hsa-miR-1204在制备辅助诊断年龄相关AAD的试剂中的应用及检测试剂盒

hsa-mir-1204在制备辅助诊断年龄相关aad的试剂中的应用及检测试剂盒
技术领域
1.本发明属于疾病诊断技术领域，具体涉及hsa-mir-1204在制备辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤的试剂中的应用及检测试剂盒。


背景技术：

2.主动脉夹层动脉瘤(aortic aneurysm and dissection,aad)是指各种病因导致的主动脉内膜和中层弹力膜撕裂，局部主动脉壁扩张或膨出造成的严重主动脉疾病，在临床上具有自然病程进展快，病情凶险，预后不良等特点。主动脉夹层动脉瘤患者在发病前多无明显症状和体征，发病时在心电图、x线胸片等检查中亦缺乏特异性，结合临床症状易被误诊为心绞痛，心肌梗死等，而ct、mri、主动脉造影虽能明确诊断,但费用高昂,操作复杂,适用受限。因此，对于主动脉夹层动脉瘤患者的预测和早期诊断是一个亟待解决的问题。
3.微小rna(microrna)是一类长度在19-24个核苷酸的非编码小分子rna，主要通过与靶基因3'非翻译区结合来调控基因表达，影响个体发育、细胞增殖等生命活动过程。血浆中microrna含量丰富，目前已被证实对心血管疾病的发生发展具有重要的影响作用。由于血浆microrna具有性质稳定，易于检测等特点，将其应用于主动脉夹层动脉瘤等心血管疾病的预测、早期诊断和个性化治疗均大有益处。然而，目前还未有关于用于诊断与年龄相关主动脉夹层动脉瘤的microrna的研究报道。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种hsa-mir-1204在辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤中的应用。
5.本发明提供了hsa-mir-1204作为分子标志物在制备辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤的试剂中的应用。
6.优选的，所述hsa-mir-1204的核苷酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明提供了检测hsa-mir-1204表达量的试剂在制备辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤的试剂盒中的应用。
8.优选的，所述诊断基于qrt-pcr技术时，所述试剂包括正向引物和反应引物；
9.所述正向引物的核苷酸序列如seq id no:3所示；
10.所述反向引物的核苷酸序列如seq id no:4所示。
11.优选的，所述hsa-mir-1204表达量过高提示样本患有主动脉夹层动脉瘤的风险。
12.优选的，所述hsa-mir-1204表达量过高的判断标准为-δδcq值；
13.优选的，所述试剂包括颈环法反转录引物；
14.所述颈环法反转录引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。
15.本发明提供了一种基于qrt-pcr技术辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤的试剂盒，包括正向引物和反向引物；
mirna qrt-pcr starter kit(c10211-2)试剂盒。
28.在本发明中，所述试剂优选包括颈环法反转录引物。所述颈环法反转录引物的核苷酸序列如seq id no:2所示。反转录优选包括反转录试剂。在本发明实施例中，所述反转录试剂优选采用“锐博”公司的bulge-looptm mirna qrt-pcr starter kit(c10211-2)试剂盒进行反转录。
29.在本发明中，所述试剂优选还包括提取血浆及组织microrna的试剂。在本发明实施例中，所述血浆microrna的试剂优选“qiagen”公司的mirneasy serum/plasma kit(217184)提取血浆microrna。
30.在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选如下：
31.提取样本中hsa-mir-1204；
32.将所述hsa-mir-1204进行反转录，得到cdna；
33.将所述cdna进行qrt-pcr检测，得到-δδcq值；
34.当-δδcq值较高时，提示样本可能患有主动脉夹层动脉瘤。
35.在本发明中，所述样本为年长者(》50岁)血浆时；年长者(》50岁)血浆hsa-mir-1204表达过高提示患有主动脉夹层动脉瘤风险，当样本来源于年轻人(《50岁)血浆时，hsa-mir-1204表达过高亦有预测价值。其中hsa-mir-1204表达过高是指与健康人相比，hsa-mir-1204表达量显著升高。
36.本发明提供了一种基于qrt-pcr技术辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤的试剂盒，优选包括正向引物和反向引物。所述正向引物的核苷酸序列优选如seq id no:3所示；所述反向引物的核苷酸序列优选如seq id no:4所示。
37.在本发明中，所述试剂盒优选包括qpcr检测用试剂和反转录试剂。所述反转录试剂优选包括颈环法反转录引物；所述颈环法反转录引物的核苷酸序列如seq id no:2(5
’‑
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacataatgga-3’)所示。
38.在本发明中，所述试剂盒的使用方法同上，在此不做赘述。
39.下面结合实施例对本发明提供的hsa-mir-1204在制备辅助诊断年龄相关主动脉夹层动脉瘤的试剂中的应用及检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
40.实施例1
41.利用microrna微阵列技术分析年长夹层患者与正常年长志愿者血浆micrornas表达谱变化
