细胞癌、喉鳞状细胞癌和肺鳞状细胞癌、宫颈癌、子宫颈癌、乳腺癌、和上皮癌、肾癌、泌尿生殖系统癌、肺癌、食道癌、头颈癌、大肠癌、造血系统癌；睾丸癌；结肠癌、直肠癌、前列腺癌或胰腺癌。因此，在一个方面中，本文公开了治疗受试者的癌症的方法，包括向受试者施用已被修饰以包含tgfbr2基因的敲除的nk细胞。
[0072]
如本文所用的“治疗(treat、treating、treatment)”及其语法变体包括以部分或完全预防、延迟、治愈(curing)、治愈(healing)、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、稳定、减缓和/或减少疾病或病症、疾病或病症的症状或疾病或病症的潜在原因中的一种或多种
的强度或频率为目的的组合物的施用。根据本发明的治疗可以预防地、预防性地、减轻性地或补救性地施用。在发病前(例如，在明显的癌症迹象之前)、在早期发病期间(例如，在癌症的最初迹象和症状时)或在确定的癌症发展之后，向受试者施用预防性治疗。预防性施用可以在感染症状出现前几天至几年进行。
[0073]
1.杂交/选择性杂交
[0074]
术语杂交通常指至少两个核酸分子(例如引物或探针和基因)之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用是指在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间以核苷酸特异性方式发生的相互作用。例如，g与c相互作用或a与t相互作用是序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用发生在核苷酸的watson
‑
crick面或hoogsteen面。两个核酸的杂交受本领域技术人员已知的多种条件和参数的影响。例如，反应的盐浓度、ph和温度都影响两个核酸分子是否将杂交。
[0075]
在两个核酸分子之间选择性杂交的参数是本领域技术人员熟知的。例如，在一些实施例中，选择性杂交条件可以被定义为严格杂交条件。例如，杂交的严格性由杂交和洗涤步骤之一或两者的温度和盐浓度控制。例如，实现选择性杂交的杂交条件可以包括在高离子强度溶液(6x ssc或6x sspe)中在低于tm(一半分子与其杂交配偶体解离的熔化温度)约12
‑
25℃的温度下杂交，随后在选择的温度和盐浓度的组合下洗涤，使得洗涤温度为低于tm约5℃至20℃。在初步实验中，温度和盐的条件很容易根据经验确定，在初步实验中，固定在过滤器上的参考dna样品与感兴趣的标记核酸杂交，并且然后在不同的严格性条件下洗涤。对于dna
‑
rna和rna
‑
rna杂交，杂交温度通常较高。该条件可以如上所述用于实现严格性，或如本领域中已知的。用于dna：dna杂交的优选的严格杂交条件可以为在6x ssc或6x sspe中在约68℃(在水溶液中)下，随后在68℃下洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格性可以随着所需的互补程度的降低而相应降低，并且此外，取决于其中寻找可变性的任何区域的g
‑
c或a
‑
t丰度。同样，如果需要，杂交和洗涤的严格性可以随着所需同源性的增加而相应地增加，并且此外，取决于其中需要高同源性的任何区域的g
‑
c或a
‑
t丰度，所有这些都是本领域已知的。
[0076]
定义选择性杂交的另一种方法是通过观察一种核酸与另一种核酸结合的量(百分比)。例如，在一些实施例中，选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限制性核酸与非限制性核酸结合时。通常，非限制性引物过量例如10倍或100倍或1000倍。这种类型的测定可以在这样的条件下进行，其中限制性引物和非限制性引物都例如比它们的kd低10倍或100倍或1000倍，或者其中只有一个核酸分子为10倍或100倍或1000倍，或者其中一个或两个核酸分子高于它们的kd。
[0077]
定义选择性杂交的另一种方法是通过观察在其中需要杂交以促进所需酶促操作的条件下被酶促操作的引物的百分比。例如，在一些实施例中，选择性杂交条件将是至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物在促进酶促操作的条件下被酶促操作时，例如如果酶操作是dna延伸，那么选择性杂交条件将是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物分子被延伸时。优选的条件还包括制造商所建议的或本领域中指出的适合于酶进行操作的条件。
[0078]
正如同源性一样，应当理解，存在本文公开的用于确定两个核酸分子之间的杂交水平的多种方法。应当理解，这些方法和条件可以在两个核酸分子之间提供不同的杂交百分比，但是除非另有说明，否则满足任何方法的参数就足够了。例如，如果需要80％的杂交，并且只要杂交在这些方法中的任何一种所需的参数内发生，就认为在本文中被公开。
[0079]
应当理解，本领域技术人员理解，如果组合物或方法满足用于确定杂交(共同地或单独地)的这些标准中的任何一个，则它都是本文公开的组合物或方法。
[0080]
2.核酸
[0081]
本文公开了多种基于核酸的分子，包括例如编码例如tgfβr2的核酸，或本文公开的用于制造tgfrβ2敲除的任何核酸，或其片段，以及多种功能性核酸。所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。本文讨论了这些和其他分子的非限制性示例。应当理解，例如，当载体在细胞中表达时，表达的mrna通常将由a、c、g和u组成。同样，应当理解的是，如果例如反义分子通过例如外源性递送被引入到细胞或细胞环境中，则有利的是反义分子由减少反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物组成。
[0082]
a)核苷酸和相关分子
[0083]
核苷酸是包含碱基部分、糖部分和磷酸部分的分子。核苷酸可以通过其磷酸部分和糖部分连接在一起，形成核苷间连接。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤
‑9‑
基(a)、胞嘧啶
‑1‑
基(c)、鸟嘌呤
‑9‑
基(g)、尿嘧啶
‑1‑
基(u)和胸腺嘧啶
‑1‑
基(t)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸部分是五价磷酸。核苷酸的非限制性示例将是3
′‑
amp(3
′‑
腺苷单磷酸)或5
′‑
gmp(5
′‑
鸟苷单磷酸)。存在在本领域中可用并且在本文中可用的这些类型的分子的多种变体。
[0084]
核苷酸类似物是包含对碱基、糖或磷酸部分进行某种类型修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰在本领域是众所周知的，并且将包括例如5
‑