42.分别取正常年长者(大于等于50岁健康人)，病人年长者(大于等于50岁患主动脉夹层动脉瘤的患者)2组血浆样本(病人血浆样本来源于中山大学附属第一医院心脏外科2014年至今住院的主动脉夹层动脉瘤患者，正常人血浆样本来源于招募的志愿者)各3例，按如下方法提取血浆rna。
43.(1)取250μl血浆样本至1.5ml离心管中，加入750μl的trizol ls reagent试剂，震荡混匀。
44.(2)匀浆后样品室温孵育5分钟，再加入200μl氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震荡15s后，室温静置2～3分钟，4℃下12000
×
g离心15分钟。
45.(3)离心后混合液体分为上、中、下三层。取上层无色水相层，转移到新离心管中，
并加入500μl异丙醇，混匀后室温孵育10分钟，于4℃下12000
×
g离心10分钟。
46.(4)移去上清液，加入1ml 75％乙醇，清洗rna沉淀。震荡后，4℃下7500
×
g离心5分钟。
47.(5)去除乙醇溶液，空气中干燥rna沉淀5-10分钟，加入无rna酶水反复吹打，55-60℃下孵育10分钟。提取的rna溶液保存于-80℃。
48.将提取的rna进行microrna微阵列芯片分析，结果见图1。由图1可见hsa-mir-1204在年长主动脉夹层动脉瘤患者血浆样本中表达上调。所述hsa-mir-1204的序列为5'-ucguggccuggucuccauuau-3'(seq id no:1)。
49.实施例2
50.利用qrt-pcr技术验证芯片分析结果
51.分别取正常年长者(大于等于50岁健康人)，病人年长者(大于等于50岁患主动脉夹层动脉瘤的患者)2组血浆样本各20例，采血后提取血浆microrna(采用“qiagen”公司的mirneasy serum/plasma kit(217184)提取血浆microrna)。
52.将提取的rna进行反转录获得cdna，颈环法反转录引物的序列如5
’‑
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacataatgga-3’(seq id no:2)，采用“锐博”公司的bulge-looptm mirna qrt-pcr starter kit(c10211-2)试剂盒进行反转录，反应程序如下：42℃60min；70℃10min。反应体系见表1。
53.表1逆转录反应体系
[0054][0055]
将合成的cdna作为模板进行qrt-pcr检测，其中采用的qpcr引物序列:
[0056]
正向引物：5'-gccgagtcgtggcctggtctcc-3'(seq id no:3)；反向引物：5'-gtcgtatccagtgcagggtccg-3'(seq id no:4)。
[0057]
用“锐博”公司的bulge-looptm mirna qrt-pcr starter kit(c10211-2)试剂盒进行荧光定量检测，具体检测程序如下：95℃10min；95℃2sec，60℃20sec，70℃10sec，40个循环；绘制溶解曲线，最终数据以
‑△△
cq进行分析。反应体系见表2。
[0058]
表2实时荧光定量pcr反应体系
[0059][0060]
其中δcq＝cq样本
–
cq外参(cel-mir-39)，
‑△△
cq数值越大表明mirna的表达水平越高，
‑△△
cq数值越小表明mirna的表达水平越低。
[0061]
如图2所示。经spss分析，hsa-mir-1204在年长主动脉夹层动脉瘤患者和年长正常人血浆样本中表达存在显著差异(p《0.01)。
[0062]
实施例3
[0063]
利用qrt-pcr技术检测受检者血浆中hsa-mir-1204表达水平
[0064]
分别募集正常年轻人(小于50岁健康人，70人)，正常年长者(大于等于50岁健康人，88人)，病人年轻人(小于50岁患主动脉夹层动脉瘤的患者，116人)，病人年长者(大于等于50岁患主动脉夹层动脉瘤的患者，156人)4组共430人组成测试队列，以正常年轻组作为对照，采血后提取血浆microrna(采用“qiagen”公司的mirneasy serum/plasma kit(217184)提取血浆microrna)。
[0065]
将提取的rna进行反转录获得cdna，颈环法反转录引物序列(5'-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacataatgga-3'，seq id no:5)，采用“锐博”公司的bulge-looptm mirna qrt-pcr starter kit(c10211-2)试剂盒进行。反应程序如下：42℃60min；70℃10min。反应体系见表1。
[0066]
将合成的cdna作为模板进行qrt-pcr检测，其中采用的qpcr引物序列：
[0067]
正向引物：5'-gccgagtcgtggcctggtctcc-3'(seq id no:3)；
[0068]
反向引物：5'-gtcgtatccagtgcagggtccg-3'(seq id no:4)；
[0069]
采用“锐博”公司的bulge-looptm mirna qrt-pcr starter kit(c10211-2)试剂盒进行荧光定量检测，检测反应程序如下：95℃10min；95℃2sec，60℃20sec，70℃10sec，40cycles；绘制溶解曲线，最终数据以
‑△△
cq进行分析。反应体系见表2。
[0070]
其中δcq＝cq样本
–
cq外参(cel-mir-39)，
‑△△
cq数值越大表明mirna的表达水平越高，
‑△△
cq数值越小表明mirna的表达水平越低。
[0071]
结果如图3所示。经spss分析，hsa-mir-1204在年长主动脉夹层动脉瘤患者和年长正常人血浆样本中表达存在显著差异(p《0.001)，hsa-mir-1204在年轻主动脉夹层动脉瘤患者血浆样本中表达亦有升高(p《0.01)。
[0072]
由上述实施例可知，hsa-mir-1204在主动脉夹层动脉瘤血浆样本中表达存在差异，可以作为年龄相关主动脉夹层动脉瘤的检测分子标记。
[0073]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。