甲基胞嘧啶(5
‑
me
‑
c)、5
‑
羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2
‑
氨基腺嘌呤，以及糖或磷酸部分的修饰。存在在本领域中可用并且在本文中可用的这些类型的分子的多种变体。
[0085]
核苷酸替代物是与核苷酸具有相似功能特性的分子，但不含磷酸部分，诸如肽核酸(pna)。核苷酸替代物是将以watson
‑
crick或hoogsteen方式识别核酸的分子，但它们通过除磷酸部分以外的部分连接在一起。当与适当的靶核酸相互作用时，核苷酸替代物能够符合双螺旋型结构。存在在本领域中可用并且在本文中可用的这些类型的分子的多种变体。
[0086]
也可以将其他类型的分子(缀合物)连接到核苷酸或核苷酸类似物上，以增强例如细胞摄取。缀合物可以与核苷酸或核苷酸类似物化学连接。此类缀合物包括但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分。(letsinger等人，proc.natl.acad.sci.usa，1989，86，6553
‑
6556)。存在在本领域中可用并且在本文中可用的这些类型的分子的多种变体。
[0087]
watson
‑
crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的watson
‑
crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的watson
‑
crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的c2、n1和c6位置，以及基于嘧啶的核
苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的c2、n3和c4位置。
[0088]
hoogsteen相互作用是发生在核苷酸或核苷酸类似物的hoogsteen面上的相互作用，它暴露在双链dna的主沟中。hoogsteen面包括嘌呤核苷酸的n7位置和c6位置处的反应基团(nh2或o)。
[0089]
b)序列
[0090]
存在多种与本文公开的信号传导通路中涉及的蛋白质分子相关的序列，例如tgfβr2，所有这些序列均由核酸编码或者是核酸。这些基因的人类类似物的序列，以及这些基因的其他同源物和等位基因，以及剪接变体和其他类型的变体，可在包括各种蛋白质和基因数据库(包括genbank)中获得。本领域技术人员理解如何解决序列差异和差别，以及如何将与特定序列相关的组合物和方法调整为其他相关序列。给定本文公开的信息和本领域中已知的信息，可以为任何给定的序列设计引物和/或探针。
[0091]
c)引物和探针
[0092]
公开了包括引物和探针的组合物，其能够与所公开的核酸(诸如如本文所公开的tgfβr2和/或hprt1)相互作用。在某些实施例中，引物用于支持dna扩增反应。通常，引物将能够以序列特异性的方式延伸。以序列特异性方式延伸引物包括任何方法，其中与引物杂交或以其他方式相关的核酸分子的序列和/或组成指导或影响由引物的延伸产生的产物的组成或序列。因此，引物以序列特异性方式的延伸包括但不限于pcr、dna测序、dna延伸、dna聚合、rna转录或逆转录。以序列特异性方式扩增引物的技术和条件是优选的。在某些实施例中，引物用于dna扩增反应，诸如pcr或直接测序。应当理解，在某些实施例中，引物也可以使用非酶促技术延伸，其中例如，用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰，使得它们将发生化学反应从而以序列特异性方式延伸引物。通常，所公开的引物与所公开的核酸或核酸的区域杂交，或者它们与核酸的互补序列或核酸区域的互补序列杂交。
[0093]
在某些实施例中，用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可以是支持引物的所需酶促操作的任何大小，诸如dna扩增或探针或引物的简单杂交。典型的引物或探针将是至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。
[0094]
在其他实施例中，引物或探针可以小于或等于6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。
[0095]
用于tgfβr2和hprt1基因的引物通常将用于产生扩增的dna产物，其含有tgfβr2和hprt1基因的区域或完整基因。一般来说，通常产物的大小将是使得可以精确地确定大小在
3、2或1个核苷酸内。
[0096]
在某些实施例中，该产物为至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。
[0097]
在其他实施例中，该产物为小于或等于20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1230、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000个核苷酸长。
[0098]
3.表达系统
[0099]
递送至细胞的核酸通常包含表达控制系统。例如，病毒和逆转录病毒系统中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制所需基因产物的表达。启动子通常是当在相对于转录起始位点的相对固定的位置中时起作用的dna的一个或多个序列。启动子包含rna聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可以包含上游元件和应答元件。
[0100]
a)病毒启动子和增强子
[0101]
控制来自哺乳动物宿主细胞中的载体的转录的优选的启动子可以从各种来源(例如，病毒的基因组，诸如：多瘤病毒、猿猴病毒40(sv40)、腺病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，并且最优选地巨细胞病毒)获得，或者从异源哺乳动物启动子例如β肌动蛋白启动子获得。sv40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为sv40限制性片段获得，该片段也包含sv40病毒复制起点(fiers等人，nature，273：113(1978))。人巨细胞病毒的直接早期启动子可以方便地作为hindiii e限制性片段获得(greenway，p.j.等人，gene 18：355
‑
360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子在本文中也是有用的。
[0102]
增强子通常是指在离转录起始位点没有固定距离的地方起作用的dna的序列，并且可以是转录单位的5’(laimins，l.等人，proc.natl.acad.sci.78：993(1981))或3
′
(lusky，m.l.等人，mol.cell bio.3：1108(1983))。此外，增强子可以在内含子内(banerji，j.l.等人，cell 33：729(1983))以及在编码序列本身内(osborne，t.f.等人，mol.cell bio.4：1293(1984))。它们的长度通常在10bp至300bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子的功能是增加来自附近启动子的转录。增强子通常还包含介导转录的调节的应答元件。启动子也可以包含介导转录的调节的应答元件。增强子通常决定基因的表达的调节。虽然现在从哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)中已知多个增强子序列，但通常人们将使用来自真核细胞病毒的增强子用于一般表达。优选的示例是复制起点晚期的sv40增强子(bp 100
‑
270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期的多瘤增强子和腺病毒增强子。
[0103]
启动子和/或增强子可以被光或触发其功能的特定化学事件特异性激活。系统可
以由诸如四环素和地塞米松的试剂调节。也存在通过暴露于辐射(诸如γ辐射)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达的方法。
[0104]
在某些实施例中，启动子和/或增强子区域可以充当组成型启动子和/或增强子，以使待转录的转录单位的区域的表达最大化。在某些构建体中，启动子和/或增强子区域在所有真核细胞类型中都是活性的，即使它在特定的时间仅在特定类型的细胞中表达。这种类型的优选的启动子是cmv启动子(650个碱基)。其他优选的启动子是sv40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体ltr。
[0105]
已经表明，可以克隆所有特定的调节元件，并且用于构建在特定细胞类型诸如黑色素瘤细胞中选择性地表达的表达载体。胶质原纤维乙酸蛋白(glial fibrillary acetic protein)(gfap)启动子已经被用于在胶质来源的细胞中选择性地表达基因。
[0106]
在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可以包含终止转录所必需的序列，这些序列可能影响mrna的表达。这些区域在编码组织因子蛋白的mrna的非翻译部分中被转录成聚腺苷酸化区段。3’未翻译区也包括转录终止位点。优选的是，转录单位还包含聚腺苷酸化区域。该区域的一个益处是，它增加了转录单位将像mrna一样被处理和运输的可能性。表达构建体中聚腺苷酸化信号的鉴定和使用被很好地确立。优选的是在转基因构建体中使用同源聚腺苷酸化信号。在某些转录单位中，聚腺苷酸化区域来自sv40早期聚腺苷酸化信号，并且由约400个碱基组成。同样优选的是，转录单位单独地或者与上述序列组合地包含其他标准序列，以改善构建体的表达或稳定性。
[0107]
b)标记
[0108]
病毒载体可以包括编码标记产物的核酸序列。这种标记产物用于确定基因是否已经被递送到细胞中，并且一旦被递送就被表达。优选的标记基因是编码β
‑
半乳糖苷酶的大肠杆菌lacz基因和绿色荧光蛋白。
[0109]
在一些实施例中，标记可以是可选择性标记。用于哺乳动物细胞的合适的可选择性标记的示例是二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物g418、潮霉素和嘌呤霉素。当此类可选择性标记被成功转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。存在两种广泛使用的不同类别的选择性方案。第一类别是基于细胞的新陈代谢和缺乏独立于补充培养基生长能力的突变细胞系的使用。两个示例是：cho dhfr细胞和小鼠ltk细胞。这些细胞在没有添加诸如胸苷或次黄嘌呤的营养物质的情况下缺乏生长能力。因为这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径所必需的某些基因，除非在补充的培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们无法存活。补充培养基的备选方案是将完整的dhfr或tk基因引入到缺乏相应基因的细胞中，从而改变它们的生长需求。没有用dhfr或tk基因转化的单个细胞在非补充的培养基中将不能存活。
[0110]
第二类是显性选择，其指的是在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞将表达一种传递耐药性的蛋白质，并且能在选择中存活。这样的显性选择的示例使用药物新霉素(southern p.和berg，p.，j.molec.appl.genet.1：327(1982)，霉酚酸(mulligan，r.c.和berg，p.science 209：1422(1980))或潮霉素(sugden，b.等人，mol.cell.biol.5：410
‑
413(1985))。这三个示例分别利用真核生物控制下的细菌基因来表达对适当药物g418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他包括新霉素类似物g418和嘌呤霉素。
[0111]
4.肽
[0112]
a)蛋白质变体
[0113]
蛋白质变体和衍生物是本领域技术人员熟知的，并且可以涉及氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常为三类中的一种或多种：取代、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常将是比氨基或羧基末端融合的插入更小的插入，例如，大约一至四个残基。免疫原性融合蛋白衍生物(诸如实例中所述的那些)是经由通过在体外交联或通过用编码融合蛋白的dna转化的重组细胞培养物来融合足够大的多肽以赋予靶序列免疫原性而制备的。缺失的特征是从蛋白质序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白质分子内的任何一个位点上缺失不超过约2至6个残基。这些变体通常通过对编码蛋白质的dna中的核苷酸进行位点特异性诱变来制备，从而产生编码变体的dna，并且然后在重组细胞培养物中表达该dna。用于在具有已知序列的dna中的预定位点进行取代突变的技术是众所周知的，例如m13引物诱变和pcr诱变。氨基酸取代通常是单个残基，但是可以一次在多个不同位置发生；插入通常将为约1
‑
10个氨基酸残基；并且缺失的范围将为约1至30个残基。缺失或插入优选地在相邻对中进行，即缺失2个残基或插入2个残基。取代、缺失、插入或它们的任何组合可以被组合以得到最终的构建体。突变不能将序列置于阅读框之外，并且优选地不会产生可以产生二级mrna结构的互补区域。取代的变体是指那些其中至少一个残基已经被去除并且在其位置中插入不同的残基的变体。此类取代通常根据下面的表1和表2进行，并且被称为保守取代。
[0114]
表1：氨基酸缩写
[0115][0116]
[0117]
表2：氨基酸取代
[0118]
原始残基示例性保守取代，其他在本领域中是已知的
[0119][0120]
功能或免疫特性的实质性改变通过选择比表2中的取代保守性更小的取代(即选择残基)来进行，所述残基在其维持(a)取代的区域中的多肽骨架的结构，例如如薄片或螺旋构象，(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的效果上差异显著更大。通常预期在蛋白质性质中产生最大变化的取代将是这些取代，其中(a)亲水性残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水性残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、戊酰基或丙氨酰基)(或者被疏水性残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、戊酰基或丙氨酰基)取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基(或者被任何其他残基取代)；(c)具有正电侧链的残基(例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代负电残基(诸如谷氨酰基或天冬氨酰基)(或者被负电残基(诸如谷氨酰基或天冬氨酰基)取代)；或者(d)具有大体积侧链的残基(例如苯丙氨酸)取代在这种情况下不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)(或被不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)取代)，(e)通过增加硫酸化和/或糖基化的位点的数量来取代。
[0121]
例如，一个氨基酸残基用另一个在生物学和/或化学上相似的残基替换是本领域技术人员已知的保守取代。例如，保守取代将是用一个疏水性残基替换另一个疏水性残基，或者用一个极性残基替换另一个极性残基。取代包括组合，诸如，例如gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；和phe、tyr。每个明确公开的序列的此类保守取代的变体包括在本文提供的嵌合多肽(mosaic polypeptide)中。
[0122]
取代或缺失突变可以用于插入n
‑
糖基化(asn
‑
x
‑
thr/ser)或o
‑
糖基化(ser或thr)的位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可以是期望的。潜在蛋白水解位点诸如arg的缺失或取代例如通过缺失一个碱性残基或用谷氨酰胺基或组胺酰基残基取代一个碱性残基来实现。
[0123]
某些翻译后衍生化是重组宿主细胞对表达的多肽作用的结果。谷氨酰胺基和天冬
dekker，new york，p.267(1983)；spatola，a.f.，vega data(march 1983)，vol.1，issue 3，peptide backbone modifications(general review)；morley，trends pharm sci(1980)pp.463
‑
468；hudson，d.等人，int j pept prot res 14：177
‑
185(1979)(
‑‑
ch2nh
‑‑
、ch2ch2‑‑
)；spatola等人life sci 38：1243
‑
1249(1986)(
‑‑
ch h2‑‑
s)；hann j.chem.soc perkin trans.i 307
‑
314(1982)(
‑‑
ch
‑‑
ch
‑‑
，顺式和反式)；almquist等人j.med.chem.23：1392
‑
1398(1980)(
‑‑
coch2‑‑
)；jennings
‑
white等人tetrahedron lett 23：2533(1982)(
‑‑
coch2‑‑
)；szelke等人european appln，ep 45665 ca(1982)：97：39405(1982)(
‑‑
ch(oh)ch2‑‑
)；holladay等人tetrahedron.lett 24：4401
‑
4404(1983)(
‑‑
c(oh)ch2‑‑
)；和hruby life sci 31：189
‑
199(1982)(
‑‑
ch2‑‑
s
‑‑
)中找到，其中每一篇都通过引用并入本文。特别优选的非肽键是
‑‑
ch2nh
‑‑
。应当理解，肽类似物可以在键原子之间具有多于一个的原子，诸如b
‑
丙氨酸、g
‑
氨基丁酸等。
[0131]
氨基酸类似物和类似物以及肽类似物通常具有增强的或期望的性质，诸如更经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理学性质(半衰期、吸收、效力、功效等)、改变的特异性(例如生物学活性的广谱性)、降低的抗原性等。
[0132]
d
‑
氨基酸可以用来生成更稳定的肽，因为d
‑
氨基酸不被肽酶等识别。共有序列的一个或多个氨基酸被相同类型的d
‑
氨基酸的系统取代(例如，用d
‑
赖氨酸代替l
‑
赖氨酸)可以用于生成更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于环化两个或更多个肽或者将两个或更多个肽连接在一起。这可以有利于将肽约束成特定的构象。
[0133]
5.药物载体/药物产品的递送
[0134]
如上所述，组合物也可以在药学上可接受的载体中体内施用。“药学上可接受的”是指不是生物学上或以其他方式不期望的材料，即该材料可以与核酸或载体一起施用于受试者，而不会引起任何不期望的生物学效应或以有害的方式与包含它的药物组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员将熟知的，载体将被自然选择以使活性成分的任何降解最小化并使受试者的任何副作用最小化。
[0135]
该组合物可以口服、胃肠外(例如静脉内)、通过肌肉注射、通过腹膜内注射、透皮、体外、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入施用。如本文所使用的，“局部鼻内施用”是指通过一个或两个鼻孔将组合物递送到鼻子和鼻道中，并且可以包括通过喷雾机制或液滴机制，或通过核酸或载体的气雾化来递送。通过吸入剂对组合物的施用可以通过喷雾或液滴机制经由鼻或口施用。也可以通过插管直接递送到呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需的组合物的确切量将因受试者而异，取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、所治疗的过敏性障碍的严重程度、所用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，通过本文的教导，适当的量可以由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
[0136]
该组合物的肠胃外施用(如果使用)通常以注射为特征。可注射剂可以以常规的形式制备，作为液体溶液或悬浮液，适合于在注射前将悬浮液溶解于液体中的固体形式，或者作为乳剂。最近修订的用于胃肠外施用的方法包括使用缓慢释放或持续释放系统，使得保持恒定的剂量。参见例如美国专利第3,610,795号，该专利通过引用并入本文。
[0137]
材料可以是溶液、悬浮液(例如，掺入到微粒、脂质体或细胞中)。它们可以通过抗体、受体或受体配体被靶向特定的细胞类型。以下参考文献是使用该技术以将特定蛋白质
靶向肿瘤组织的示例(senter等人，bioconjugate chem.，2：447
‑
451，(1991)；bagshawe，k.d.，br.j.cancer，60：275
‑
281，(1989)；bagshawe等人，br.j.cancer，58：700
‑
703，(1988)；senter等人，bioconjugate chem.，4：3
‑
9，(1993)；battelli等人，cancer immunol.immunother.，35：421
‑
425，(1992)；pietersz和mckenzie，immunolog.reviews，129：57
‑
80，(1992)；和roffler人，biochem.pharmacol，42：2062
‑
2065，(1991))。载体诸如“stealth”和其他抗体缀合的脂质体(包括脂质介导的靶向结肠癌的药物)、通过细胞特异性配体的受体介导的dna靶向、淋巴细胞导向的肿瘤靶向以及体内小鼠胶质瘤细胞的高特异性治疗性逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术以将特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(hughes等人，cancer research，49：6214
‑
6220，(1989)；和litzinger和huang，biochimica et biophysica acta，1104：179
‑
187，(1992))。一般而言，受体参与组成型或配体诱导的内吞途径。这些受体聚集在网格蛋白包被的凹坑中，通过网格蛋白包被的囊泡进入细胞，通过酸化的内泌体，受体在内泌体中被分选，并且然后再循环到细胞表面，变成在细胞内储存，或者在溶酶体中被降解。内化途径具有多种功能，诸如营养吸收、活化蛋白的去除、大分子的清除、病毒和毒素的机会性进入、配体的解离和降解以及受体水平的调节。根据细胞类型、受体浓度、配体的类型、配体化合价和配体浓度，多个受体遵循多于一种的细胞内途径。已经综述了受体介导的胞吞作用的分子和细胞机制(brown和greene，dna and cell biology 10：6，399
‑
409(1991))。
[0138]
c.实例
[0139]
提出以下实施例是以便向本领域普通技术人员提供本文所要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法如何制备和评价的完整公开和描述，并且旨在纯粹是示例性的而不是旨在限制本公开。已经努力确保关于数字(例如数量、温度等)的准确性，但应考虑一些误差和偏差。除非另有说明，否则份数均为重量份，温度以℃计或处于环境温度，并且压力为大气压力或接近大气压力。
[0140]
1.实例1
[0141]
a)方法
[0142]
(1)人nk细胞的纯化和扩增
[0143]
从central ohio region american red cross获得健康的供体血沉棕黄层作为来源材料。本研究被institutional review board ofnationwide children’s hospital确定为豁免研究。
[0144]
从血沉棕黄层中分离pbmc。简言之，将35ml的血沉棕黄层样品铺在15ml的ficol
‑
paque上。在不制动的情况下以400x g离心20分钟。回收的pbmc用pbs洗涤三次。nk细胞可以在该阶段通过rosettessep进行分离。
[0145]
通过在第0、7和14天用经辐照的10
×
106的表达mbil21的饲养细胞刺激来扩增nk细胞。每隔一天用含有10％的fbs、1％的谷氨酰胺、1％的青霉素链霉素和100iu/ml的il
‑
2的新鲜aimv或rpmi培养基更换整个培养基体积的培养基。
[0146]
(2)grna设计和选择
[0147]
使用在线工具(例如，ncbi，ensemble)选择要靶向的特定基因组位点。例如，使用转化生长因子β受体2(tgfbrr2)胞外域。查看记录：pf08917；查看interpro：ipr015013；位置：49
‑
157aa。目标序列：tgfbr2基因的外显子4(ensg00000163513)。
[0148]
为了设计grna，使用crispr设计网络工具，诸如http：//crispr.mit.edu和
‘
benchling.com’。输入在步骤2.1中选择的dna序列。选择人类(hg 19)作为靶基因组。crispr导向(20个核苷酸之后是pam序列：ngg)是从前面输入的序列扫描的。它还示出了在整个选定的基因组中可能的脱靶匹配。根据其靶向率和脱靶率，选择具有最高得分的最佳的三个grna。
[0149]
表1示出了通过crispr设计网络工具指示的靶向tgfbr2基因的外显子4的设计的crispr rna。
[0150]
表1.靶向tgfbr2胞外域的外显子4的作为合成的crrna的三种设计的grna。
[0151][0152][0153]
将crispr rna作为合成的序列特异性crrna排序，并且排序保守的反式激活rna(tracrrna)，以与crrna通过部分同源性进行相互作用。
[0154]
(3)设计缺失筛选引物
[0155]
设计跨越grna切割位点的引物，用于t7e1突变测定。使用距离预测的切割位点至少100bp的引物，以确保在突变测定后在1.5％琼脂糖凝胶上出现sgrna靶位点的小插入
‑
缺失(indel)。表2示出了用于扩增tgfbr2胞外域的引物。
[0156]
表2.用于扩增tgfbr2胞外域基因的引物
[0157][0158]
(4)人原代nk细胞和扩增的nk细胞的转导
[0159]
cas9/rnp元件向nk的转导通过电穿孔使用4d
‑
核转染系统如下进行：
[0160]
(5)细胞制备
[0161]
对于原代nk细胞，在存在100iu/ml的il
‑
2的情况下在rpmi或aimv培养基中培养新鲜分离的nk细胞4天，并且在第5天进行电穿孔(如前所述和转导前一天，每隔一天更换培养基)。这可以针对扩增的nk细胞进行修改。对于扩增的nk细胞，在第0天以1∶1的比率用经辐照的饲养细胞刺激细胞，并且在第5、6或7天进行电穿孔。(如前所述和转导前一天，每隔一天更换培养基)。在电穿孔当天，为经历电穿孔的细胞准备一个装有8ml新鲜rpmi(包含100iu/ml的il
‑
2)的t25烧瓶，并且在加湿的37℃/5％的co2培养箱中预培养烧瓶。解冻的细胞或已经经历第2次或第3次刺激的细胞可以在其回收后随时被电穿孔，如所描述的。对于
26μl的转导混合物，每种条件取3
‑4×
106个细胞，因为nucleofector溶液中的nk细胞的非常高的浓度提高了转导率。可以用pbs洗涤细胞3次，以去除所有的fbs，fbs通常含有rnase活性。每次以300g旋转它们8分钟。将cas/rnp的7种电穿孔条件视为单一grna(grna1、grna2、grna3)以及两种grna(grna1 grna2、grna1 grna3、grna2 grna3)的组合和一种不含cas9/rnp的对照。
[0162]
(6)形成crrna：tracerrna/复合物
[0163]
将crrna(grna1、grna2和grna3)和tracerrna重新悬浮在1x te溶液中，至200μm的最终浓度。将2.2μl的各200μm的grna与200μm的tracerrna混合，如表3所示。将样品在95℃下加热5min，并且允许在台面上冷却至室温(15
‑
25℃)。将重新悬浮的rna和crrna：tracer rna/复合物储存在
‑
20℃下，用于随后使用。
[0164]
表3.使用200μm的rna形成crrna：tracerrna/复合物
[0165]
组分量(ul)200μm crrna2.2200μm tracer rna2.2idte缓冲液5.6最终产物10
[0166]
(7)形成rnp复合物
[0167]
为节省时间，在洗涤步骤期间形成rnp复合物。对于单个crrna：tracrrna双链体反应，将cas9核酸内切酶稀释至36μm，如表4所示。
[0168]
表4.对于单个crrna：tracrrna双链体反应，将cas9核酸内切酶稀释至36μm。
[0169][0170]
对于crrna：tracrrna双链体的组合转导，将cas9核酸内切酶稀释至36μm，如表5所示。
[0171]
表5.对于crrna：tracrrna双链体的组合转导，将cas9核酸内切酶稀释至36μm。
[0172]
组分量(μl)pbs1crrna：tracrrna双链体(例如，grna1)1(100pmol)crrna：tracrrna双链体(例如，grna2)1(100pmol)alt
‑
r cas9核酸内切酶2总体积5μl
[0173]
在30s至1分钟内向crrna：tracrrna双链体中缓慢地加入cas9核酸内切酶，同时旋转移液器吸头。将混合物在室温下孵育15
‑
20min。如果在孵育后未准备好使用混合物，请将混合物保持在冰上直到使用。
[0174]
(8)电穿孔
[0175]
将整个补充液加入到nucleofector溶液p3中，并将其保持在室温下。将细胞沉淀(3
‑4×
106个细胞)重新悬浮在20μl的p3原代4d nucleofector溶液中。在吸液时避免气泡。细胞不应在p3溶液中长时间放置。立即向细胞悬液中加入5μl的rnp复合物。向cas9/rnp/细胞混合物中加入1μl的100μm的cas9电穿孔增强剂。将cas9/rnp/细胞混合物转移到20μl的nucleocuvette条带中。轻轻敲击nucleocuvette条带，以确保样品覆盖条带的底部。启动4d
‑
nucleofector系统并选择en
‑
138程序。
[0176]
(9)转导后
[0177]
将细胞以条带静置3分钟。向比色皿中加入80μl预平衡的培养基，并将样品轻轻地移入到烧瓶中。转导后48小时，从5
×
105个细胞中提取基因组dna用于基因缺失筛查。使用步骤3.2中设计的引物，使用taq dna聚合酶试剂盒扩增目标基因。形成用于t7ei消化的pcr扩增子异源双链体，并将产物与t7ei酶在37℃下孵育30
‑
60分钟。t7ei测定对于筛选是优选的，因为与使用surveyor测定相比，它快速、简单，并提供干净的电泳结果。然而，这种方法不能检测cas9 rnp实验中由非同源末端连接(nhej)活性产生的≤2个碱基的插入和缺失。
[0178]
在110v在1.5％琼脂糖凝胶上运行消化的dna持续30
‑
45分钟，每15分钟观察凝胶。以1∶1的比率用表达mbil21的饲养细胞刺激其余细胞。刺激后5天，使用qpcr提取基因表达水平的rna。
[0179]
如之前所报告的进行钙黄绿素测定。简言之，用钙黄绿素am加载靶细胞(在所示的实例中，使用3μg/ml/1,000,000daoy细胞)。通过在il2(100iu/ml)加上或减去10ng/ml的可溶性tgfβ中静置过夜，制备用于细胞毒性测定的nk细胞。在与nk细胞静置过夜相同的细胞因子中进行钙黄绿素测定。
[0180]
b)结果：
[0181]
(1)电穿孔效率：
[0182]
为了优化cas9/rnp电穿孔的4d
‑
nucleofector，对gfp非靶向sirna和dna质粒转导到nk细胞中的16种不同程序进行了测试。流式细胞术测定表明，对于两种颗粒，en
‑
138具有最高的细胞存活率和转导效率百分比(35％活gfp阳性细胞)。(图1和图2)。有趣的是，使用该程序进行cas9/rnp电穿孔的效率更高，因为观察到tgfbr2 mrna表达水平降低60％(图5)。
[0183]
(2)突变测定
[0184]
含有grna2、grna1 grna2和grna3的cas9/rnp具有成功的tgfbr2胞外域基因敲除，但仅grna1未产生任何t7e1可检测插入缺失(indel)(图3)。此外，图4显示使用商业提供的grna在扩增的人nk细胞中成功地敲除人hprt1(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1)。
[0185]
(3)基因表达水平测定
[0186]
作为结果的代表，图5示出了通过rt
‑
pcr分析的cas9/rnp(grna1 grna2)对tgfbr2胞外域的mrna生成水平的影响。如图所示，靶向的基因的mrna表达水平显著降低。
[0187]
(4)细胞毒性
[0188]
如图6所示，在将grna1 grna2、grna2和grna3 cas9/rnp修饰的细胞与tgfb(与daoy细胞共培养)一起孵育后，与对照组(在培养基中具有il
‑
2过夜)相比，修饰的细胞没有显示出其细胞毒性水平的任何显著降低。该结果表明，在存在tgfb的情况下，cas9/rnp修饰
的细胞保持其细胞毒性功能，并且表明修饰的细胞变得tgfb抗性。
[0189]
(5)rnaseq分析
[0190]
在原始的nk细胞和扩增的nk细胞中进行的rnaseq分析突出了il
‑
21扩增的nk细胞中活跃的dna修复和复制机制。这表明，使用cas9/rnp系统，扩增的nk细胞可以更开放地进行基因操作。
[0191]
c)讨论：
[0192]
cas9介导的基因组工程改造彻底改变了实验和临床医学。在t细胞中使用该技术是成功的，但是nk细胞的dna依赖性修饰一直具有挑战性。在crispr/cas9系统中，携带sgrna的编码序列的dna载体被置于u6或h1启动子的控制之下，因为产生的转录过程是必需的，也是不希望的。由于大量与程序相关的nk细胞凋亡，这限制了基因工程改造的nk细胞的有效生产，dna依赖性转基因递送诸如慢病毒和逆转录病毒转染很差。
[0193]
因此，合成上预形成的核糖核蛋白(rnp)复合物和cas9蛋白作为纯化的蛋白被引入到原代nk细胞和扩增的nk细胞中。
[0194]
该方法允许消除由rna聚合酶ii启动的封端、拖尾和其他转录和翻译过程，这些过程可以导致大量与程序相关的nk细胞凋亡，这被认为发生在dna依赖性转导方法中。此外，本文报道的方法使用纯化的cas9蛋白，增加了靶向效应并减少了脱靶影响，因为cas9/rnp在电穿孔后立即活跃并且也快速降解，为当前的方案提供了改进。
[0195]
总之，cas9/rnp可以用于利用上述方法对人类原代nk细胞和扩增的nk细胞进行基因修饰，以用于癌症免疫疗法。结果还表明，tgfbr2胞外域基因的成功敲除导致这些修饰的nk细胞变得tgfb抗性。
[0196]
将rnp递送与模板dna的来源(诸如天然重组腺相关病毒(aav)供体载体)相结合，可以通过同源重组来实现位点特异性基因插入。
[0197]
2.实例2：细胞因子信号传导抑制剂3(socs3)
[0198]
对nk细胞进行基因修饰以增强癌症免疫疗法在治疗多种癌症方面具有应用。最近，开发了一种新策略，其中通过电穿孔将crispr/cas9元件作为核糖核蛋白(rnp)引入到nk细胞中，随后在表达4
‑
1bbl和膜结合的il
‑
21的饲养细胞上扩增，以产生大量经基因修饰的nk细胞。该方法用于对原代nk细胞和扩增的nk细胞中的若干种基因进行基因修饰，包括细胞因子信号转导抑制因子3(socs3)。socs3通过jak/stat途径负调控细胞因子信号传导。假设使用cas9/rnp破坏原代nk细胞中的socs3可以维持stat3信号转导水平，并且随后增加其增殖和细胞毒性功能。
[0199]
设计grna以靶向socs3基因的外显子2(图7)，并使用lonza 4d电穿孔仪将其与cas9蛋白一起作为cas9/rnp电穿孔到原代nk细胞中。单独或组合地测试了六种不同条件的grna。在没有cas9/rnp的情况下，对对照组中的nk细胞电穿孔。在电穿孔后，细胞在补充有100iu的人il
‑
2的培养基中静置48小时，并且然后使用经辐照的饲养细胞扩增。在第7天，用经辐照的饲养细胞重新刺激相同数量的细胞，以测试socs3 ko对增殖的影响。蛋白质印迹用于在蛋白水平测定敲除功效。进行钙黄绿素测定和incucyte zoom(essen)以测定针对两种癌细胞系k562和daoy的细胞毒性。
[0200]
结果显示，与对照组相比，在3种条件(grna1、grna3和grna1 grna3)下，socs3蛋白水平的显著降低。socs3的相对归一化表达式在图8中示出。钙黄绿素测定和incucyte zoom
显示，与aml和daoy癌细胞系中的对照相比，修饰的socs3 ko nk细胞可以更有效地杀死肿瘤(图9a、9b、9c和9d)。grna 1(g1)显示阴性对照(nc)的两倍杀伤。特别是，nc在10∶1时显示80％的杀伤，而g1在5∶1时显示80％的杀伤(图9b和9d)。在socs3敲除中，神经母细胞瘤细胞并未以更快的速度被杀伤(图9c和9d)。增殖数据显示，socs3 ko细胞可以比对照组生长更快(图10)。
[0201]
总之，数据证明了socs3和jak/stat通路在nk细胞功能中的作用，并表明socs3是用于基因修饰以改善使用nk细胞的癌症免疫疗法的良好靶。
[0202]
3.实例3：产生cd38
‑
ko nk细胞以克服自相残杀并增强adcc
[0203]
自然杀伤细胞在通过抗cd38单克隆抗体达雷木单抗(dara)靶向表达cd38的多发性骨髓瘤(mm)中发挥重要作用。为了克服在dara疗法中nk细胞的自相残杀，使用cas9/rnp产生敲除nk细胞。离体扩增的自体敲除nk细胞与dara的联合疗法显示dara诱导的肿瘤细胞杀伤的显著改善(图11和12)。
[0204]
4.实例4：aavs1
[0205]
该方法用于靶向aavs1基因作为安全港，以被用作任何目标基因(包括car和报告基因)整合到原代nk细胞的基因组中的整合位点。
[0206]
ice(crispr编辑的干扰)显示使用cas9/rnp靶向目标基因的高效率。靶向aavs1不会改变原代nk细胞的细胞毒性效应(图13)。
[0207]
使用的grna：ggggccactagggacaggat(seq id no：9)
[0208]
5.实例5：产生mcherry阳性原代nk细胞，作为使用cas9/rnp供体的car
‑
nk生产的概念证明
[0209]
使用该方法产生了表达mcherry的人原代nk细胞。此外，这些修饰的原代nk细胞通过用经辐照的表达mbil21的饲养细胞刺激而扩增，并证实了报告基因的稳定表达(图14、15和16)。这证实了原代car
‑
nk细胞和扩增的car
‑
nk细胞的产生。
[0210]
使用的grna：ggggccactagggacaggat(seq id no：9)
[0211]
6.实例6：测试脱靶效应
[0212]
为了鉴定在nk细胞中使用cas9/rnp后的脱靶效应，对正常nk细胞和修饰的nk细胞(cd38
‑
ko)进行全基因组测序。根据用于预测候选基因的算法，wgs显示无脱靶或非常低的脱靶(2个基因)。
[0213]
针对用于靶向cd
‑
38的grna研究了由benching.com生成的脱靶候选基因的列表。(5
’‑
ctgaactcgcagttggccat
‑3’
(seq id no：11))，并且未揭示任何脱靶。(脱靶候选基因的列表如表6所示)
[0214]
表6
[0215]
[0216]
[0217]
[0218][0219]
脱靶分析：
[0220]
d.参考文献
[0221]
alici，e.，sutlu，t.&sirac dilber，m.retroviral gene transfer into primary human natural killer cells.methods mol biol.506127
‑
137，doi：10.1007/978
‑1‑
59745
‑
409
‑
4_10，(2009).
[0222]
carlsten，m.&childs，r.w.genetic manipulation of nk cells for cancer immunotherapy：techniques and clinical implications.front immunol.6266，doi：10.3389/fimmu.2015.00266，(2015).
[0223]
chmielecki，j.et al.genomic profiling of a large set of diverse pediatric cancers identifies known and novel mutations across tumor spectra.cancer res.77(2)，509
‑
519，doi：10.1158/0008
‑
5472.can
‑
16
‑
1106.(2017).
[0224]
dewitt，m.a.，corn，j.e.&carroll，d.genome editing via delivery of cas9ribonucleoprotein.methods.121
‑
122 9
‑
15，(2017).
[0225]
eyquem，j.et al.targeting a car to the trac locus with crispr/cas9 enhances tumour rejection.nature.543(7643)，113
‑
117，doi：10.1038/nature21405，(2017).
[0226]
guven，h.et al.efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction.exp hematol.33(11)，1320
‑
1328，doi：
10.1016/j.exphem.2005.07.006，(2005).
[0227]
kim，s.，kim，d.，cho，s.w.，kim，j.&kim，j.s.highly efficient rna
‑
guided genome editing in human cells via delivery of purified cas9 ribonucleoproteins.genome res.24(6)，1012
‑
1019，doi：10.1101/gr.171322.113，(2014).
[0228]
lee，d.a.，verneris，m.r.&campana，d.acquisition，preparation，and functional assessment of human nk cells for adoptive immunothcrapy.methods mol biol.651 61
‑
77，doi：10.1007/978
‑1‑
60761
‑
786
‑
0_4，(2010).
[0229]
liang，x.et al.rapid and highly efficient mammalian cell engineering via cas9 protein transfection.j biotechnol.20844
‑
53，doi：10.1016/j.jbiotec.2015.04.024，(2015).
[0230]
liang，z.et al.efficient dna
‑
free genome editing of bread wheat using crispr/cas9ribonucleoprotein complexes.nat commun.814261，doi：10.1038/ncomms14261，(2017).
[0231]
mehta，r.s.&rezvani，k.chimeric antigen receptor expressing natural killer cells for the immunotherapy of cancer.front immunol.9283，doi：10.3389/fimmu.2018.00283，(2018).
[0232]
rezvani，k.，rouce，r.，liu，e.&shpall，e.engineering natural killer cells for cancer immunotherapy.mol ther.25(8)，1769
‑
1781，doi：10.1016/j.ymthe.2017.06.012，(2017)
[0233]
schultz，l.m.，majzner，r.，davis，k.l.&mackall，c.new developments in immunotherapy for pediatric solid tumors.curr opin pediatr.30(1)，30
‑
39，doi：10.1097/mop.0000000000000564，(2018).
[0234]
somanchi，s.s.，senyukov，v.v.，dehman，c.j.&lee，d.a.expansion，purification，and functional assessment of human peripheral blood nk cells.j vis exp.(48)，doi：10.3791/2540.(2011).
[0235]
sutlu，t.et al.inhibition of intracellular antiviral defensc mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells：implications for gene thcrapy.hum gene ther.23(10)，1090
‑
1100，doi：10.1089/hum.2012.080，(2012).
[0236]
viel，s.et al.tgf
‑
beta inhibits the activation and functiohs of nk cells by repressing the mtor pathway.sci signal.9(415)，ra19，doi：10.1126/scisignal.aad1884，(2016).
[0237]
vouillot，l.，thelie，a.&pollet，n.comparison of t7e1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.g3(bethesda).5(3)，407
‑
415，doi：10.1534/g3.114.015834，(2015).
[0238]
wang，m.et al.efficient delivery of genome
‑
editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles.proc natl acad sci u sa.113(11)，2868
‑
2873，doi：10.1073/pnas.1520244113，(2016).
[0239]
zuris，j.a.et al.cationic lipid
‑
mediated delivery of proteins enables efficient protein
‑
based genome editing in vitro and in vivo.nat biotechnol.33(1)，73
‑
80，doi：10.1038/nbt.3081，(2015).